细胞内钙超负荷在大鼠胆汁性急性胰腺炎发病机理中的作用
作者：沈 骥 吴宗平 肖 华 宋永慧 黄建民 刘 旻 浦青凡 严律南
单位：610041 成都市，四川省卫生管理干部学院胰腺病研究室、外科教研室(沈 骥、吴宗平、肖 华、宋永慧、刘 旻)，四川省肿瘤研究所生化室(黄建民)；华西医科大学第一附医院(浦青凡、严律南)
关键词：
中华医学杂志970924 我们用荧光指标剂Fura-2/Am测定了急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺病理细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)，同时观察胰腺组织病理变化，以探讨细胞内钙超负荷在AP发生发展中的作用。
一、材料和方法
1.急性胰腺炎模型的制备：SD大鼠80只，体重180～240 g，雄雌各半，随机分成正常对照组(n=20)、假手术对照组(n=30)和AP组(n=30)。参照Aho等[1]的方法，大鼠胆胰管经十二指肠穿刺加压注射4.5%牛磺胆酸钠溶液(美国Sigma公司)，注射量0.1 ml/100 g体重，注射速度为0.1 ml/30 s。
, http://www.100md.com
2.胰腺腺泡细胞消化分离及[Ca2+]i测定：对照组及AP组分别于术后1、2和3小时各处死10只鼠，处死后立即取出胰组织，取一半胰组织消化分离为单细胞悬液供[Ca2+]i测定，留一半作病理学观察。参照Amsterdam等[2]的方法，取出胰腺，用0.2 mg/ml XI型胶原酶和0.4 mg/ml透明质酸酶组成的消化液消化。后加入Fura-2/Am 10 μl(中国医学科学院药物研究所提供)，在37℃水浴内温孵负载20分钟后，用岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计测定λem为50 nm、λex分别为340和380 nm双波长下的 荧光比值(R)，加入18% Triton X-100和0.6 mol/L EDTA，分别测定其Ca2+饱和状态下的最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)，按公式
计算得到胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i。
, 百拇医药
3.胰腺组织病理学观察：对照组及AP组各10只大鼠。按Rao等[3]的方法进行胰组织病理半定量评分，并用JEM-100SX型透射电镜观察其胰腺腺泡细胞等的超微结构变化。
二、结果
1.胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i的变化：制AP模型后1、2和3小时，胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i分别较对照组增高1.88、2.37和2.30倍(P<0.001)，AP组制模型后2小时的[Ca2+]i值达高峰，2和3小时[Ca2+]i较1小时的[Ca2+]i明显增高(P<0.05，附表)。
附表 急性胰腺炎大鼠胰腺细胞内钙离子浓度变化(nmol/L) 组别
鼠数
, 百拇医药
1hr
2hr
3hr
假手术组
30
163±13
170±13
167±10
AP组
30
307±16
403±18
385±33
, 百拇医药
注：1、2、3hr为制AP模型后时间
2.胰腺组织病理学检查和超微观察：AP组在AP后1小时胰组织轻度水肿、少量炎性细胞渗出；2和3小时胰腺组织水肿明显，炎性细胞渗出明显，可见少数散在凝固性坏死灶，伴脂肪坏死、部分胰管破坏和散在性出血灶，呈早期坏死性胰腺炎。制AP模型后2和3小时胰腺腺泡 细胞[Ca2+]i与相同时间胰组织病理半定量评分结果呈正相关关系(r分别为0.9227和0.8706，P<0.001)。电镜观察显示，AP后1小时胰腺腺泡细胞线粒体肿胀，嵴破坏，内质网扩张，2和3小时可见腺泡细胞内粗面内质网空泡化、脱颗粒，溶酶体肿胀，并可见异质性胞浆包涵体和自噬性空泡。
三、讨论
1985年Warshaw等[3]用游离脂肪酸灌注胰管，发现其可破坏胰腺细胞膜稳定性，导致严重的AP，并分析重症AP时低血钙可能是因为细胞膜稳定性受损，大量钙离子移入细胞内所致，因而提出钙离子内流参与了AP病理生理过程的假说。本实验，采用较先进的双波长荧光分光光度计，在恒温37℃和电磁搅拌的状态下测定其荧光比值，可较准确地测得[Ca2+]i，同时对Schultz等[4]1990年进行的病理状态下胰腺细胞消化分离的方法进行了改进，通过适当强化消化力，严格控制恒温、通氧和消化时间,可使95%以上的消化分离单细胞存活,基本保证了准确测定活细胞[Ca2+]i。本实验的病理观察证实，在AP后2～3小时，胰腺组织细胞开始出现部分坏死，显轻度出血坏死性AP改变，而此时的胰泡细胞内[Ca2+]i明显增高，且与胰腺病理改变呈正相关关系。本实验结果提示，在胰腺水肿向胰腺出血坏死发展的过程中，存在明显的钙离子内流，细胞内钙超负荷在AP发生发展过程中可能起一定作用，但其确切机理尚待进一步研究。
, http://www.100md.com
本课题为国家自然科学基金资助项目及卫生部青年科学基金资助项目
参考文献
1 Aho HJ. Koskensalo SML, Nevalainen YJ. Experimental pancreatitis in the rat sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroent, 1980,15：411.
2 Amsterdam A, Jamieson JD. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol, 1974,15：411.
, http://www.100md.com
3 Warshaw AL, Lee KH, Napier TW, et al. Depression of serum calcium by increased plasma free-fatty acids in the rat: a mechanism for hypocalcemia in acute pancreatitis. Gastroenterology, 1985,89：814.
4 Schultz HU, Letko G, Spormann H. Decreased survival rate of pancreatic acinar cells isolated from rats with acute pancreatitis. Int J Pancreatol, 1990,6：219.
