微波盖玻片法免疫组织化学技术的临床病理应用
作者：郑青渝 马大烈 黄 玲 魏建丽
单位：
关键词：微波；免疫组织化学；病理技术
第二军医大学学报980229
微波免疫组织化学技术大大缩短了染色时间[1，2]，提高了标记抗体的特异性和敏感性[3，4]，但也存在一些亟需解决的问题。本研究将微波盖玻片技术应用于Envision二步法和Epos一步法免疫组织化学染色中，以防止抗体液过度挥发，减少抗体实际用量，降低标记成本，避免组织片边缘反应，增强染色的均匀性，为进一步推广微波一步法奠定基础。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 ZD-Ⅱ医用微波仪，由上海中达医学研究所生产。20种特异性单克隆和多克隆抗体，13种Epos酶标记特异性抗体及Envision试剂均为丹麦Dako公司产品。特异性抗体稀释度和种类见表1。
, http://www.100md.com
1.2 组织标本 选择已知阳性标记的各种良、恶性肿瘤标本，经10%中性甲醛微波常规固定5 min。常规脱水、石蜡包埋、切片(厚4 μm)。
1.3 操作方法 组织切片脱蜡至水，PBS洗涤，微波抗原修复，切片入PBS液内，微波中功率辐射2 min，PBS液洗涤。
1.3.1 Envision二步法 每张切片加25 μl，按说明书稀释特异性抗体，加上盖玻片后放入湿盒内，置微波中功率(约350 W)辐射55 s。取下盖玻片，PBS洗2 min×2次，滴加25 μl Envision试剂，加盖玻片，置微波中功率辐射55 s，取下玻片，PBS洗涤。
1.3.2 Epos一步法 每张组织切片滴加25 μl酶标记特异性抗体，加盖玻片，置湿盒内，采用微波中功率辐射1 min。取下盖玻片，PBS洗涤。常规DAB-H2O2显示10 min，苏木素复染，吹干后封片。
, 百拇医药
1.3.3 对照 每种标记物均采用标准方法做对照，即每张切片滴加50 μl抗体液，但不加盖玻片，其余操作步骤与玻片法相同。
2 结 果
微波盖玻片法与标准法阳性结果比较见表1。从表中可以看出， Envision、 Epos标准法及盖玻片法均显示较强的特
表1 微波盖玻片法与标准法阳性结果比较 抗体名称
稀释度
Envision二步法
Epos一步法
标准法
盖玻片法
, http://www.100md.com 标准法
盖玻片法
CK
1∶100
3(0)
3(0)
3(0)
3(0)
EMA
1∶50
2(0)
2(0)
2(0)
, 百拇医药
2(0)
ESA
1∶100
2(0)
2(0)
LCA
1∶100
3(1)
3(0)
3(0)
3(0)
L26
1∶50
, 百拇医药
3(0)
3(0)
3(0)
3(0)
T-cell
1∶50
2(1)
2(0)
2(0)
2(0)
P53
1∶50
2(0)
, http://www.100md.com
2(0)
PCNA
1∶50
2(1)
2(0)
3(1)
3(0)
VI
1∶100
2(0)
2(0)
2(1)
2(0)
, http://www.100md.com
SMA
1∶300
3(0)
3(0)
3(0)
3(0)
MA
1∶200
2(1)
2(1)
2(1)
3(1)
S-100
, http://www.100md.com
1∶500
2(1)
2(0)
2(1)
2(0)
NSE
1∶100
2(0)
2(0)
2(1)
2(0)
GFAP
1∶400
, http://www.100md.com
3(0)
3(0)
3(1)
3(0)
MBP
1∶200
2(1)
2(1)
Chr
1∶150
2(1)
2(0)
HMB45
, http://www.100md.com
1∶100
2(1)
2(0)
2(1)
3(0)
HBsAg
1∶100
2(1)
2(1)
MAC
1∶50
2(1)
2(0)
, 百拇医药
Lyso
1∶400
2(1)
2(0)
阳性强度分3级：1级为弱阳性；2级为阳性；3级为强阳性。括号内为背景和边缘反应，分4级：0为无背景；1级为轻度；2级为中度；3级为重度
异性，全部染色切片呈阳性或强阳性。虽然盖玻片法所用特异性抗体只有标准法的一半，但特异性并未受到影响，仍显示出阳性或强阳性的结果。两种方法还显示出敏感性较高，抗原定位准确，分布于细胞浆内(如CK，VI，SMA等)、细胞核(如PCNA，p53)，少数分布于细胞膜上(如LCA，EMA)，所不同的是，标准法染色切片大部分都有轻度背景染色或边缘反应，Envision标准法为11/20，Epos标准法为7/13，而应用盖玻片法的染色切片仅少数有轻度背景染色，Envision盖玻片法为3/20，Epos盖玻片法为1/13，且无边缘反应。
, 百拇医药
3 讨 论
在微波免疫组织化学标记中应用盖玻片方法具有以下特点：(1)节省抗体、降低成本，盖玻片法抗体的实际用量比标准法减少了50%。(2)防止切片干燥[5]。(3)切片染色均匀。(4)无边缘反应，应用盖玻片技术盖玻片范围明显大于组织范围，因而防止了切片的边缘反应。
