缺血预处理对大鼠心肌细胞超微结构的保护作用
作者：乌立晖 张宝仁 朱家麟 郝家骅 杨勇骥△
单位：
关键词：心肌细胞；缺血预处理；缺血再灌注损伤；蛋白激酶C
摘要 目的摘要 目的：观察缺血预处理对大鼠心肌细胞抗缺血再灌注损伤的作用。方法：培养SD乳鼠心肌细胞，分别以模拟缺血溶液和模拟再灌注溶液先后置换培养基，制备模拟缺血再灌注模型。实验分为模拟缺血再灌注组，缺血预处理组，佛波酯、去甲肾上腺素、腺苷预处理组和1-(5-异喹啉硫酰)-2-甲基哌嗪(H7)+缺血预处理组。模拟缺血再灌注后，用透射电镜观察各组心肌细胞的超微结构改变。结果：模拟缺血再灌注组心肌细胞超微结构损伤较重；缺血预处理组心肌细胞肌浆及线粒体水肿较轻，膜结构较好；其他药物预处理组细胞结构改变比缺血预处理组明显；加用H7组细胞结构改变与模拟缺血再灌注组近似。结论：缺血预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤有一定的保护作用。蛋白激酶C可能在缺血预处理中起着关键的作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 654.2
Protective effects of ischemic preconditioning on ultrastructural damage to myocardial cells in rats
Wu Lihui, Zhang Baoren, Zhu Jialin, Hao Jiahua, Yang Yongji (Department of Thoracicocardiac Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the effects of ischemic preconditioning on ultrastructural damage to myocardial cells induced by mimicking ischemia-reperfusion. Methods: Cultured rat cardiac myocytes were divided into mimicking ischemia-reperfusion group, ischemic preconditioning group, 4β-phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), norepinephrine and adenosine preconditioning groups, and H7+ischemic preconditioning group. After mimicking ischemia-reperfusion, ultrastructural changes of myocardial cells were observed by electron microscope. Results: Ultrastructural damage to myocardial cells was more severe in mimicking ischemia-reperfusion group; mitochondria and sarcoplasmic swelling and myofibrillar dissolving were more mild in ischemia preconditioning group; in PMA, adenosine and norepinephrine preconditioning groups, the ultrastructural changes were more severe than those in ischemia preconditioning group. But the injury of H7 group was similar to that of mimicking ischemia-reperfusion group. Conclusion: Ischemic preconditioning has protective effects on ischemia-reperfusion mediated injury to myocardial cells and protein kinase C might play a key role in ischemia preconditioning.
, 百拇医药
Key words myocardial cells; ischemic preconditioning; ischemia-reperfusion injury; protein kinase C
自1986年提出缺血预处理(IPC)保护缺血心肌[1]以来，有人相继在整体心脏缺血模型中证实了此作用[2]，但无法排除血液动力学、激素、神经反射的影响。关于IPC对心肌细胞是否有直接保护作用的报道较少。本实验通过建立培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤模型，观察IPC对缺血再灌注心肌细胞超微结构的保护作用。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂 佛波酯为Sigma公司产品；胰蛋白酶、MEM干粉培养剂为Gibco公司产品；1-(5-异喹啉硫酰)-2-甲基哌嗪(H7)由本校药学院钱定华教授合成；其他试剂均为国产AR级产品。
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1.2 方法 按Webster[3]方法培养SD乳鼠心室肌细胞96 h，培养基为85%MEM+15%胎牛血清。实验分为模拟缺血再灌注组、IPC组、佛波酯预处理组、腺苷预处理组、去甲肾上腺素预处理组、H7+IPC组。药物终浓度：佛波酯1×10-7 mol/L、腺苷2×10-5 mol/L、去甲肾上腺素1×10-6 mol/L，H7 2×10-5 mol/L。药物分别于实验前60 min加入，作用30 min后，换正常培养基。IPC为模拟缺血液5 min“缺血”，15 min复灌，连续3次，共1 h。细胞预处理后，经模拟缺血再灌注，行电镜观察。
1.3 模拟缺血再灌注模型制备 参照Koyama等[4]方法，在模拟缺血溶液置换培养基30 min后，再用模拟再灌注溶液置换培养基10 min。
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1.3.1 模拟缺血溶液成分 NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，NaH2PO4 0.9 mmol/L，NaHCO3 6.0 mmol/L，CaCl2 1.0 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L、乳酸钠40 mmol/L(pH6.8)，预先用高纯度氮气饱和。