(收稿：1996-11-27 修回：1997-05-28), 百拇医药
单位：610041 成都市，四川省卫生管理干部学院胰腺病研究室、外科教研室(沈 骥、吴宗平、肖 华、宋永慧、刘 旻)，四川省肿瘤研究所生化室(黄建民)；华西医科大学第一附医院(浦青凡、严律南)
关键词：
中华医学杂志970924 我们用荧光指标剂Fura-2/Am测定了急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺病理细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)，同时观察胰腺组织病理变化，以探讨细胞内钙超负荷在AP发生发展中的作用。
一、材料和方法
1.急性胰腺炎模型的制备：SD大鼠80只，体重180～240 g，雄雌各半，随机分成正常对照组(n=20)、假手术对照组(n=30)和AP组(n=30)。参照Aho等[1]的方法，大鼠胆胰管经十二指肠穿刺加压注射4.5%牛磺胆酸钠溶液(美国Sigma公司)，注射量0.1 ml/100 g体重，注射速度为0.1 ml/30 s。
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2.胰腺腺泡细胞消化分离及[Ca2+]i测定：对照组及AP组分别于术后1、2和3小时各处死10只鼠，处死后立即取出胰组织，取一半胰组织消化分离为单细胞悬液供[Ca2+]i测定，留一半作病理学观察。参照Amsterdam等[2]的方法，取出胰腺，用0.2 mg/ml XI型胶原酶和0.4 mg/ml透明质酸酶组成的消化液消化。后加入Fura-2/Am 10 μl(中国医学科学院药物研究所提供)，在37℃水浴内温孵负载20分钟后，用岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计测定λem为50 nm、λex分别为340和380 nm双波长下的 荧光比值(R)，加入18% Triton X-100和0.6 mol/L EDTA，分别测定其Ca2+饱和状态下的最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)，按公式
计算得到胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i。, 百拇医药
3.胰腺组织病理学观察：对照组及AP组各10只大鼠。按Rao等[3]的方法进行胰组织病理半定量评分，并用JEM-100SX型透射电镜观察其胰腺腺泡细胞等的超微结构变化。
二、结果
1.胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i的变化：制AP模型后1、2和3小时，胰腺腺泡细胞内[Ca2+]i分别较对照组增高1.88、2.37和2.30倍(P<0.001)，AP组制模型后2小时的[Ca2+]i值达高峰，2和3小时[Ca2+]i较1小时的[Ca2+]i明显增高(P<0.05，附表)。
附表 急性胰腺炎大鼠胰腺细胞内钙离子浓度变化(nmol/L) 组别
鼠数
, 百拇医药
1hr
2hr
3hr
假手术组
30
163±13
170±13
167±10
AP组
30
307±16
403±18
385±33
, 百拇医药
注：1、2、3hr为制AP模型后时间
2.胰腺组织病理学检查和超微观察：AP组在AP后1小时胰组织轻度水肿、少量炎性细胞渗出；2和3小时胰腺组织水肿明显，炎性细胞渗出明显，可见少数散在凝固性坏死灶，伴脂肪坏死、部分胰管破坏和散在性出血灶，呈早期坏死性胰腺炎。制AP模型后2和3小时胰腺腺泡 细胞[Ca2+]i与相同时间胰组织病理半定量评分结果呈正相关关系(r分别为0.9227和0.8706，P<0.001)。电镜观察显示，AP后1小时胰腺腺泡细胞线粒体肿胀，嵴破坏，内质网扩张，2和3小时可见腺泡细胞内粗面内质网空泡化、脱颗粒，溶酶体肿胀，并可见异质性胞浆包涵体和自噬性空泡。
三、讨论
1985年Warshaw等[3]用游离脂肪酸灌注胰管，发现其可破坏胰腺细胞膜稳定性，导致严重的AP，并分析重症AP时低血钙可能是因为细胞膜稳定性受损，大量钙离子移入细胞内所致，因而提出钙离子内流参与了AP病理生理过程的假说。本实验，采用较先进的双波长荧光分光光度计，在恒温37℃和电磁搅拌的状态下测定其荧光比值，可较准确地测得[Ca2+]i，同时对Schultz等[4]1990年进行的病理状态下胰腺细胞消化分离的方法进行了改进，通过适当强化消化力，严格控制恒温、通氧和消化时间,可使95%以上的消化分离单细胞存活,基本保证了准确测定活细胞[Ca2+]i。本实验的病理观察证实，在AP后2～3小时，胰腺组织细胞开始出现部分坏死，显轻度出血坏死性AP改变，而此时的胰泡细胞内[Ca2+]i明显增高，且与胰腺病理改变呈正相关关系。本实验结果提示，在胰腺水肿向胰腺出血坏死发展的过程中，存在明显的钙离子内流，细胞内钙超负荷在AP发生发展过程中可能起一定作用，但其确切机理尚待进一步研究。
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本课题为国家自然科学基金资助项目及卫生部青年科学基金资助项目
参考文献
1 Aho HJ. Koskensalo SML, Nevalainen YJ. Experimental pancreatitis in the rat sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroent, 1980,15：411.
2 Amsterdam A, Jamieson JD. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol, 1974,15：411.
, http://www.100md.com
3 Warshaw AL, Lee KH, Napier TW, et al. Depression of serum calcium by increased plasma free-fatty acids in the rat: a mechanism for hypocalcemia in acute pancreatitis. Gastroenterology, 1985,89：814.
4 Schultz HU, Letko G, Spormann H. Decreased survival rate of pancreatic acinar cells isolated from rats with acute pancreatitis. Int J Pancreatol, 1990,6：219.
(收稿：1996-11-27 修回：1997-05-28), 百拇医药