本实验所用20种试剂的组织切片均应用了微波抗原修复。国内外新的观点认为，经甲醛固定的石蜡标本，部分抗原决定簇被封闭或蛋白质与蛋白质间发生交联，使免疫组织化学标记敏感性明显降低[6]。应用微波的热效应和高频电磁波作用，使某些被封闭的抗原决定簇得以重新暴露，并打开蛋白质间交联键，使标记敏感性明显提高。但在抗原抗体标记时，温度应控制在37℃以下，温度过高会破坏抗体，影响标记效果。加盖玻片时动作要轻，尽量避免产生气泡，切忌加压，使组织与盖玻片间能保持一定量的抗体液。
中国图书资料分类法分类号 R 361.1
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Leong AS, Milios J. Rapid immunoperoxidase staining of lymphocyte antigens using microwave irradiation. J Pathol, 1986, 148(2)：183
2 Chiu KY, Chan KW. Use of microwaves for rapid immunoperoxidase staining of paraffin sections. Med Lab Sci, 1987, 44(1): 3
3 马大烈，詹洲. 快速免疫组织化学标记技术-微波PAP法及其应用. 解放军医学杂志，1991，16(3)：211
4 马大烈，詹洲. 快速微波免疫组织化学技术. 中华病理学杂志，1992，21(1)：56
5 马大烈，詹洲. 微波在免疫组织化学技术中的应用. 临床与实验病理学杂志，1992，8(1)：55
6 Boon ME, Kok LP. Microwaves for immunohistochemistry. Micron, 1994，25(2):151
(1997-08-11收稿，1997-11-11修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：微波；免疫组织化学；病理技术
第二军医大学学报980229
微波免疫组织化学技术大大缩短了染色时间[1，2]，提高了标记抗体的特异性和敏感性[3，4]，但也存在一些亟需解决的问题。本研究将微波盖玻片技术应用于Envision二步法和Epos一步法免疫组织化学染色中，以防止抗体液过度挥发，减少抗体实际用量，降低标记成本，避免组织片边缘反应，增强染色的均匀性，为进一步推广微波一步法奠定基础。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂 ZD-Ⅱ医用微波仪，由上海中达医学研究所生产。20种特异性单克隆和多克隆抗体，13种Epos酶标记特异性抗体及Envision试剂均为丹麦Dako公司产品。特异性抗体稀释度和种类见表1。
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1.2 组织标本 选择已知阳性标记的各种良、恶性肿瘤标本，经10%中性甲醛微波常规固定5 min。常规脱水、石蜡包埋、切片(厚4 μm)。
1.3 操作方法 组织切片脱蜡至水，PBS洗涤，微波抗原修复，切片入PBS液内，微波中功率辐射2 min，PBS液洗涤。
1.3.1 Envision二步法 每张切片加25 μl，按说明书稀释特异性抗体，加上盖玻片后放入湿盒内，置微波中功率(约350 W)辐射55 s。取下盖玻片，PBS洗2 min×2次，滴加25 μl Envision试剂，加盖玻片，置微波中功率辐射55 s，取下玻片，PBS洗涤。
1.3.2 Epos一步法 每张组织切片滴加25 μl酶标记特异性抗体，加盖玻片，置湿盒内，采用微波中功率辐射1 min。取下盖玻片，PBS洗涤。常规DAB-H2O2显示10 min，苏木素复染，吹干后封片。
, 百拇医药
1.3.3 对照 每种标记物均采用标准方法做对照，即每张切片滴加50 μl抗体液，但不加盖玻片，其余操作步骤与玻片法相同。
2 结 果
微波盖玻片法与标准法阳性结果比较见表1。从表中可以看出， Envision、 Epos标准法及盖玻片法均显示较强的特
表1 微波盖玻片法与标准法阳性结果比较 抗体名称
稀释度
Envision二步法
Epos一步法
标准法
盖玻片法
, http://www.100md.com 标准法
盖玻片法
CK
1∶100
3(0)
3(0)
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EMA
1∶50
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, 百拇医药
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ESA
1∶100
2(0)
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LCA
1∶100
3(1)
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3(0)
L26
1∶50
, 百拇医药
3(0)
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T-cell
1∶50
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P53