1.3.2 模拟再灌注溶液成分 NaCl 129.5 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2PO4 0.9 mmol/L，NaHCO3 20.0 mmol/L，CaCl2 1.0 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L(pH7.4)，预先用纯氧气饱和。
1.4 透射电镜标本制作 用0.25%胰蛋白酶消化细胞4 min，PBS洗涤1遍，离心收集细胞。2.5%戊二醛及1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅、铀双重染色，H-800透射电镜观察并摄片。
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2 结 果
正常培养心肌细胞的核基本为椭圆型，核内物质分布均一，细胞的肌原纤维均规则，有清楚的肌小节，Z线特别明显，闰盘清晰，细胞质内充满线粒体，嵴排列致密规则。 模拟缺血再灌注组心肌细胞超微结构产生一系列形态学改变，细胞核内异染色质聚集，线粒体高度肿胀、变形、嵴消失，部分线粒体呈空泡状，肌原纤维消溶(图1A)。IPC组(图1B)细胞超微结构损伤较轻，损伤程度与佛波酯组相近，线粒体较完整，内有少量空泡，肌原纤维部分消溶，膜结构完整。佛波酯、腺苷及去甲肾上腺素药物预处理组，虽然仍可见模拟缺血再灌注所引起的不同程度心肌细胞损伤，表现为线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴模糊不清，胞浆扩张，但与模拟缺血再灌注组相比，此种损伤明显减轻，尤其是线粒体与肌原纤维的改变较小，其中佛波酯组形态改变最轻(图1C)，膜结构好于腺苷及去甲肾上腺素组。H7+IPC组(图1D)心肌细胞超微结构损伤较重，类似于模拟缺血再灌注组，肌原纤维消溶，线粒体肿胀、变形、嵴变圆，胞浆扩张。
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图1 各组培养心肌细胞超微结构(标尺＝1 μm)
Fig 1 Ultrastructure in cultured myocardial cells of each group(Bar＝1 μm)
A：Mimicking ischemia-reperfusion group； B：Ischemic preconditioning group；
C：PMA preconditioning group； D：H7+ischemic preconditioning group
3 讨 论
目前研究资料表明，心肌在缺血再恢复血供后可进一步加重心肌损伤，即所谓再灌注损伤，但在实验研究中，对培养的心肌细胞难以产生真实的缺血再灌注状态。本实验应用心肌缺血再灌注过程中组织间液的变化(缺氧、高钠、乳酸堆积、酸中毒、葡萄糖耗竭，后恢复正常)，直接作用于培养的心肌细胞。Thandroyen等[5]认为，此缺血再灌注损伤模型更近似于真实心肌缺血再灌注过程。本实验观察到缺血再灌注实验模型可导致心肌细胞超微结构的严重损伤，尤其是线粒体的损伤。
, 百拇医药
IPC保护心肌的全心实验模型证实，IPC能降低ATP消耗，减小冠状动脉阻塞后坏死心肌的体积及预防心律失常[1,2,6]。本实验结果显示，IPC可使心肌细胞对缺血再灌注损伤产生“耐受现象”，有一定的保护作用。用蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯预处理，可部分模拟IPC对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用，而IPC的上述保护作用被PKC抑制剂H7(与ATP竞争结合PKC位点)所完全消除，提示PKC的激活介导了IPC的细胞保护作用。
作为心肌细胞自身存在的内源性保护机制的IPC，其保护缺血心肌机制众说纷纭。我们发现PKC在IPC中起着关键的作用。PKC是细胞内信息传递过程中的一种重要物质[7]，心肌在IPC时伴有PKC的转位与激活,IPC引起心肌细胞内PKC激活后才能显示出心肌保护作用[8]。
参 考 文 献
, 百拇医药 1 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation,1986，74(5):1124
2 Hagar JM, Hale SL, Kloner RA. Effect of preconditioning ischemia on reperfusion arrhythmias after coronary artery occlusion and reperfusion in the rat. Circ Res,1991，68(1):61
3 Webster KA, Discher DJ, Bishopric NH. Induction and nuclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes. J Biol Chem,1993，268(22):16852
, http://www.100md.com
4 Koyama T, Temma K, Akera T. Reperfusion-induced contracture develops with a decreasing[Ca2+]i in single heart cells. Am J Physiol,1991，261(4Pt2):H1115
5 Thandroyen FT, Bellotto D, Katayama A, et al. Subcellular electrolyte alterations during progressive hypoxia and following reoxygenation in isolated neonatal rat ventricular myocytes. Circ Res,1992，71(1):106
6 Murry CE, Richard VJ, Reimer KA， et al. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res,1990,66(4):913
, 百拇医药
7 Disatnik MH, Buraggi G, Mochly-Rosen D， et al. Localization of protein kinase C isozymes in cardiac myocytes. Exp Cell Res,1994，210(2):287
8 Mitchell MB, Meng X, Ao L， et al. Preconditioning of isolated rat heart is mediated by protein kinase C. Circ Res,1995，76(1):73
(1997-08-11收稿，1997-12-07修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：心肌细胞；缺血预处理；缺血再灌注损伤；蛋白激酶C
