人卵巢癌中肿瘤转移抑制基因nm23-H1编码蛋白的表达
作者：周晓宁 马大烈△ 王昭梅 沙金燕 崔 英 程挺干
单位：
关键词：肿瘤转移抑制基因；免疫组织化学；卵巢肿瘤；
摘要 目的摘要 目的：探讨人卵巢癌标本中，肿瘤转移抑制基因nm23-H1编码蛋白NDPK-A表达的临床意义及其与预后的关系。方法：应用免疫组织化学抗生蛋白链菌素-过氧化酶结合(S-P)法，检测58例人卵巢癌标本中nm23-H1蛋白水平。结果：nm23-H1蛋白的表达与患者手术时是否有淋巴结及大网膜转移相关(P<0.05)，但原发灶与转移灶间的阳性表达率相差不显著；与患者术后生存时间密切相关(P<0.01)，术后生存时间超过两年者，其阳性表达率明显高于不足两年者。结论：nm23-H1基因产物在人卵巢癌的扩散和转移过程中确实发挥抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达，可作为判断患者预后的有价值指标。
中国图书资料分类法分类号 R 737.1
, 百拇医药
Expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 in human ovarian carcinomas
Zhou Xiaoning, Ma Dalie, Wang Zhaomei, Sha Jinyan, Cui Ying, Chen Tingan(Department of Obstetrics and Gynecology, Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai,200433)
Abstract Objective: To evaluate the clinical significance of the expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 protein(NDPK-A) in human ovarian carcinomas, and its relation to the prognosis. Methods: The expression of nm23-H1 protein was detected in fifty-eight cases of human ovarian carcinomas by means of immunohistochemical technique streptavidin peroxidase conjugated method. Results: There was an inverse relationship between nm23-H1 protein level and metastasis foci both in lymph nodes and the great omentum (P<0.05). No significant difference of nm23-H1 protein positive rate was observed between primary and metastatic foci . The expression of nm23-H1 protein was closely related to the postoperation survival time (P<0.01). Higher positive rate was found in patients who survived more than two years after operation. Conclusion:nm23-H1 gene product plays an important role in suppressing metastasis of ovarian cancer. The expression of nm23-H1 protein in ovarian cancer tissues may serve as one of assessable factors for prognosis in patients with ovarian carcinoma.
, 百拇医药
Key words neoplasms metastasis suppressor gene; immunohistochemistry; ovarian carcinoma
恶性肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。目前已分离出几个能抑制肿瘤转移的候选基因,其中nm23最有应用前景。nm23是从鼠黑素瘤K-1735细胞株中分离得到的,在动物模型和人类肿瘤中证实与抑制转移相关[1]。人类基因组中存在着两个nm23基因,即nm23-H1和nm23-H2,它们均编码相对分子质量为1.7万的蛋白质,分别为核苷二磷酸激酶(NDPK)的A，B亚基。nm23-H1，nm23-H2各有独立的调控系统，并在肿瘤转移过程中起不同的作用,其中nm23-H1基因的表达与肿瘤转移的关系更为密切[2] 。本实验通过检测nm23-H1蛋白在人卵巢癌中的表达情况,探讨转移抑制基因nm23-H1在人卵巢癌中表达的临床意义及其与患者预后的相关性。
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1 材料和方法
1.1 标本 卵巢癌组织取自第二军医大学长海医院病理科1987～1996年存档的石蜡包埋标本,共58例。根据FIGO卵巢恶性肿瘤分期标准(1985)[3]进行分期,Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期33例,其中12例仅有原发病灶标本,7例因手术困难,仅有活检所取网膜病灶标本。所有病例均有完整病历及随访资料,其中33例随访时间超过2年。所有标本行连续切片,厚4 μm。
1.2 主要试剂及设备 鼠抗人NDPK-A单克隆抗体由美国Santa Cruze生化公司生产；通用型抗生蛋白链菌素-过氧化酶(S-P)试剂盒由美国Zymed公司生产；医用微波仪2D-Ⅱ,由上海中达医学应用研究所生产。
1.3 实验方法 石蜡切片常规脱蜡至水,充分洗涤; 微波抗原修复后冷却至室温; 滴加10%非免疫性马血清,室温下孵育10 min; 每张切片滴加50 μl抗DNPK-A单克隆抗体稀释液(1∶100),4℃孵育过夜；PBS液洗; 滴加生物素标记的通用型第二抗体稀释液(1∶120),室温下孵育30 min,PBS液洗; 滴加S-P复合物稀释液(1∶120),室温下孵育30 min,PBS液洗; DAB-H2O2显色,苏木素衬染,常规脱水、吹干封片。
