神经胶质瘤基因治疗中旁观者效应的动物试验
作者：王 驹 张晓鹏 胡加飞 蔡如珏 袁国梁 许秀兰Δ 卢亦成 张光霁 朱 诚 顾健人Δ
单位：
关键词：神经胶质瘤；基因治疗；单纯疱疹病毒；胸苷激酶基因；旁观者效应
摘 要 目的摘 要 目的：探讨单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因逆转录病毒载体生产细胞(pLTKcSN/VPC)和更昔洛韦(Ganciclovir, GCV)系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用C6，C6XSN，C6TK及不同比例的TK(+)和TK(-)混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，5 d后动物腹腔内注射GCV溶液，剂量为15 mg/kg，每日2次，共10 d。细胞接种后3周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的肿瘤平均体积和成瘤率；肿瘤组织作病理检查。结果：50% C6TK和100% C6TK两组动物的成瘤率和肿瘤平均体积明显小于其余3组；病理检查发现50%C6TK组动物肿瘤灶内有明显的病理改变。结论：旁观者效应在动物体内也能介导GCV 的杀伤作用；含50% C6TK细胞组的肿瘤生长抑制率与100% C6TK组的肿瘤生长抑制率基本相同。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 739.41
In vivo studies of bystander effect in gene therapy to glioma
Wang Ju, Zhang Xiaopeng, Hu Jiafei, Cai Rujue, Yuan Guoliang, Xu Xiulan, Lu Yicheng, Zhang Guangji, Zhu Cheng, Gu Jianren (Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To evaluate the bystander effect of pLTKcSN/VPC and ganciclovir (GCV) system killing glioma in vivo. Methods: An animal model was established by implanting tumor cells directly into fight frontal lobe. The cells implanted were 100% C6, 100% C6XSN, 10% C6TK/90% C6, 50% C6TK/50% C6 and 100% C6TK. Five days after cell implantation, all animals were given GCV 15 mg/kg, bid and three weeks later, all animals were sacrificed and the tumor size was measured. Results: The tumor sizes of the 50% C6TK and 100% C6TK groups were obviously smaller than those of the other 3 groups. Pathological study showed that the changes in tumors of C6TK and 50% C6TK were different from those of the other 3 groups. Conclusion: The results indicate that bystander effect can interfere formation and inhibit the growth of glioma in rats.
, 百拇医药
Key words glioma; gene therapy; herpes simplex virus; thymidine kinase gene; bystander effect
在用单纯疱疹病毒-胸苷激酶-更昔洛韦(HSV-tk-GCV/VPC)系统治疗神经胶质瘤的研究中发现，死亡的并非都是转染上TK基因的肿瘤细胞，部分没有基因导入的肿瘤细胞也被杀死，这一现象被称为旁观者效应(bystander effect)。已有研究描述了旁观者效应在体外培养的TK(+)/TK(-)混合细胞体系中介导GCV杀伤作用的特征。本研究探讨旁观者效应在动物颅内神经胶质瘤模型中介导GCV杀伤作用的特征，为提高HSV-tk-GCV/VPC系统治疗神经胶质瘤的疗效提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验细胞 C6大鼠神经胶质瘤细胞系购自上海市细胞生物研究所。转染HSV Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因(pLTKcSN)和空载体(pLXSN)的C6细胞(C6TK和C6XSN)由上海市肿瘤研究所顾健人教授惠赠。
