骨折愈合过程中转化生长因子β1表达的实验研究
作者：姬洪全 党耕町 马庆军 王志国
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：转化生长因子β；骨折愈合；动物，实验
中华外科杂志980203 【摘要】 目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在骨折局部的产生和表达量的变化，了解并探讨TGF-β1对骨折愈合的调节作用。方法 用免疫组织化学方法检测大鼠肋骨骨折愈合不同时期TGF-β1的表达。结果 在急性损伤反应期, 血肿延伸范围内的骨膜内层细胞有少量表达；在膜内成骨期，成骨细胞表达量较高，骨膜细胞表达量少；在软骨形成期，成熟软骨细胞表达量最高；在软骨内成骨期，肥大软骨细胞不表达，成骨细胞表达量较高。结论 TGF-β1表达量和组织学分布的变化与骨折愈合过程中相应的组织学变化密切相关, 而且与相应细胞的功能状态相关，说明TGF-β1是调节骨折愈合过程的重要因子。
, 百拇医药
The experimental research of transforming growth factor-β1 expression during fracture healing Ji Hongquan, Dang Gengting, Ma Qingjun,et al.Department of Orthopaedics,Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083.
【Abstract】 Objective To observe the effect of TGF-β1 in the regulation of fracture healing.Method The expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)in different period of fracture healing was investigated by immunohistochemitry.Results It was found that the expression of TGF-β1 changed in different period.The cells in the cambial layer of the periostlum showed low or negative signal in the immediate injury response period. The osteoblasts differentiated from the periosteum cells stained strongly in the intramembranous ossification period, and the differentiated chondrocytes stained most strongly in the chondrogenesis period. The hypertrophic chondrocytes showed negative signal and the osteoblasts stained strongly in the endochondral ossification period.These results suggested that the expression of TGF-β1 was closely related to the proliferation and differentiation state of repair cells.Conclusion TGF-β1 is intimately involved in the control of fracture healing.
, 百拇医药
【Key words】 Transforming growth factor beta Fracture healing Animals,laboratory
近年来，随着细胞生物学和分子生物学的发展，可以从细胞和分子水平解释创伤愈合的调控机理。而研究骨折愈合不同阶段相关生长因子的表达情况，则是阐明骨折愈合分子机理的重要步骤。我们应用免疫组化方法研究了转化生长因子β1(TGF-β1)在骨折愈合不同阶段的表达，现报告如下。
材料与方法
1.骨折模型的制作：成年Wistar大鼠，体重250～300g，3%戊巴比妥纳腹腔麻醉，胸背部常规备皮、消毒，双侧胸部纵行切口，暴露肋骨，确定双侧第6、8肋骨，在椎旁肌外缘处以齿镊固定肋骨，注意保护胸膜，用钝头直剪刀横断肋骨，术后分层缝合切口。