摘要 目的摘要 目的：观察缺血预处理对大鼠心肌细胞抗缺血再灌注损伤的作用。方法：培养SD乳鼠心肌细胞，分别以模拟缺血溶液和模拟再灌注溶液先后置换培养基，制备模拟缺血再灌注模型。实验分为模拟缺血再灌注组，缺血预处理组，佛波酯、去甲肾上腺素、腺苷预处理组和1-(5-异喹啉硫酰)-2-甲基哌嗪(H7)+缺血预处理组。模拟缺血再灌注后，用透射电镜观察各组心肌细胞的超微结构改变。结果：模拟缺血再灌注组心肌细胞超微结构损伤较重；缺血预处理组心肌细胞肌浆及线粒体水肿较轻，膜结构较好；其他药物预处理组细胞结构改变比缺血预处理组明显；加用H7组细胞结构改变与模拟缺血再灌注组近似。结论：缺血预处理对心肌细胞缺血再灌注损伤有一定的保护作用。蛋白激酶C可能在缺血预处理中起着关键的作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 654.2
Protective effects of ischemic preconditioning on ultrastructural damage to myocardial cells in rats
Wu Lihui, Zhang Baoren, Zhu Jialin, Hao Jiahua, Yang Yongji (Department of Thoracicocardiac Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the effects of ischemic preconditioning on ultrastructural damage to myocardial cells induced by mimicking ischemia-reperfusion. Methods: Cultured rat cardiac myocytes were divided into mimicking ischemia-reperfusion group, ischemic preconditioning group, 4β-phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), norepinephrine and adenosine preconditioning groups, and H7+ischemic preconditioning group. After mimicking ischemia-reperfusion, ultrastructural changes of myocardial cells were observed by electron microscope. Results: Ultrastructural damage to myocardial cells was more severe in mimicking ischemia-reperfusion group; mitochondria and sarcoplasmic swelling and myofibrillar dissolving were more mild in ischemia preconditioning group; in PMA, adenosine and norepinephrine preconditioning groups, the ultrastructural changes were more severe than those in ischemia preconditioning group. But the injury of H7 group was similar to that of mimicking ischemia-reperfusion group. Conclusion: Ischemic preconditioning has protective effects on ischemia-reperfusion mediated injury to myocardial cells and protein kinase C might play a key role in ischemia preconditioning.
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Key words myocardial cells; ischemic preconditioning; ischemia-reperfusion injury; protein kinase C
自1986年提出缺血预处理(IPC)保护缺血心肌[1]以来，有人相继在整体心脏缺血模型中证实了此作用[2]，但无法排除血液动力学、激素、神经反射的影响。关于IPC对心肌细胞是否有直接保护作用的报道较少。本实验通过建立培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤模型，观察IPC对缺血再灌注心肌细胞超微结构的保护作用。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂 佛波酯为Sigma公司产品；胰蛋白酶、MEM干粉培养剂为Gibco公司产品；1-(5-异喹啉硫酰)-2-甲基哌嗪(H7)由本校药学院钱定华教授合成；其他试剂均为国产AR级产品。
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1.2 方法 按Webster[3]方法培养SD乳鼠心室肌细胞96 h，培养基为85%MEM+15%胎牛血清。实验分为模拟缺血再灌注组、IPC组、佛波酯预处理组、腺苷预处理组、去甲肾上腺素预处理组、H7+IPC组。药物终浓度：佛波酯1×10-7 mol/L、腺苷2×10-5 mol/L、去甲肾上腺素1×10-6 mol/L，H7 2×10-5 mol/L。药物分别于实验前60 min加入，作用30 min后，换正常培养基。IPC为模拟缺血液5 min“缺血”，15 min复灌，连续3次，共1 h。细胞预处理后，经模拟缺血再灌注，行电镜观察。
1.3 模拟缺血再灌注模型制备 参照Koyama等[4]方法，在模拟缺血溶液置换培养基30 min后，再用模拟再灌注溶液置换培养基10 min。
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1.3.1 模拟缺血溶液成分 NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，NaH2PO4 0.9 mmol/L，NaHCO3 6.0 mmol/L，CaCl2 1.0 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L、乳酸钠40 mmol/L(pH6.8)，预先用高纯度氮气饱和。
