大鼠液压颅脑伤后脑内Fos蛋白的表达
作者：吉健勇 周晓平 王文仲 向正华△
单位：
关键词：脑损伤；c-fos；基因表达
摘要 目的
摘要 目的：研究颅脑损伤后脑内Fos蛋白表达情况。方法：采用大鼠液压颅脑伤模型，应用免疫组织化学PAP 法和计算机图像分析技术，观测不同程度颅脑损伤后不同时间脑内Fos蛋白的表达情况。结果：伤后15 min脑内开始出现Fos蛋白表达，伤后1 h达高峰， 此后逐渐消退，伤后6 h基本恢复至正常水平。Fos 阳性神经元主要分布在损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和双侧海马齿状回，同侧海马较对侧显著。轻、中和重度脑损伤，Fos 蛋白表达水平有显著差异，损伤越重，表达越强烈。结论：颅脑损伤引起脑内特定区域c-fos 基因迅速和一过性表达增加，其表达水平与脑损伤程度有关。c-fos 基因的表达改变在颅脑损伤病理生理过程中具有重要的调控作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 651.15
Induction of Fos protein in the brain of rats following fluid percussion brain injury
Ji Jianyong, Zhou Xiaoping, Wang Wenzhong, Xiang Zhenghua (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the induction of Fos protein in the brain of rats after traumatic brain injury. Methods: Using immunohistochemistry and computer image analysis, the induction of Fos protein in the brain of rats after fluid percussion brain injury in different degree was evaluated. Results: Robust Fos expression was observed in the ipsilateral cerebral cortex and bilateral hippocampus. The increased expression of Fos protein began 15 min after injury, peaked at 1 h postinjury, and subsided at 6 h postinjury. The intensity of label in the nuclei of Fos positive neurons and the numbers of Fos positive neurons were not equal after fluid percussion brain injury at different degree. The level of increased Fos protein following moderate brain injury was higher than that following mild injury (P<0.01), and the level following severe injury was higher than that following moderate injury (P<0.01). Conclusion: The pathobiologic changes at early intervals after traumatic brain injury may involve the alteration of c-fos gene expression and c-fos expression may be differentially regulated as a function of injury level.
, http://www.100md.com
Key words brain injury; c-fos; gene expression
c-fos原癌基因是目前研究最多的即早期基因(IEGs)之一,癫痫、脑缺血、疼痛等多种刺激,均可诱导c-fos基因在脑内出现早期短暂性快速表达增加[1]，但目前对c-fos基因在颅脑创伤中的研究甚少。为此，我们采用大鼠液压颅脑伤模型,用免疫组织化学和计算机图像分析技术,观测了c-fos基因的表达产物Fos核蛋白在颅脑损伤后的表达过程、脑内分布,以及Fos蛋白的表达水平与脑损伤程度间的相关性,初步探讨颅脑损伤后c-fos基因的表达调控机制和在脑损伤病理生理过程中的意义。
1 材料和方法
1.1 动物 雄性健康SD大鼠40只，体质量200～300 g，由上海计划生育研究所提供。