, 百拇医药 2.标本的取材制作：根据Bolander骨折分期[1]：Ⅰ期：损伤反应期；Ⅱ期：膜内成骨期；Ⅲ期：软骨形成期；Ⅳ期：软骨内成骨期。分别于骨折术后2、5、10、15天断髓处死动物，取不同骨折分期标本。开胸取下骨折的肋骨，修剪周围的软组织，用4%多聚甲醛固定，4℃过夜，用0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗，置入20%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)pH值7.4的磷酸缓冲液中，室温下脱钙10天，中间换液一次，用0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡4小时，软蜡包埋。切片厚度5μm，37℃烤片过夜。
3.免疫组织化学研究：实验所用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SPTM)试剂盒由美国ZYMED公司提供。切片经二甲苯脱蜡4小时，梯度酒精水化，0.3%过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶，5%羊血清封闭后，加1∶100稀释的兔抗鼠TGF-β1抗体(美国Santa Cruz公司)，4℃过夜，复温冲洗后加1∶300稀释的羊抗兔抗体，37℃孵育30分钟，冲洗后再加1∶300稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，37℃孵育30分钟，冲洗后用二氨基联苯胺(DAB)显色，梯度酒精脱水二甲苯透明后封片。
, 百拇医药
结 果
1.损伤反应期：骨折邻近的骨膜内层细胞浅着色或不显色(图1)。
2.膜内成骨期：邻近骨折处的骨膜内层细胞分裂增殖并向成骨细胞分化，骨膜内层细胞和成骨细胞显色，成骨细胞着色较深(图2)。
3.软骨形成期：骨折断端间的肉芽组织中出现软骨细胞团，幼稚的软骨细胞显色浅，成熟软骨细胞着色深(图3)。
4.软骨内成骨期：在膜内成骨区和软骨区间形成钙化前缘。附近的软骨细胞肥大，基质钙化，成骨细胞随血管进入钙化的软骨基质，肥大的软骨细胞不显色，成骨细胞着色较深(图4)。
讨 论
本研究的主要目的在于了解TGF-β1在骨折局部的来源和分布，其表达量和定位的改变与组织学变化的关系。实验结果表明，在大鼠骨折愈合过程不同阶段，TGF-β1在骨折局部始终存在，但来源不同。早期主要由血小板释放，后期则主要由修复细胞自身产生，其中软骨细胞表达量最多，这与国外的研究结果相同[2]。国内有关研究资料表明用提纯的外源性TGF-β局部注射，可诱导小鼠股骨膜下成骨[3]。
, 百拇医药
在损伤反应期，血肿形成并凝固时，血小板脱颗粒，释放TGF-β1。骨膜生发层细胞受刺激而分裂增殖，组织学上可见血肿延伸范围与骨膜增生范围一致。骨膜细胞自身也产生少量TGF-β1，与软组织创伤修复类似，早期肉芽组织中的单核巨噬细胞也分泌TGF-β1。上述来源的TGF-β1趋化炎性细胞，促进修复细胞分裂增殖，并协调众多细胞因子的作用，为进一步修复做好准备。
在膜内成骨期，受TGF-β1等因子刺激而分裂增殖的骨膜细胞向成骨细胞分化，以膜内成骨的方式形成骨组织。成骨细胞在分泌骨基质的同时，也能产生TGF-β1。骨折愈合首先启动的是膜内成骨过程。有关研究结果表明在大鼠骨膜下注射外源性TGF-β能诱导膜内成骨[4]。
在软骨形成期，肉芽组织中出现软骨细胞团，并逐渐扩大，最终取代肉芽组织而连接骨断端。有关研究已证明TGF-β能诱导间质细胞向软骨细胞分化，并形成软骨组织[5]。在大鼠骨膜下注射外源性TGF-β能在局部诱导软骨形成[6]。在此期，TGF-β1主要来源于软骨细胞自身的合成，正如实验中所见软骨细胞和间质细胞都显色，成熟软骨细胞显色最深。
, 百拇医药
在软骨内成骨期，钙化的软骨基质中有TGF-β1储存，破骨细胞在进行吸收时活化基质中的TGF-β，这有助于前成骨细胞向成骨细胞分化。此外，TGF-β1尚能趋化成骨细胞到达成骨部位，成骨细胞产生的TGF-β1将储存于骨基质中。在骨痂的塑建和重建过程中，局部释放的TGF-β协调骨吸收和骨形成过程，使骨折修复并恢复原先骨的解剖结构。
在骨折愈合的不同阶段，产生TGF-β1的细胞是不同的，表达量也不同，上述变化与组织学改变密切相关。而且与相应细胞的功能状态密切相关，这说明TGF-β1是参与调节骨折修复的重要因子。但机体对骨折愈合过程的调控是复杂的，单一因子不能解释其全部内容。关于骨折愈合过程中其它相关因子的表达，以及生长因子局部应用促进骨折愈合等问题，尚待进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Bolander ME.Regulation of fracture repair by growth factors.Proc Soc Exp Bio Med,1992,200:165-170.