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1.2 实验动物 雄性SD大鼠，体质量250 g左右，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.3 试剂及药品 DMEM细胞培养液；0.1% 胰酶-0.01% EDTA消化液；PBS洗液；Roche公司产的更昔洛韦由上海市肿瘤研究所顾健人教授赠送，用双蒸水稀释成2 mg/ml的溶液。
1.4 实验器材 YJ-875型超净工作台，苏州净化设备厂产品；NU 2500型CO2培养箱，美国 NUAIR 公司产品；江湾I型立体定向仪，第二军医大学生理学教研室研制；微量注射泵，美国CMA公司产品。
1.5 实验方法 C6TK，C6XSN及C6细胞传代培养，实验时用PBS制成密度为2.5×106个/ml的细胞悬液。C6TK与C6细胞混合制成含10%和50% C6TK细胞的悬液, 密度同上。SD大鼠35只，随机分成5组，分别接种C6，C6XSN，10% C6TK/90% C6, 50% C6TK/50% C6和100% C6TK细胞悬液。动物以2%戊巴比妥麻醉后固定于江湾I型动物立体定向仪上，作顶部正中矢状切口，于右额部矢状缝旁开3 mm、冠状缝前1 mm处以直径1 mm的钻头钻一骨孔。抽取20 μl细胞悬液，经所钻骨孔垂直于颅骨外板进针至针尖距颅骨5 mm处。以1 μl/min的推注速度将细胞悬液接种于动物脑内，推注结束后留针于原位5 min。细胞接种后第5天起，腹腔注射GCV溶液，剂量为15 mg/kg，每日2次，共10 d。3周后动物处死，取脑组织，于10%福尔马林中固定24 h后，以锐利刀片于接种针眼处冠状面切开脑组织，以肉眼观察针道周围有肿瘤组织者为成瘤动物。以游标卡尺(精确度为0.02 mm) 测量肿瘤的左右径(宽)、上下径(高)和前后径(长)。计算各组肿瘤平均体积，脑内肿瘤体积按V=0.52×长×宽×高的公式计算。成瘤率＝成瘤动物数/动物总数。肿瘤组织作病理检查。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 一般状况 1只动物(C6XSN组)于术中死于麻醉剂过量。1只动物 (50% C6TK组)于手术后第1天死亡。其余动物在各自观察期中未见有进食和进水量减少、毛色变化及神经系统异常体征。
2.2 肿瘤体积 各组动物肿瘤体积平均值分别为C6组(92.22±80.10)mm3；C6XSN组(88.45±81.10)mm3；10%C6TK/90%C6组(89.51±36.44)mm3；50% C6TK/50%C6组(7.05±10.86)mm3；100% C6TK组(13.20±22.08)mm3。
2.3 动物存活数 各组动物3周存活数和成瘤数见表1。50% C6TK/50%C6和100% C6TK的两组动物肿瘤生长情况基本相同，而与10% C6TK/90%C6组及C6组有明显差别(P<0.01)。提示pLTKcSN/VPC及GCV系统在杀伤动物脑内恶性神经胶质瘤细胞的过程中存在明显的旁观者效应。
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2.4 病理检查 C6组的肿瘤组织与正常脑组织分界清楚，质地不均匀。光镜下见肿瘤细胞密集排列; 部分区域组织间隙内充满红细胞，部分区域呈片状坏死，细胞形态破坏，为缺血坏死。C6XSN，10%C6
表1 动物3周存活数和成瘤率
Tab 1 Numbers of rats surviving in the end of third
week and the rate of tumor growth
Group
n
Numbers of rats
developing
, http://www.100md.com
in tumor
Numbers
of rats
surviving
Rate of
tumor growth
(%)
C6
7
6
4
85.71
C6XSN
, 百拇医药
6
6
5
100.00
10% C6TK/ 90%C6
7
7
7
100.00
50% C6TK/
50%C6
6
3**
, 百拇医药
6
50.00
100% C6TK
7
4**
7
57.14
**P<0.01 vs 10% C6TK/90%C6 or C6 group
TK/90%C6组的肿瘤标本和显微镜下观察结果与C6组基本相同。50% C6TK/50%C6组的肿瘤组织切面明显小于C6组，肿瘤切面较C6组致密，与正常脑组织的分界较模糊。部分肉眼看不到成瘤的50% C6TK/50%C6组标本，在显微镜下可见肿瘤细胞呈局灶性分布，与正常脑组织间界限模糊，交界处有明显水肿，肿瘤灶内肿瘤细胞排列较疏松，有大量空泡，为变性坏死液化的肿瘤细胞; 部分肿瘤细胞核深染、固缩。所有50% C6TK/50%C6组的肿瘤灶内均未见有出血性改变。100% C6TK组镜下所见与50% C6TK/50%C6组所见基本相同。
, 百拇医药
3 讨 论