1.2 材料 动物液压颅脑伤致伤装置由美国弗吉尼亚大学医学工程部研制，长征医院神经外科提供。兔抗 Fos 蛋白抗体由Santa Cruz公司生产。PAP 复合物由上海医科大学病理解剖学教研室制备。 VIDAS 计算机图像分析系统为德国生产。
, 百拇医药
1.3 颅脑伤模型制作 采用大鼠液压颅脑伤模型[2]，造成SD大鼠轻、中、重度脑损伤的打击压力分别为103.5，155.3和217.4 kPa，打击时间均为21～24 ms。大鼠麻醉后，在前囟和人字缝尖连线中点偏左4 mm处颅骨钻孔，做直径为4.8 mm骨窗，硬脑膜外埋入打击管，牙托水泥固定。为避免手术和麻醉的干扰，待24 h后再行打击。
1.4 实验分组 SD大鼠随机分为 8组，每组5只，分别为中度脑损伤后15，30 min，1，2， 6 h组；轻度脑损伤后1 h组，重度脑损伤后1 h组和对照组。除对照组不予致伤外，其余各组处理相同。相同条件下，实验分批进行，每批含各组大鼠1只。
1.5 免疫组织化学染色 大鼠以1%戊巴比妥钠(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸经左心室插管至主动脉，依次灌注生理盐水200 ml，4% 多聚甲醛、0.3%饱和苦味酸、0.1 mol/L PB 混合液300 ml。在各时间点取出全脑，在同一固定液中4℃下固定6～12 h。然后浸入4℃ 20%蔗糖(用同一固定液配制)，直至组织块下沉。用冷冻切片机自视交叉处向后作连续冠状切片，片厚40 μm。按改进的Stermberger PAP法进行Fos免疫组织化学染色，细胞核被染成棕褐色为阳性结果。抗体的交叉性实验及空白对照实验结果均为阴性。
, 百拇医药
1.6 观测项目 显微镜下观察并比较各组大鼠全脑冠状切片Fos免疫阳性(Fos-ir) 神经元的分布、密度和染色程度。为量化染色深浅，用计算机图像分析系统测定同一层面损伤侧海马齿状回Fos-ir神经元胞核的灰阶值(GREYM)，GREYM数值越小，表明染色越深，反映神经细胞内Fos蛋白表达量越多。
1.7 统计学处理 各组测定数据均用
±s 表示，组间差异比较用完全随机资料的t检验。
2 结 果
2.1 光镜观察 轻度脑损伤组打击局部的蛛网膜下腔出血，无明显脑挫裂和脑实质内出血；中度组双侧大脑半球的蛛网膜下腔出血，以伤侧为主，损伤部位局灶性脑实质内出血及明显脑挫裂伤；重度组呈弥漫性蛛网膜下腔出血，伤侧广泛、严重脑挫裂，脑实质出血累及伤侧额顶叶皮质、皮质下，并可破入脑室。观察结果表明颅脑伤模型达到预期要求。
, 百拇医药
2.2 免疫组织化学染色和计算机图像分析 各损伤组在损伤侧皮质和双侧海马均有Fos-ir神经元分布，以损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和海马齿状回最显著，对侧皮质无Fos-ir神经元。对照组未见染色，GREYM为189.4±4.1。轻度脑损伤后1 h组GREYM为160.5±4.5，与中度脑损伤后1 h组相比差异显著(P<0.01)。中度脑损伤后15 min和6 h组，Fos-ir神经元胞核呈浅棕褐色，分布稀疏，GREMY分别为177.7±6.4和184.4±4.8，15 min组与对照组相比差异显著(P<0.05)。中度脑损伤后1，2 h组，Fos-ir神经元胞核呈深棕褐色，分布密集；伤后30 min，1 h，2 h组的GREYM分别为160.4±4.2，126.9±5.6, 145.1±5.1，与对照组相比均差异显著(P<0.01)。重度脑损伤后1 h的GREYM为109.9±5.7，与中度脑损伤1 h组相比差异显著(P<0.01)。脑损伤程度越重，Fos-ir神经元的胞核染色越深，分布越密集。
3 讨 论
, 百拇医药
c-fos基因是最主要的即早期基因之一，在外界刺激后数十分钟内即开始表达，数十小时后恢复至正常水平，其表达产物Fos 核蛋白与c-jun基因的表达产物Jun核蛋白通过“亮氨酸拉链”形式形成Fos-Jun异源二聚体， 构成AP-1转录因子，进一步激活目的基因的表达。c-fos基因起偶联外界刺激-基因表达的作用，CNS通过c-fos基因的表达，把外界刺激信号转变为细胞内基因表达的刺激信号，从而对外界刺激作出应答。
本实验结果显示，大鼠脑液压伤后，在损伤侧皮质和双侧海马，尤其是损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和同侧海马齿状回出现Fos 蛋白表达增加。 计算机图像分析结果表明， 伤后15 min脑内即有Fos蛋白表达，伤后30 min表达水平显著增高，至伤后1 h达峰值，以后逐渐消退，伤后6 h基本恢复至正常水平。轻、中和重度脑损伤，Fos蛋白表达水平有显著差异(P<0.01)，脑损伤越重，表达越强烈，提示颅脑创伤与其他外界刺激因素一样，也可以诱导c-fos基因在脑内特定部位的早期短暂性表达增加，c-fos基因的表达改变， 可能参与了颅脑损伤早期的病理生理过程[3]。
, 百拇医药
