正常人与肠外营养大鼠肠粘膜通透性测量方法的建立
作者：王文涛 刘跃武 蒋朱明 徐艳英 白满喜 潘华珍 王正茂
单位：010059 呼和浩特，内蒙古医学院附属第一医院普通外科(王文涛、王正茂)；中国医学科学院 北京协和医院普通外科(刘跃武、蒋朱明、白满喜)；中国医学科学院基础医学研究所(徐艳英、潘华珍)
关键词：
中华医学杂志970926 在正常和肠外营养的情况下,作者采用带电化学检测器的高效液相技术测量甘露醇(Lactulose)、乳果糖(Mannitol)在尿中的含量，探讨建立一种临床可能实用的测量肠粘膜通透性的方法，并观察肠外营养时肠粘膜通透性的变化。
一、资料和方法
1.正常人实验：20名成年健康志愿中国人，男、女各10名；禁食18小时(可适量饮水)，空腹测量。在口服60ml溶液(含10g乳果糖和5g甘露醇)后，收集6小时内的全部尿液，测量尿液总量，取其中20ml用硫柳汞作防腐处理后在-20℃冷藏待检。
, 百拇医药
2.动物实验：Wistar大鼠20只，行中心静脉插管，给予标准肠外营养输液。用乳果糖和甘露醇溶液于实验的第3、7天经口给大鼠灌胃。灌注2ml溶液(含乳果糖100mg，甘露醇50mg)。收集并记录24小时尿量。取20ml尿加4mg硫柳汞于-20℃保存待检。
3.仪器、试剂：带电化学检测器的高效液相离子色谱仪(HPLCPED，DIONEX)，测量电极为金电极，分离柱为Dionex HPLC-AS6阴离子柱(250×40mm)。甘露醇、乳果糖均为美国Sigma公司产品，NaOH纯度为98%。
4.高效液相(HPLC-PED)分析：(1) 标本预处理：取待检尿样5ml，离心10分钟(5 000r/min)。取上清液，用煮沸醋酸法去除蛋白。取上清液2ml过阴阳离子树脂柱，滤液再过0.22μm滤器。(2) HPLC分析：取预处理之滤液注射到色谱柱上。色谱条件为：0.1mol/L NaOH以1ml/min的速度淋洗。测量电压为：电极电压+0.5V，氧化电极电压+0.6V，还原电极电压-0.95V。
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5.定量分析：色谱图形由自动积分仪描记，测得面积，甘露醇及乳果糖浓度用标准曲线公式算出。
6.标准液配制及标准曲线的制作：(1) 标准液配制：用去离子水将甘露醇、乳果糖配制成标准液，等比稀释标准液，上机行HPLC分析，测定得出面积。
(2) 标准曲线的制作：将测得面积与已知浓度在Macintosh LC个人电脑上用统计软件Stat View Ⅱ行回归分析，自动作出标准曲线并得出公式。
7.统计学处理：统计分析在Macintosh LC个人电脑上用统计软件Stat View Ⅱ进行。结果用
±
表示。
二、结果
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1.标准曲线：甘露醇标准曲线公式为：Y=2.73×10-4X+3.60，其中X为面积，Y为浓度(下同)。乳果糖标准曲线公式为：Y=0.24×10-4X+0.22。
2.健康成人：乳果糖排出率与甘露醇排出率之比(L/M)为：0.020%±0.0016%；
3.肠外营养大鼠营养支持3天时L/M：0.024%±0.003%；大鼠营养支持7天时L/M：0.042%±0.005%。
4.乳果糖与甘露醇的回收率为：94.3%～101.9%(10只鼠)；乳果糖和甘露醇的变异系数为2.3%～5.4%(10只鼠)。
三、讨论
肠粘膜的通透性增高是肠屏障功能受损害的一个指标[1]，常通过检测尿中的甘露醇和乳果糖来评价肠屏障的功能[1]。近年来出现新型带电化学监测器的高效离子色谱仪，用脉冲电流检出器检测尿中的甘露醇和乳果糖，有很好灵敏性和特异性，是国内外最先进的测量小分子糖类的方法，它可同时测量几种糖类，且其标本前处理过程简便[2]。此法对于尿样中的乳果糖的最低检出浓度是0.3mg/L，分析回收率在90%～107%。
, 百拇医药
本研究采用乳果糖和甘露醇的双糖研究方法，用尿中的“乳果糖和甘露醇的比值来作为反映肠粘膜通透性的指标，它可以排除一些常见因素如胃排空时间、肠蠕动大小、肾排除量和尿液收集等的误差对测量结果的影响[2]。因此，L/M比值是一种测量肠粘膜通透性的理想指标。本研究中发现，肠外营养后大鼠肠粘膜通透性明显增加，说明肠外营养本身可以引起肠粘膜损害。
参考文献
1 Trvis S, Menzies I. Intestinal permeability: functional assessment and significance. Clin Sci, 1992, 82：471.
2 Kynaston JA, Fleming SC. Simultaneous quantification of mannitol, 3-o-Methyl glucose, and lactulose in urine by HPLC with Pulsed Electrochemical Detection, for use in studies of intestinal permeability. Clin Chem, 1993, 39：453.