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1.4 实验对照组设计 用PBS液替代特异性一抗作为阴性对照;用已知表达NDPK-A的肝癌组织作为阳性对照。
1.5 结果判定 阳性物质呈棕黄色颗粒分布于胞浆中，胞核经苏木素衬染为淡蓝色。肿瘤细胞无棕色反应为阴性(-)，肿瘤细胞内见棕黄色颗粒为阳性(+)，肿瘤细胞内见棕褐色颗粒为强阳性(++)。卵巢癌nm23-H1免疫组化的阳性、阴性染色结果见图1。
1.6 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
图1 卵巢癌nm23-H1免疫组化染色结果
Fig 1 Results of nm23-H1 immunohistochemistry stain in ovarian carcinoma
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A: negative×80; B: positive×80; C: positive×160
2 结 果
2.1 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌转移的关系 有淋巴结和(或)大网膜转移的26例卵巢癌原发灶标本中，免疫组化阳性染色共有17例，阳性率为65.4%；而无转移的25例中，阳性染色23例，阳性率为92%,两者相差显著(P<0.05)。
2.2 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌原发灶、转移灶的关系 33例发生淋巴结、大网膜转移的病例中，共有原发灶标本26例，转移灶标本21例。原发灶免疫组化阳性染色17例，阳性率为65.4%；转移灶阳性染色10例，阳性率为47.6%，两者相差不显著。
2.3 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌患者预后的关系 11例术后生存期<2年的患者中，其原发灶免疫组化阳性染色6例，阳性率为54.5%;而33例术后生存期>2年者，其原发灶阳性染色31例，阳性率为93.9%，两者相差非常显著(P<0.01)。
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3 讨 论
国内外学者从多个角度对nm23基因进行了深入的研究,但迄今为止,nm23基因是否就是转移抑制基因,其编码蛋白能否作为临床检测指标,以指导治疗方案的选择及对患者预后的判断,似乎仍无定论。一些研究采用抗NDPK多克隆抗体检测肿瘤组织中nm23基因的表达,常得出其编码蛋白NDPK的表达与肿瘤转移倾向无关的结论。而用抗NDPK-A单克隆抗体检测的研究结果,多显示nm23-H1基因编码蛋白NDPK-A的表达与肿瘤转移的发生呈负相关[4，5]。这说明混合性抗体中抗NDPK-B抗体及多克隆抗体中非特异性抗原抗体的结合,有可能掩盖了抗NDPK-A抗体的检测结果与转移倾向的相关性。
本研究采用抗NDPK-A单抗检测人卵巢癌中nm23-H1基因的表达,结果显示,nm23-H1的表达与患者术时有无淋巴结或大网膜转移呈负相关,两者相差显著。虽然实验结果也显示原发灶的阳性表达率高于转移灶，但经统计学处理后，两者相差却并不显著，这可能与两个因素有关：一是转移灶例数相对较少，二是与部分转移灶标本为网膜病灶而非淋巴结病灶有关。对乳腺癌的大量研究均发现,nm23的表达与淋巴结转移的发生呈负相关,且转移灶的表达低于原发灶。卵巢癌在此方面的研究尚无定论，其中多数结果与乳腺癌研究结论相似[5，6]。Mandai等[7]认为nm23表达与发生淋巴结转移呈负相关,但与其腹腔内种植无关。本实验由于标本限制,尚无法对此进一步研究。nm23-H1的表达与卵巢癌患者的预后亦密切相关。术后存活两年以上者,其原发灶中nm23-H1表达的阳性率明显高于术后存活不足两年者,两者相差非常显著。但术后存活期在两年之内者,其表达的阳性率则相差不显著。因此,我们认为,nm23-H1基因产物在人卵巢癌的转移扩散过程中确实发挥抑制作用,它在卵巢癌中的表达具有重要的预后意义,其编码蛋白作为临床检测指标,将对患者的预后判断提供有价值的信息。
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参 考 文 献
1 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80(3):200
2 Backer JM,Mendola CE,Kovesdi I,et al.Chromosomal localization and nucleoside diphosphate kinase activity of human metastasis-suppressor genes nm23-H1 and nm23-H2. Oncogene,1993,8(2):497
3 顾美皎. 女性生殖器肿瘤. 见:郑怀美主编. 妇产科学. 第3版. 北京：人民卫生出版社，1992，301
, 百拇医药
4 Tokunaga Y,Urano T,Furukawa K,et al.Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2,is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer,1993,55(1):66
5 Scambia G,Ferrandina G,Marone M,et al.nm23 in ovarian cancer:correlation with clinical outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters.J Clin Oncol,1996,14(2):334
6 Okubo T,Inokuna S,Takeda S,et al.Expression of nm23-H1 gene product in thyroid,ovary and breast cancers. Cell Biophys,1995,26(3):205
7 Mandai M,Konishi I,Koshiyama M,et al.Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas:correlation with clinicophathology,EGFR,c-erbB-2,and c-erbB-3 genes,and sex steroid receptor expression. Cancer Res,1994, 54(7):1825
(1997-08-29收稿，1998-03-02修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：肿瘤转移抑制基因；免疫组织化学；卵巢肿瘤；