颅脑损伤后c-fos 基因诱导表达的机制和在脑损伤病理生理过程中的意义，目前尚未得到完全阐明。颅脑损伤后，兴奋性氨基酸(EAA)、 乙酰胆碱等多种兴奋性神经递质在CNS过度释放， 神经细胞钙通道开放，细胞内Ca2+大量积聚，cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化增加， 最终导致血脑屏障(BBB)通透性增加、脑水肿、 神经细胞损害等继发性病理改变。近有研究显示，兴奋性神经递质通过激活谷氨酸-N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体或毒蕈碱受体，可诱导c-fos mRNA转录增加。c-fos mRNA及Fos核蛋白在脑内的分布与 NMDA受体的分布极为一致。NMDA受体拮抗剂MK-801能消除或削弱c-fos基因表达[4]，提示 EAA受体，尤其是谷氨酸-NMDA受体的激活，可能是诱导c-fos基因表达的关键因素。有研究表明，神经细胞内Ca2+超载，CREB磷酸化增加，也可介导c-fos基因表达，可见c-fos基因的诱导表达，还与神经细胞钙通道开放、细胞内Ca2+超载及CREB磷酸化增加等有关[5]。 NMDA受体拮抗剂及钙通道阻滞剂被认为可保护神经细胞免受继发性病理损害，对颅脑损伤具有治疗作用，而NMDA受体拮抗剂和钙通道阻滞剂能消除或削弱颅脑损伤引起的c-fos基因表达增加。本实验证实，脑损伤越重，脑内Fos 蛋白表达越强烈。因此，c-fos基因的表达， 可能介导了颅脑损伤的继发性病理损害。
, 百拇医药
c-fos基因表达后，通过形成AP-1 转录因子，发挥其对目的基因的调控作用[6]。 研究发现，颅脑损伤后，大鼠海马神经生长因子(NGF)mRNA的表达时程要晚于c-fos mRNA[7]，而NGF基因的启动子中存在AP-1转录因子结合位点，提示在海马的NGF基因，尤其是齿状回，可能是c-fos基因所调控的一个目的基因。最近的研究还发现，c-fos基因的表达增加可能预示着神经细胞的凋亡。因此，颅脑损伤引起的脑内c-fos基因表达增加， 对后期神经细胞的再生修复和神经通路重建可能具有重要的基因调控作用。
参 考 文 献
1 Dampney RA, Li YW, Hirooka Y，et al. Use of c-fos functional mapping to identify the central baroreceptor reflex pathway: advantages and limitations. Clin Exp Hypertens, 1995，17(2)：197
, 百拇医药
2 刘信龙, 江基尧. 国外液压颅脑伤模型的研究现状. 国外医学*神经病学神经外科学分册, 1994，21(2)： 78
3 Phillips LL, Belardo ET. Expression of c-fos in the hippocampus following mild and moderate fluid percussion brain injury. J Neurotrauma, 1992，9(4)：323
4 Amir S, Robinson B, Woodside B. Induction of Fos protein in the piriform cortex after brain injury in pentobarbitalanaesthetized rats: lack of effect of lactation. Brain Res, 1994，652(2)：341
, http://www.100md.com
5 Dash PK, Moore AN, Dixon CE. Spatial memory deficits, increased phosphorylation of the transcription factor CREB, and induction of the AP-1 complex following experimental brain injury. J Neurosci,1995，15(3 pt1)：2030
6 Yang K, Mu XS, Xue JJ， et al. Increased expression of c-fos mRNA and AP-1 transcription factors after cortical impact injury in rats. Brain Res, 1994， 664(1～2)：141
7 Herrera DG, Maysinger D, Gadient R，et al. Spreading depression induces c-fos-like immunoreactivity and NGF mRNA in the rat cerebral cortex. Brain Res, 1993，602(1)：99
(1997-06-10收稿，1997-12-27修回), 百拇医药
单位：
关键词：脑损伤；c-fos；基因表达
摘要 目的