1.3.2 模拟再灌注溶液成分 NaCl 129.5 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2PO4 0.9 mmol/L，NaHCO3 20.0 mmol/L，CaCl2 1.0 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L(pH7.4)，预先用纯氧气饱和。
1.4 透射电镜标本制作 用0.25%胰蛋白酶消化细胞4 min，PBS洗涤1遍，离心收集细胞。2.5%戊二醛及1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅、铀双重染色，H-800透射电镜观察并摄片。
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2 结 果
正常培养心肌细胞的核基本为椭圆型，核内物质分布均一，细胞的肌原纤维均规则，有清楚的肌小节，Z线特别明显，闰盘清晰，细胞质内充满线粒体，嵴排列致密规则。 模拟缺血再灌注组心肌细胞超微结构产生一系列形态学改变，细胞核内异染色质聚集，线粒体高度肿胀、变形、嵴消失，部分线粒体呈空泡状，肌原纤维消溶(图1A)。IPC组(图1B)细胞超微结构损伤较轻，损伤程度与佛波酯组相近，线粒体较完整，内有少量空泡，肌原纤维部分消溶，膜结构完整。佛波酯、腺苷及去甲肾上腺素药物预处理组，虽然仍可见模拟缺血再灌注所引起的不同程度心肌细胞损伤，表现为线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴模糊不清，胞浆扩张，但与模拟缺血再灌注组相比，此种损伤明显减轻，尤其是线粒体与肌原纤维的改变较小，其中佛波酯组形态改变最轻(图1C)，膜结构好于腺苷及去甲肾上腺素组。H7+IPC组(图1D)心肌细胞超微结构损伤较重，类似于模拟缺血再灌注组，肌原纤维消溶，线粒体肿胀、变形、嵴变圆，胞浆扩张。
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图1 各组培养心肌细胞超微结构(标尺＝1 μm)
Fig 1 Ultrastructure in cultured myocardial cells of each group(Bar＝1 μm)
A：Mimicking ischemia-reperfusion group； B：Ischemic preconditioning group；
C：PMA preconditioning group； D：H7+ischemic preconditioning group
3 讨 论
目前研究资料表明，心肌在缺血再恢复血供后可进一步加重心肌损伤，即所谓再灌注损伤，但在实验研究中，对培养的心肌细胞难以产生真实的缺血再灌注状态。本实验应用心肌缺血再灌注过程中组织间液的变化(缺氧、高钠、乳酸堆积、酸中毒、葡萄糖耗竭，后恢复正常)，直接作用于培养的心肌细胞。Thandroyen等[5]认为，此缺血再灌注损伤模型更近似于真实心肌缺血再灌注过程。本实验观察到缺血再灌注实验模型可导致心肌细胞超微结构的严重损伤，尤其是线粒体的损伤。
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IPC保护心肌的全心实验模型证实，IPC能降低ATP消耗，减小冠状动脉阻塞后坏死心肌的体积及预防心律失常[1,2,6]。本实验结果显示，IPC可使心肌细胞对缺血再灌注损伤产生“耐受现象”，有一定的保护作用。用蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯预处理，可部分模拟IPC对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用，而IPC的上述保护作用被PKC抑制剂H7(与ATP竞争结合PKC位点)所完全消除，提示PKC的激活介导了IPC的细胞保护作用。
作为心肌细胞自身存在的内源性保护机制的IPC，其保护缺血心肌机制众说纷纭。我们发现PKC在IPC中起着关键的作用。PKC是细胞内信息传递过程中的一种重要物质[7]，心肌在IPC时伴有PKC的转位与激活,IPC引起心肌细胞内PKC激活后才能显示出心肌保护作用[8]。
参 考 文 献
, 百拇医药 1 Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation,1986，74(5):1124
2 Hagar JM, Hale SL, Kloner RA. Effect of preconditioning ischemia on reperfusion arrhythmias after coronary artery occlusion and reperfusion in the rat. Circ Res,1991，68(1):61
3 Webster KA, Discher DJ, Bishopric NH. Induction and nuclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes. J Biol Chem,1993，268(22):16852
, http://www.100md.com
4 Koyama T, Temma K, Akera T. Reperfusion-induced contracture develops with a decreasing[Ca2+]i in single heart cells. Am J Physiol,1991，261(4Pt2):H1115
5 Thandroyen FT, Bellotto D, Katayama A, et al. Subcellular electrolyte alterations during progressive hypoxia and following reoxygenation in isolated neonatal rat ventricular myocytes. Circ Res,1992，71(1):106
6 Murry CE, Richard VJ, Reimer KA， et al. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res,1990,66(4):913
, 百拇医药
7 Disatnik MH, Buraggi G, Mochly-Rosen D， et al. Localization of protein kinase C isozymes in cardiac myocytes. Exp Cell Res,1994，210(2):287
8 Mitchell MB, Meng X, Ao L， et al. Preconditioning of isolated rat heart is mediated by protein kinase C. Circ Res,1995，76(1):73
(1997-08-11收稿，1997-12-07修回), http://www.100md.com