在动物实验中旁观者效应有抑制肿瘤细胞在动物脑内形成肿瘤的作用[1,2]。我们的实验中也观察到同样的结果，含有50% C6TK/50% C6接种后的成瘤率与100% C6TK 细胞接种后的成瘤率基本相同。这一结果提示，TK(+)细胞在活体中也可对TK(-)细胞介导GCV的毒性作用。目前用HSV-tk/VPC及GCV系统治疗实体瘤的方案中，基因导入多采用包装细胞原位注射方法，包装细胞及其产生的逆转录病毒的扩散距离有限。体外试验逆转录病毒感染肿瘤细胞的效率为10%～20%[3]，也有报道为5%[4]；另有报道体内试验中感染率为10%～70%[5]。所以对于较大体积的肿瘤，大多数距离穿刺针道较远的肿瘤细胞，既不能被转染TK基因，从而直接被 GCV杀伤，也不可能通过旁观者效应被消灭。故HSV-tk-GCV系统治疗实体瘤的疗效可能是有限的。另外，有报道用VPC直接注入肿瘤局部，再以GCV治疗的方法使动物脑内肿瘤消失，动物可长时间存活，脑内不再发生肿瘤灶； 而动物脑内混合接种TK(+)和TK(-)， 再以GCV治疗， 可不产生肿瘤灶， 但停用GCV一段时间后， 动物脑内又有肿瘤灶形成，这一现象的确切原因尚不清楚[6]。
, 百拇医药
最近有研究表明：向成瘤动物的肿瘤灶内注射TK(+)细胞，可以达到和注射逆转录病毒包装细胞同样的效果[7]。如果这一结论成立，那么就可以用患者自身的细胞转染TK基因后经体外培养扩增再注入肿瘤灶的方法，从而避免了用包装细胞带来的异种细胞注入人体后的不良反应和产生野生型病毒的风险。还有人将细胞间间隙连接蛋白Connexin43的cDNA转入原先间隙连接较少的星型胶质细胞，结果发现旁观者效应大大增强[8]。通过对旁观者效应的深入研究，可能会有助于找到一种能使旁观者效应发挥最大效率的手段, 使有限的载体包装细胞和转染阳性的肿瘤细胞在 GCV 作用下发挥最大的杀肿瘤效率，为该系统的临床应用提供实验依据。
参 考 文 献
1 Takamiya Y, Short MP, Moolten FL， et al. An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumor. J Neurosurg，1993,79(1):104
, http://www.100md.com
2 Ram Z, Walbridge S, Shawker T, et al. The effect of thymidin kinase transduction and ganciclovir therapy on tumor vasculature and growth of 9L gliomas in rats. J Neurosurg, 1994,81(1):256
3 Caruso M, Panis Y, Gagandeep S, et al. Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(26):7024
4 Boviatsis ET, Chase M, Wei MX, et al. Gene transfer into experimental brain tumors mediated by adenovirus herpes simplex virus and retrovirus vectors. Hum Gene Ther, 1994,5(1):183
, 百拇医药
5 Ram Z, Culver KW, Walbridge S, et al. In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats. Cancer Res, 1993,53(1):83
6 Colombo BM, Benedetti S, Ottolenghi S, et al. The “bystander effect”: association of U-87 cell death with ganciclovir-mediated apoptosis of nearby cells and lack of effect in athymic mice. Hum Gene Ther, 1995,6(3):763
7 Vrionis FD, Wu JK, Qi P, et al. Tumor cells expressing the herpes simplex virus-thymidine kinase gene in the treatment of Walker 256 meningeal neoplasia in rats. J Neurosurg, 1996,84(2):250
8 Shinoura N, Chen L, Wani MA, et al. Protein and messenger RNA expression of connexin 43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg, 1996,84(3):839
(1997-10-12收稿，1998-01-20修回), 百拇医药
单位：
关键词：神经胶质瘤；基因治疗；单纯疱疹病毒；胸苷激酶基因；旁观者效应