摘要 目的：研究颅脑损伤后脑内Fos蛋白表达情况。方法：采用大鼠液压颅脑伤模型，应用免疫组织化学PAP 法和计算机图像分析技术，观测不同程度颅脑损伤后不同时间脑内Fos蛋白的表达情况。结果：伤后15 min脑内开始出现Fos蛋白表达，伤后1 h达高峰， 此后逐渐消退，伤后6 h基本恢复至正常水平。Fos 阳性神经元主要分布在损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和双侧海马齿状回，同侧海马较对侧显著。轻、中和重度脑损伤，Fos 蛋白表达水平有显著差异，损伤越重，表达越强烈。结论：颅脑损伤引起脑内特定区域c-fos 基因迅速和一过性表达增加，其表达水平与脑损伤程度有关。c-fos 基因的表达改变在颅脑损伤病理生理过程中具有重要的调控作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R 651.15
Induction of Fos protein in the brain of rats following fluid percussion brain injury
Ji Jianyong, Zhou Xiaoping, Wang Wenzhong, Xiang Zhenghua (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the induction of Fos protein in the brain of rats after traumatic brain injury. Methods: Using immunohistochemistry and computer image analysis, the induction of Fos protein in the brain of rats after fluid percussion brain injury in different degree was evaluated. Results: Robust Fos expression was observed in the ipsilateral cerebral cortex and bilateral hippocampus. The increased expression of Fos protein began 15 min after injury, peaked at 1 h postinjury, and subsided at 6 h postinjury. The intensity of label in the nuclei of Fos positive neurons and the numbers of Fos positive neurons were not equal after fluid percussion brain injury at different degree. The level of increased Fos protein following moderate brain injury was higher than that following mild injury (P<0.01), and the level following severe injury was higher than that following moderate injury (P<0.01). Conclusion: The pathobiologic changes at early intervals after traumatic brain injury may involve the alteration of c-fos gene expression and c-fos expression may be differentially regulated as a function of injury level.
, http://www.100md.com
Key words brain injury; c-fos; gene expression
c-fos原癌基因是目前研究最多的即早期基因(IEGs)之一,癫痫、脑缺血、疼痛等多种刺激,均可诱导c-fos基因在脑内出现早期短暂性快速表达增加[1]，但目前对c-fos基因在颅脑创伤中的研究甚少。为此，我们采用大鼠液压颅脑伤模型,用免疫组织化学和计算机图像分析技术,观测了c-fos基因的表达产物Fos核蛋白在颅脑损伤后的表达过程、脑内分布,以及Fos蛋白的表达水平与脑损伤程度间的相关性,初步探讨颅脑损伤后c-fos基因的表达调控机制和在脑损伤病理生理过程中的意义。
1 材料和方法
1.1 动物 雄性健康SD大鼠40只，体质量200～300 g，由上海计划生育研究所提供。
1.2 材料 动物液压颅脑伤致伤装置由美国弗吉尼亚大学医学工程部研制，长征医院神经外科提供。兔抗 Fos 蛋白抗体由Santa Cruz公司生产。PAP 复合物由上海医科大学病理解剖学教研室制备。 VIDAS 计算机图像分析系统为德国生产。