摘要 目的摘要 目的：探讨人卵巢癌标本中，肿瘤转移抑制基因nm23-H1编码蛋白NDPK-A表达的临床意义及其与预后的关系。方法：应用免疫组织化学抗生蛋白链菌素-过氧化酶结合(S-P)法，检测58例人卵巢癌标本中nm23-H1蛋白水平。结果：nm23-H1蛋白的表达与患者手术时是否有淋巴结及大网膜转移相关(P<0.05)，但原发灶与转移灶间的阳性表达率相差不显著；与患者术后生存时间密切相关(P<0.01)，术后生存时间超过两年者，其阳性表达率明显高于不足两年者。结论：nm23-H1基因产物在人卵巢癌的扩散和转移过程中确实发挥抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达，可作为判断患者预后的有价值指标。
中国图书资料分类法分类号 R 737.1
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Expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 in human ovarian carcinomas
Zhou Xiaoning, Ma Dalie, Wang Zhaomei, Sha Jinyan, Cui Ying, Chen Tingan(Department of Obstetrics and Gynecology, Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai,200433)
Abstract Objective: To evaluate the clinical significance of the expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 protein(NDPK-A) in human ovarian carcinomas, and its relation to the prognosis. Methods: The expression of nm23-H1 protein was detected in fifty-eight cases of human ovarian carcinomas by means of immunohistochemical technique streptavidin peroxidase conjugated method. Results: There was an inverse relationship between nm23-H1 protein level and metastasis foci both in lymph nodes and the great omentum (P<0.05). No significant difference of nm23-H1 protein positive rate was observed between primary and metastatic foci . The expression of nm23-H1 protein was closely related to the postoperation survival time (P<0.01). Higher positive rate was found in patients who survived more than two years after operation. Conclusion:nm23-H1 gene product plays an important role in suppressing metastasis of ovarian cancer. The expression of nm23-H1 protein in ovarian cancer tissues may serve as one of assessable factors for prognosis in patients with ovarian carcinoma.
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Key words neoplasms metastasis suppressor gene; immunohistochemistry; ovarian carcinoma
恶性肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。目前已分离出几个能抑制肿瘤转移的候选基因,其中nm23最有应用前景。nm23是从鼠黑素瘤K-1735细胞株中分离得到的,在动物模型和人类肿瘤中证实与抑制转移相关[1]。人类基因组中存在着两个nm23基因,即nm23-H1和nm23-H2,它们均编码相对分子质量为1.7万的蛋白质,分别为核苷二磷酸激酶(NDPK)的A，B亚基。nm23-H1，nm23-H2各有独立的调控系统，并在肿瘤转移过程中起不同的作用,其中nm23-H1基因的表达与肿瘤转移的关系更为密切[2] 。本实验通过检测nm23-H1蛋白在人卵巢癌中的表达情况,探讨转移抑制基因nm23-H1在人卵巢癌中表达的临床意义及其与患者预后的相关性。
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1 材料和方法
1.1 标本 卵巢癌组织取自第二军医大学长海医院病理科1987～1996年存档的石蜡包埋标本,共58例。根据FIGO卵巢恶性肿瘤分期标准(1985)[3]进行分期,Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期33例,其中12例仅有原发病灶标本,7例因手术困难,仅有活检所取网膜病灶标本。所有病例均有完整病历及随访资料,其中33例随访时间超过2年。所有标本行连续切片,厚4 μm。
1.2 主要试剂及设备 鼠抗人NDPK-A单克隆抗体由美国Santa Cruze生化公司生产；通用型抗生蛋白链菌素-过氧化酶(S-P)试剂盒由美国Zymed公司生产；医用微波仪2D-Ⅱ,由上海中达医学应用研究所生产。
1.3 实验方法 石蜡切片常规脱蜡至水,充分洗涤; 微波抗原修复后冷却至室温; 滴加10%非免疫性马血清,室温下孵育10 min; 每张切片滴加50 μl抗DNPK-A单克隆抗体稀释液(1∶100),4℃孵育过夜；PBS液洗; 滴加生物素标记的通用型第二抗体稀释液(1∶120),室温下孵育30 min,PBS液洗; 滴加S-P复合物稀释液(1∶120),室温下孵育30 min,PBS液洗; DAB-H2O2显色,苏木素衬染,常规脱水、吹干封片。