摘 要 目的摘 要 目的：探讨单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因逆转录病毒载体生产细胞(pLTKcSN/VPC)和更昔洛韦(Ganciclovir, GCV)系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用C6，C6XSN，C6TK及不同比例的TK(+)和TK(-)混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，5 d后动物腹腔内注射GCV溶液，剂量为15 mg/kg，每日2次，共10 d。细胞接种后3周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的肿瘤平均体积和成瘤率；肿瘤组织作病理检查。结果：50% C6TK和100% C6TK两组动物的成瘤率和肿瘤平均体积明显小于其余3组；病理检查发现50%C6TK组动物肿瘤灶内有明显的病理改变。结论：旁观者效应在动物体内也能介导GCV 的杀伤作用；含50% C6TK细胞组的肿瘤生长抑制率与100% C6TK组的肿瘤生长抑制率基本相同。
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中国图书资料分类法分类号 R 739.41
In vivo studies of bystander effect in gene therapy to glioma
Wang Ju, Zhang Xiaopeng, Hu Jiafei, Cai Rujue, Yuan Guoliang, Xu Xiulan, Lu Yicheng, Zhang Guangji, Zhu Cheng, Gu Jianren (Department of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To evaluate the bystander effect of pLTKcSN/VPC and ganciclovir (GCV) system killing glioma in vivo. Methods: An animal model was established by implanting tumor cells directly into fight frontal lobe. The cells implanted were 100% C6, 100% C6XSN, 10% C6TK/90% C6, 50% C6TK/50% C6 and 100% C6TK. Five days after cell implantation, all animals were given GCV 15 mg/kg, bid and three weeks later, all animals were sacrificed and the tumor size was measured. Results: The tumor sizes of the 50% C6TK and 100% C6TK groups were obviously smaller than those of the other 3 groups. Pathological study showed that the changes in tumors of C6TK and 50% C6TK were different from those of the other 3 groups. Conclusion: The results indicate that bystander effect can interfere formation and inhibit the growth of glioma in rats.
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Key words glioma; gene therapy; herpes simplex virus; thymidine kinase gene; bystander effect
在用单纯疱疹病毒-胸苷激酶-更昔洛韦(HSV-tk-GCV/VPC)系统治疗神经胶质瘤的研究中发现，死亡的并非都是转染上TK基因的肿瘤细胞，部分没有基因导入的肿瘤细胞也被杀死，这一现象被称为旁观者效应(bystander effect)。已有研究描述了旁观者效应在体外培养的TK(+)/TK(-)混合细胞体系中介导GCV杀伤作用的特征。本研究探讨旁观者效应在动物颅内神经胶质瘤模型中介导GCV杀伤作用的特征，为提高HSV-tk-GCV/VPC系统治疗神经胶质瘤的疗效提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验细胞 C6大鼠神经胶质瘤细胞系购自上海市细胞生物研究所。转染HSV Ⅰ型胸苷激酶(TK)基因(pLTKcSN)和空载体(pLXSN)的C6细胞(C6TK和C6XSN)由上海市肿瘤研究所顾健人教授惠赠。
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1.2 实验动物 雄性SD大鼠，体质量250 g左右，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.3 试剂及药品 DMEM细胞培养液；0.1% 胰酶-0.01% EDTA消化液；PBS洗液；Roche公司产的更昔洛韦由上海市肿瘤研究所顾健人教授赠送，用双蒸水稀释成2 mg/ml的溶液。