, 百拇医药
1.3 颅脑伤模型制作 采用大鼠液压颅脑伤模型[2]，造成SD大鼠轻、中、重度脑损伤的打击压力分别为103.5，155.3和217.4 kPa，打击时间均为21～24 ms。大鼠麻醉后，在前囟和人字缝尖连线中点偏左4 mm处颅骨钻孔，做直径为4.8 mm骨窗，硬脑膜外埋入打击管，牙托水泥固定。为避免手术和麻醉的干扰，待24 h后再行打击。
1.4 实验分组 SD大鼠随机分为 8组，每组5只，分别为中度脑损伤后15，30 min，1，2， 6 h组；轻度脑损伤后1 h组，重度脑损伤后1 h组和对照组。除对照组不予致伤外，其余各组处理相同。相同条件下，实验分批进行，每批含各组大鼠1只。
1.5 免疫组织化学染色 大鼠以1%戊巴比妥钠(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸经左心室插管至主动脉，依次灌注生理盐水200 ml，4% 多聚甲醛、0.3%饱和苦味酸、0.1 mol/L PB 混合液300 ml。在各时间点取出全脑，在同一固定液中4℃下固定6～12 h。然后浸入4℃ 20%蔗糖(用同一固定液配制)，直至组织块下沉。用冷冻切片机自视交叉处向后作连续冠状切片，片厚40 μm。按改进的Stermberger PAP法进行Fos免疫组织化学染色，细胞核被染成棕褐色为阳性结果。抗体的交叉性实验及空白对照实验结果均为阴性。
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1.6 观测项目 显微镜下观察并比较各组大鼠全脑冠状切片Fos免疫阳性(Fos-ir) 神经元的分布、密度和染色程度。为量化染色深浅，用计算机图像分析系统测定同一层面损伤侧海马齿状回Fos-ir神经元胞核的灰阶值(GREYM)，GREYM数值越小，表明染色越深，反映神经细胞内Fos蛋白表达量越多。
1.7 统计学处理 各组测定数据均用
±s 表示，组间差异比较用完全随机资料的t检验。2 结 果
2.1 光镜观察 轻度脑损伤组打击局部的蛛网膜下腔出血，无明显脑挫裂和脑实质内出血；中度组双侧大脑半球的蛛网膜下腔出血，以伤侧为主，损伤部位局灶性脑实质内出血及明显脑挫裂伤；重度组呈弥漫性蛛网膜下腔出血，伤侧广泛、严重脑挫裂，脑实质出血累及伤侧额顶叶皮质、皮质下，并可破入脑室。观察结果表明颅脑伤模型达到预期要求。
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2.2 免疫组织化学染色和计算机图像分析 各损伤组在损伤侧皮质和双侧海马均有Fos-ir神经元分布，以损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和海马齿状回最显著，对侧皮质无Fos-ir神经元。对照组未见染色，GREYM为189.4±4.1。轻度脑损伤后1 h组GREYM为160.5±4.5，与中度脑损伤后1 h组相比差异显著(P<0.01)。中度脑损伤后15 min和6 h组，Fos-ir神经元胞核呈浅棕褐色，分布稀疏，GREMY分别为177.7±6.4和184.4±4.8，15 min组与对照组相比差异显著(P<0.05)。中度脑损伤后1，2 h组，Fos-ir神经元胞核呈深棕褐色，分布密集；伤后30 min，1 h，2 h组的GREYM分别为160.4±4.2，126.9±5.6, 145.1±5.1，与对照组相比均差异显著(P<0.01)。重度脑损伤后1 h的GREYM为109.9±5.7，与中度脑损伤1 h组相比差异显著(P<0.01)。脑损伤程度越重，Fos-ir神经元的胞核染色越深，分布越密集。
3 讨 论
, 百拇医药
c-fos基因是最主要的即早期基因之一，在外界刺激后数十分钟内即开始表达，数十小时后恢复至正常水平，其表达产物Fos 核蛋白与c-jun基因的表达产物Jun核蛋白通过“亮氨酸拉链”形式形成Fos-Jun异源二聚体， 构成AP-1转录因子，进一步激活目的基因的表达。c-fos基因起偶联外界刺激-基因表达的作用，CNS通过c-fos基因的表达，把外界刺激信号转变为细胞内基因表达的刺激信号，从而对外界刺激作出应答。
本实验结果显示，大鼠脑液压伤后，在损伤侧皮质和双侧海马，尤其是损伤灶周围皮质、同侧梨状皮质和同侧海马齿状回出现Fos 蛋白表达增加。 计算机图像分析结果表明， 伤后15 min脑内即有Fos蛋白表达，伤后30 min表达水平显著增高，至伤后1 h达峰值，以后逐渐消退，伤后6 h基本恢复至正常水平。轻、中和重度脑损伤，Fos蛋白表达水平有显著差异(P<0.01)，脑损伤越重，表达越强烈，提示颅脑创伤与其他外界刺激因素一样，也可以诱导c-fos基因在脑内特定部位的早期短暂性表达增加，c-fos基因的表达改变， 可能参与了颅脑损伤早期的病理生理过程[3]。
, 百拇医药