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1.4 实验对照组设计 用PBS液替代特异性一抗作为阴性对照;用已知表达NDPK-A的肝癌组织作为阳性对照。
1.5 结果判定 阳性物质呈棕黄色颗粒分布于胞浆中，胞核经苏木素衬染为淡蓝色。肿瘤细胞无棕色反应为阴性(-)，肿瘤细胞内见棕黄色颗粒为阳性(+)，肿瘤细胞内见棕褐色颗粒为强阳性(++)。卵巢癌nm23-H1免疫组化的阳性、阴性染色结果见图1。
1.6 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
图1 卵巢癌nm23-H1免疫组化染色结果
Fig 1 Results of nm23-H1 immunohistochemistry stain in ovarian carcinoma
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A: negative×80; B: positive×80; C: positive×160
2 结 果
2.1 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌转移的关系 有淋巴结和(或)大网膜转移的26例卵巢癌原发灶标本中，免疫组化阳性染色共有17例，阳性率为65.4%；而无转移的25例中，阳性染色23例，阳性率为92%,两者相差显著(P<0.05)。
2.2 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌原发灶、转移灶的关系 33例发生淋巴结、大网膜转移的病例中，共有原发灶标本26例，转移灶标本21例。原发灶免疫组化阳性染色17例，阳性率为65.4%；转移灶阳性染色10例，阳性率为47.6%，两者相差不显著。
2.3 nm23-H1蛋白的表达与卵巢癌患者预后的关系 11例术后生存期<2年的患者中，其原发灶免疫组化阳性染色6例，阳性率为54.5%;而33例术后生存期>2年者，其原发灶阳性染色31例，阳性率为93.9%，两者相差非常显著(P<0.01)。
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3 讨 论
国内外学者从多个角度对nm23基因进行了深入的研究,但迄今为止,nm23基因是否就是转移抑制基因,其编码蛋白能否作为临床检测指标,以指导治疗方案的选择及对患者预后的判断,似乎仍无定论。一些研究采用抗NDPK多克隆抗体检测肿瘤组织中nm23基因的表达,常得出其编码蛋白NDPK的表达与肿瘤转移倾向无关的结论。而用抗NDPK-A单克隆抗体检测的研究结果,多显示nm23-H1基因编码蛋白NDPK-A的表达与肿瘤转移的发生呈负相关[4，5]。这说明混合性抗体中抗NDPK-B抗体及多克隆抗体中非特异性抗原抗体的结合,有可能掩盖了抗NDPK-A抗体的检测结果与转移倾向的相关性。
本研究采用抗NDPK-A单抗检测人卵巢癌中nm23-H1基因的表达,结果显示,nm23-H1的表达与患者术时有无淋巴结或大网膜转移呈负相关,两者相差显著。虽然实验结果也显示原发灶的阳性表达率高于转移灶，但经统计学处理后，两者相差却并不显著，这可能与两个因素有关：一是转移灶例数相对较少，二是与部分转移灶标本为网膜病灶而非淋巴结病灶有关。对乳腺癌的大量研究均发现,nm23的表达与淋巴结转移的发生呈负相关,且转移灶的表达低于原发灶。卵巢癌在此方面的研究尚无定论，其中多数结果与乳腺癌研究结论相似[5，6]。Mandai等[7]认为nm23表达与发生淋巴结转移呈负相关,但与其腹腔内种植无关。本实验由于标本限制,尚无法对此进一步研究。nm23-H1的表达与卵巢癌患者的预后亦密切相关。术后存活两年以上者,其原发灶中nm23-H1表达的阳性率明显高于术后存活不足两年者,两者相差非常显著。但术后存活期在两年之内者,其表达的阳性率则相差不显著。因此,我们认为,nm23-H1基因产物在人卵巢癌的转移扩散过程中确实发挥抑制作用,它在卵巢癌中的表达具有重要的预后意义,其编码蛋白作为临床检测指标,将对患者的预后判断提供有价值的信息。
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参 考 文 献
1 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80(3):200
2 Backer JM,Mendola CE,Kovesdi I,et al.Chromosomal localization and nucleoside diphosphate kinase activity of human metastasis-suppressor genes nm23-H1 and nm23-H2. Oncogene,1993,8(2):497
3 顾美皎. 女性生殖器肿瘤. 见:郑怀美主编. 妇产科学. 第3版. 北京：人民卫生出版社，1992，301
, 百拇医药
4 Tokunaga Y,Urano T,Furukawa K,et al.Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2,is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer,1993,55(1):66
5 Scambia G,Ferrandina G,Marone M,et al.nm23 in ovarian cancer:correlation with clinical outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters.J Clin Oncol,1996,14(2):334
6 Okubo T,Inokuna S,Takeda S,et al.Expression of nm23-H1 gene product in thyroid,ovary and breast cancers. Cell Biophys,1995,26(3):205
7 Mandai M,Konishi I,Koshiyama M,et al.Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas:correlation with clinicophathology,EGFR,c-erbB-2,and c-erbB-3 genes,and sex steroid receptor expression. Cancer Res,1994, 54(7):1825
(1997-08-29收稿，1998-03-02修回), http://www.100md.com