1.4 实验器材 YJ-875型超净工作台，苏州净化设备厂产品；NU 2500型CO2培养箱，美国 NUAIR 公司产品；江湾I型立体定向仪，第二军医大学生理学教研室研制；微量注射泵，美国CMA公司产品。
1.5 实验方法 C6TK，C6XSN及C6细胞传代培养，实验时用PBS制成密度为2.5×106个/ml的细胞悬液。C6TK与C6细胞混合制成含10%和50% C6TK细胞的悬液, 密度同上。SD大鼠35只，随机分成5组，分别接种C6，C6XSN，10% C6TK/90% C6, 50% C6TK/50% C6和100% C6TK细胞悬液。动物以2%戊巴比妥麻醉后固定于江湾I型动物立体定向仪上，作顶部正中矢状切口，于右额部矢状缝旁开3 mm、冠状缝前1 mm处以直径1 mm的钻头钻一骨孔。抽取20 μl细胞悬液，经所钻骨孔垂直于颅骨外板进针至针尖距颅骨5 mm处。以1 μl/min的推注速度将细胞悬液接种于动物脑内，推注结束后留针于原位5 min。细胞接种后第5天起，腹腔注射GCV溶液，剂量为15 mg/kg，每日2次，共10 d。3周后动物处死，取脑组织，于10%福尔马林中固定24 h后，以锐利刀片于接种针眼处冠状面切开脑组织，以肉眼观察针道周围有肿瘤组织者为成瘤动物。以游标卡尺(精确度为0.02 mm) 测量肿瘤的左右径(宽)、上下径(高)和前后径(长)。计算各组肿瘤平均体积，脑内肿瘤体积按V=0.52×长×宽×高的公式计算。成瘤率＝成瘤动物数/动物总数。肿瘤组织作病理检查。
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2 结 果
2.1 一般状况 1只动物(C6XSN组)于术中死于麻醉剂过量。1只动物 (50% C6TK组)于手术后第1天死亡。其余动物在各自观察期中未见有进食和进水量减少、毛色变化及神经系统异常体征。
2.2 肿瘤体积 各组动物肿瘤体积平均值分别为C6组(92.22±80.10)mm3；C6XSN组(88.45±81.10)mm3；10%C6TK/90%C6组(89.51±36.44)mm3；50% C6TK/50%C6组(7.05±10.86)mm3；100% C6TK组(13.20±22.08)mm3。
2.3 动物存活数 各组动物3周存活数和成瘤数见表1。50% C6TK/50%C6和100% C6TK的两组动物肿瘤生长情况基本相同，而与10% C6TK/90%C6组及C6组有明显差别(P<0.01)。提示pLTKcSN/VPC及GCV系统在杀伤动物脑内恶性神经胶质瘤细胞的过程中存在明显的旁观者效应。
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2.4 病理检查 C6组的肿瘤组织与正常脑组织分界清楚，质地不均匀。光镜下见肿瘤细胞密集排列; 部分区域组织间隙内充满红细胞，部分区域呈片状坏死，细胞形态破坏，为缺血坏死。C6XSN，10%C6
表1 动物3周存活数和成瘤率
Tab 1 Numbers of rats surviving in the end of third
week and the rate of tumor growth
Group
n
Numbers of rats
developing
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in tumor
Numbers
of rats
surviving
Rate of
tumor growth
(%)
C6
7
6
4
85.71
C6XSN
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6
6
5
100.00
10% C6TK/ 90%C6
7
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50% C6TK/
50%C6
6
3**
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50.00
100% C6TK
7
4**
7
57.14
**P<0.01 vs 10% C6TK/90%C6 or C6 group
TK/90%C6组的肿瘤标本和显微镜下观察结果与C6组基本相同。50% C6TK/50%C6组的肿瘤组织切面明显小于C6组，肿瘤切面较C6组致密，与正常脑组织的分界较模糊。部分肉眼看不到成瘤的50% C6TK/50%C6组标本，在显微镜下可见肿瘤细胞呈局灶性分布，与正常脑组织间界限模糊，交界处有明显水肿，肿瘤灶内肿瘤细胞排列较疏松，有大量空泡，为变性坏死液化的肿瘤细胞; 部分肿瘤细胞核深染、固缩。所有50% C6TK/50%C6组的肿瘤灶内均未见有出血性改变。100% C6TK组镜下所见与50% C6TK/50%C6组所见基本相同。
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3 讨 论