颅脑损伤后c-fos 基因诱导表达的机制和在脑损伤病理生理过程中的意义，目前尚未得到完全阐明。颅脑损伤后，兴奋性氨基酸(EAA)、 乙酰胆碱等多种兴奋性神经递质在CNS过度释放， 神经细胞钙通道开放，细胞内Ca2+大量积聚，cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化增加， 最终导致血脑屏障(BBB)通透性增加、脑水肿、 神经细胞损害等继发性病理改变。近有研究显示，兴奋性神经递质通过激活谷氨酸-N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体或毒蕈碱受体，可诱导c-fos mRNA转录增加。c-fos mRNA及Fos核蛋白在脑内的分布与 NMDA受体的分布极为一致。NMDA受体拮抗剂MK-801能消除或削弱c-fos基因表达[4]，提示 EAA受体，尤其是谷氨酸-NMDA受体的激活，可能是诱导c-fos基因表达的关键因素。有研究表明，神经细胞内Ca2+超载，CREB磷酸化增加，也可介导c-fos基因表达，可见c-fos基因的诱导表达，还与神经细胞钙通道开放、细胞内Ca2+超载及CREB磷酸化增加等有关[5]。 NMDA受体拮抗剂及钙通道阻滞剂被认为可保护神经细胞免受继发性病理损害，对颅脑损伤具有治疗作用，而NMDA受体拮抗剂和钙通道阻滞剂能消除或削弱颅脑损伤引起的c-fos基因表达增加。本实验证实，脑损伤越重，脑内Fos 蛋白表达越强烈。因此，c-fos基因的表达， 可能介导了颅脑损伤的继发性病理损害。
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c-fos基因表达后，通过形成AP-1 转录因子，发挥其对目的基因的调控作用[6]。 研究发现，颅脑损伤后，大鼠海马神经生长因子(NGF)mRNA的表达时程要晚于c-fos mRNA[7]，而NGF基因的启动子中存在AP-1转录因子结合位点，提示在海马的NGF基因，尤其是齿状回，可能是c-fos基因所调控的一个目的基因。最近的研究还发现，c-fos基因的表达增加可能预示着神经细胞的凋亡。因此，颅脑损伤引起的脑内c-fos基因表达增加， 对后期神经细胞的再生修复和神经通路重建可能具有重要的基因调控作用。
参 考 文 献
1 Dampney RA, Li YW, Hirooka Y，et al. Use of c-fos functional mapping to identify the central baroreceptor reflex pathway: advantages and limitations. Clin Exp Hypertens, 1995，17(2)：197
, 百拇医药
2 刘信龙, 江基尧. 国外液压颅脑伤模型的研究现状. 国外医学*神经病学神经外科学分册, 1994，21(2)： 78
3 Phillips LL, Belardo ET. Expression of c-fos in the hippocampus following mild and moderate fluid percussion brain injury. J Neurotrauma, 1992，9(4)：323
4 Amir S, Robinson B, Woodside B. Induction of Fos protein in the piriform cortex after brain injury in pentobarbitalanaesthetized rats: lack of effect of lactation. Brain Res, 1994，652(2)：341
, http://www.100md.com
5 Dash PK, Moore AN, Dixon CE. Spatial memory deficits, increased phosphorylation of the transcription factor CREB, and induction of the AP-1 complex following experimental brain injury. J Neurosci,1995，15(3 pt1)：2030
6 Yang K, Mu XS, Xue JJ， et al. Increased expression of c-fos mRNA and AP-1 transcription factors after cortical impact injury in rats. Brain Res, 1994， 664(1～2)：141
7 Herrera DG, Maysinger D, Gadient R，et al. Spreading depression induces c-fos-like immunoreactivity and NGF mRNA in the rat cerebral cortex. Brain Res, 1993，602(1)：99
(1997-06-10收稿，1997-12-27修回), 百拇医药