(收稿：1996-09-24 修回：1997-03-30), 百拇医药
单位：010059 呼和浩特，内蒙古医学院附属第一医院普通外科(王文涛、王正茂)；中国医学科学院 北京协和医院普通外科(刘跃武、蒋朱明、白满喜)；中国医学科学院基础医学研究所(徐艳英、潘华珍)
关键词：
中华医学杂志970926 在正常和肠外营养的情况下,作者采用带电化学检测器的高效液相技术测量甘露醇(Lactulose)、乳果糖(Mannitol)在尿中的含量，探讨建立一种临床可能实用的测量肠粘膜通透性的方法，并观察肠外营养时肠粘膜通透性的变化。
一、资料和方法
1.正常人实验：20名成年健康志愿中国人，男、女各10名；禁食18小时(可适量饮水)，空腹测量。在口服60ml溶液(含10g乳果糖和5g甘露醇)后，收集6小时内的全部尿液，测量尿液总量，取其中20ml用硫柳汞作防腐处理后在-20℃冷藏待检。
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2.动物实验：Wistar大鼠20只，行中心静脉插管，给予标准肠外营养输液。用乳果糖和甘露醇溶液于实验的第3、7天经口给大鼠灌胃。灌注2ml溶液(含乳果糖100mg，甘露醇50mg)。收集并记录24小时尿量。取20ml尿加4mg硫柳汞于-20℃保存待检。
3.仪器、试剂：带电化学检测器的高效液相离子色谱仪(HPLCPED，DIONEX)，测量电极为金电极，分离柱为Dionex HPLC-AS6阴离子柱(250×40mm)。甘露醇、乳果糖均为美国Sigma公司产品，NaOH纯度为98%。
4.高效液相(HPLC-PED)分析：(1) 标本预处理：取待检尿样5ml，离心10分钟(5 000r/min)。取上清液，用煮沸醋酸法去除蛋白。取上清液2ml过阴阳离子树脂柱，滤液再过0.22μm滤器。(2) HPLC分析：取预处理之滤液注射到色谱柱上。色谱条件为：0.1mol/L NaOH以1ml/min的速度淋洗。测量电压为：电极电压+0.5V，氧化电极电压+0.6V，还原电极电压-0.95V。
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5.定量分析：色谱图形由自动积分仪描记，测得面积，甘露醇及乳果糖浓度用标准曲线公式算出。
6.标准液配制及标准曲线的制作：(1) 标准液配制：用去离子水将甘露醇、乳果糖配制成标准液，等比稀释标准液，上机行HPLC分析，测定得出面积。
(2) 标准曲线的制作：将测得面积与已知浓度在Macintosh LC个人电脑上用统计软件Stat View Ⅱ行回归分析，自动作出标准曲线并得出公式。
7.统计学处理：统计分析在Macintosh LC个人电脑上用统计软件Stat View Ⅱ进行。结果用
±表示。二、结果
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1.标准曲线：甘露醇标准曲线公式为：Y=2.73×10-4X+3.60，其中X为面积，Y为浓度(下同)。乳果糖标准曲线公式为：Y=0.24×10-4X+0.22。
2.健康成人：乳果糖排出率与甘露醇排出率之比(L/M)为：0.020%±0.0016%；
3.肠外营养大鼠营养支持3天时L/M：0.024%±0.003%；大鼠营养支持7天时L/M：0.042%±0.005%。
4.乳果糖与甘露醇的回收率为：94.3%～101.9%(10只鼠)；乳果糖和甘露醇的变异系数为2.3%～5.4%(10只鼠)。
三、讨论
肠粘膜的通透性增高是肠屏障功能受损害的一个指标[1]，常通过检测尿中的甘露醇和乳果糖来评价肠屏障的功能[1]。近年来出现新型带电化学监测器的高效离子色谱仪，用脉冲电流检出器检测尿中的甘露醇和乳果糖，有很好灵敏性和特异性，是国内外最先进的测量小分子糖类的方法，它可同时测量几种糖类，且其标本前处理过程简便[2]。此法对于尿样中的乳果糖的最低检出浓度是0.3mg/L，分析回收率在90%～107%。
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本研究采用乳果糖和甘露醇的双糖研究方法，用尿中的“乳果糖和甘露醇的比值来作为反映肠粘膜通透性的指标，它可以排除一些常见因素如胃排空时间、肠蠕动大小、肾排除量和尿液收集等的误差对测量结果的影响[2]。因此，L/M比值是一种测量肠粘膜通透性的理想指标。本研究中发现，肠外营养后大鼠肠粘膜通透性明显增加，说明肠外营养本身可以引起肠粘膜损害。
参考文献
1 Trvis S, Menzies I. Intestinal permeability: functional assessment and significance. Clin Sci, 1992, 82：471.
2 Kynaston JA, Fleming SC. Simultaneous quantification of mannitol, 3-o-Methyl glucose, and lactulose in urine by HPLC with Pulsed Electrochemical Detection, for use in studies of intestinal permeability. Clin Chem, 1993, 39：453.
(收稿：1996-09-24 修回：1997-03-30), 百拇医药