在动物实验中旁观者效应有抑制肿瘤细胞在动物脑内形成肿瘤的作用[1,2]。我们的实验中也观察到同样的结果，含有50% C6TK/50% C6接种后的成瘤率与100% C6TK 细胞接种后的成瘤率基本相同。这一结果提示，TK(+)细胞在活体中也可对TK(-)细胞介导GCV的毒性作用。目前用HSV-tk/VPC及GCV系统治疗实体瘤的方案中，基因导入多采用包装细胞原位注射方法，包装细胞及其产生的逆转录病毒的扩散距离有限。体外试验逆转录病毒感染肿瘤细胞的效率为10%～20%[3]，也有报道为5%[4]；另有报道体内试验中感染率为10%～70%[5]。所以对于较大体积的肿瘤，大多数距离穿刺针道较远的肿瘤细胞，既不能被转染TK基因，从而直接被 GCV杀伤，也不可能通过旁观者效应被消灭。故HSV-tk-GCV系统治疗实体瘤的疗效可能是有限的。另外，有报道用VPC直接注入肿瘤局部，再以GCV治疗的方法使动物脑内肿瘤消失，动物可长时间存活，脑内不再发生肿瘤灶； 而动物脑内混合接种TK(+)和TK(-)， 再以GCV治疗， 可不产生肿瘤灶， 但停用GCV一段时间后， 动物脑内又有肿瘤灶形成，这一现象的确切原因尚不清楚[6]。
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最近有研究表明：向成瘤动物的肿瘤灶内注射TK(+)细胞，可以达到和注射逆转录病毒包装细胞同样的效果[7]。如果这一结论成立，那么就可以用患者自身的细胞转染TK基因后经体外培养扩增再注入肿瘤灶的方法，从而避免了用包装细胞带来的异种细胞注入人体后的不良反应和产生野生型病毒的风险。还有人将细胞间间隙连接蛋白Connexin43的cDNA转入原先间隙连接较少的星型胶质细胞，结果发现旁观者效应大大增强[8]。通过对旁观者效应的深入研究，可能会有助于找到一种能使旁观者效应发挥最大效率的手段, 使有限的载体包装细胞和转染阳性的肿瘤细胞在 GCV 作用下发挥最大的杀肿瘤效率，为该系统的临床应用提供实验依据。
参 考 文 献
1 Takamiya Y, Short MP, Moolten FL， et al. An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumor. J Neurosurg，1993,79(1):104
, http://www.100md.com
2 Ram Z, Walbridge S, Shawker T, et al. The effect of thymidin kinase transduction and ganciclovir therapy on tumor vasculature and growth of 9L gliomas in rats. J Neurosurg, 1994,81(1):256
3 Caruso M, Panis Y, Gagandeep S, et al. Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(26):7024
4 Boviatsis ET, Chase M, Wei MX, et al. Gene transfer into experimental brain tumors mediated by adenovirus herpes simplex virus and retrovirus vectors. Hum Gene Ther, 1994,5(1):183
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5 Ram Z, Culver KW, Walbridge S, et al. In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats. Cancer Res, 1993,53(1):83
6 Colombo BM, Benedetti S, Ottolenghi S, et al. The “bystander effect”: association of U-87 cell death with ganciclovir-mediated apoptosis of nearby cells and lack of effect in athymic mice. Hum Gene Ther, 1995,6(3):763
7 Vrionis FD, Wu JK, Qi P, et al. Tumor cells expressing the herpes simplex virus-thymidine kinase gene in the treatment of Walker 256 meningeal neoplasia in rats. J Neurosurg, 1996,84(2):250
8 Shinoura N, Chen L, Wani MA, et al. Protein and messenger RNA expression of connexin 43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg, 1996,84(3):839
(1997-10-12收稿，1998-01-20修回), 百拇医药