1∶50
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PCNA
1∶50
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VI
1∶100
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SMA
1∶300
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MA
1∶200
2(1)
2(1)
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3(1)
S-100
, http://www.100md.com
1∶500
2(1)
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NSE
1∶100
2(0)
2(0)
2(1)
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GFAP
1∶400
, http://www.100md.com
3(0)
3(0)
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3(0)
MBP
1∶200
2(1)
2(1)
Chr
1∶150
2(1)
2(0)
HMB45
, http://www.100md.com
1∶100
2(1)
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HBsAg
1∶100
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MAC
1∶50
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Lyso
1∶400
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阳性强度分3级：1级为弱阳性；2级为阳性；3级为强阳性。括号内为背景和边缘反应，分4级：0为无背景；1级为轻度；2级为中度；3级为重度
异性，全部染色切片呈阳性或强阳性。虽然盖玻片法所用特异性抗体只有标准法的一半，但特异性并未受到影响，仍显示出阳性或强阳性的结果。两种方法还显示出敏感性较高，抗原定位准确，分布于细胞浆内(如CK，VI，SMA等)、细胞核(如PCNA，p53)，少数分布于细胞膜上(如LCA，EMA)，所不同的是，标准法染色切片大部分都有轻度背景染色或边缘反应，Envision标准法为11/20，Epos标准法为7/13，而应用盖玻片法的染色切片仅少数有轻度背景染色，Envision盖玻片法为3/20，Epos盖玻片法为1/13，且无边缘反应。
, 百拇医药
3 讨 论
在微波免疫组织化学标记中应用盖玻片方法具有以下特点：(1)节省抗体、降低成本，盖玻片法抗体的实际用量比标准法减少了50%。(2)防止切片干燥[5]。(3)切片染色均匀。(4)无边缘反应，应用盖玻片技术盖玻片范围明显大于组织范围，因而防止了切片的边缘反应。
本实验所用20种试剂的组织切片均应用了微波抗原修复。国内外新的观点认为，经甲醛固定的石蜡标本，部分抗原决定簇被封闭或蛋白质与蛋白质间发生交联，使免疫组织化学标记敏感性明显降低[6]。应用微波的热效应和高频电磁波作用，使某些被封闭的抗原决定簇得以重新暴露，并打开蛋白质间交联键，使标记敏感性明显提高。但在抗原抗体标记时，温度应控制在37℃以下，温度过高会破坏抗体，影响标记效果。加盖玻片时动作要轻，尽量避免产生气泡，切忌加压，使组织与盖玻片间能保持一定量的抗体液。
中国图书资料分类法分类号 R 361.1
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Leong AS, Milios J. Rapid immunoperoxidase staining of lymphocyte antigens using microwave irradiation. J Pathol, 1986, 148(2)：183
2 Chiu KY, Chan KW. Use of microwaves for rapid immunoperoxidase staining of paraffin sections. Med Lab Sci, 1987, 44(1): 3
3 马大烈，詹洲. 快速免疫组织化学标记技术-微波PAP法及其应用. 解放军医学杂志，1991，16(3)：211
4 马大烈，詹洲. 快速微波免疫组织化学技术. 中华病理学杂志，1992，21(1)：56
5 马大烈，詹洲. 微波在免疫组织化学技术中的应用. 临床与实验病理学杂志，1992，8(1)：55
6 Boon ME, Kok LP. Microwaves for immunohistochemistry. Micron, 1994，25(2):151
(1997-08-11收稿，1997-11-11修回)
, 百拇医药