2 Joyce ME,Jingushi S,Bolander ME.Transforming growth factor-β in the regulation of fracture repair.Orthop Clin North Am,1990,21:199-209.
3 孙玉鹏，陆裕朴，胡蕴玉，等.牛血小板TGF-β提取纯化及其诱导小鼠股骨成骨作用.中华骨科杂志，1995,15:610-613.
4 Noda M，Camilliere JJ.In vivo stimulation of bone formation by transforming growth factor-β.Endocrinology,1989,124:2991-2994.
, 百拇医药
5 Seyedin SM,Thomas TC,Thompsom AY,et al.Purification and characterization of two cartilage-inducing factors from bovine demineralized bone.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:2267-2271.
6 Joyce ME,Roberts AB,Sporn MB,et al.Transforming growth factor-β and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur.J Cell Biol,1990,110:2195-2207.
(收稿：1997-04-28 修回：1997-11-14), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：转化生长因子β；骨折愈合；动物，实验
中华外科杂志980203 【摘要】 目的 观察转化生长因子-β1(TGF-β1)在骨折局部的产生和表达量的变化，了解并探讨TGF-β1对骨折愈合的调节作用。方法 用免疫组织化学方法检测大鼠肋骨骨折愈合不同时期TGF-β1的表达。结果 在急性损伤反应期, 血肿延伸范围内的骨膜内层细胞有少量表达；在膜内成骨期，成骨细胞表达量较高，骨膜细胞表达量少；在软骨形成期，成熟软骨细胞表达量最高；在软骨内成骨期，肥大软骨细胞不表达，成骨细胞表达量较高。结论 TGF-β1表达量和组织学分布的变化与骨折愈合过程中相应的组织学变化密切相关, 而且与相应细胞的功能状态相关，说明TGF-β1是调节骨折愈合过程的重要因子。
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The experimental research of transforming growth factor-β1 expression during fracture healing Ji Hongquan, Dang Gengting, Ma Qingjun,et al.Department of Orthopaedics,Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083.
【Abstract】 Objective To observe the effect of TGF-β1 in the regulation of fracture healing.Method The expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)in different period of fracture healing was investigated by immunohistochemitry.Results It was found that the expression of TGF-β1 changed in different period.The cells in the cambial layer of the periostlum showed low or negative signal in the immediate injury response period. The osteoblasts differentiated from the periosteum cells stained strongly in the intramembranous ossification period, and the differentiated chondrocytes stained most strongly in the chondrogenesis period. The hypertrophic chondrocytes showed negative signal and the osteoblasts stained strongly in the endochondral ossification period.These results suggested that the expression of TGF-β1 was closely related to the proliferation and differentiation state of repair cells.Conclusion TGF-β1 is intimately involved in the control of fracture healing.
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【Key words】 Transforming growth factor beta Fracture healing Animals,laboratory
近年来，随着细胞生物学和分子生物学的发展，可以从细胞和分子水平解释创伤愈合的调控机理。而研究骨折愈合不同阶段相关生长因子的表达情况，则是阐明骨折愈合分子机理的重要步骤。我们应用免疫组化方法研究了转化生长因子β1(TGF-β1)在骨折愈合不同阶段的表达，现报告如下。
材料与方法
1.骨折模型的制作：成年Wistar大鼠，体重250～300g，3%戊巴比妥纳腹腔麻醉，胸背部常规备皮、消毒，双侧胸部纵行切口，暴露肋骨，确定双侧第6、8肋骨，在椎旁肌外缘处以齿镊固定肋骨，注意保护胸膜，用钝头直剪刀横断肋骨，术后分层缝合切口。
, 百拇医药 2.标本的取材制作：根据Bolander骨折分期[1]：Ⅰ期：损伤反应期；Ⅱ期：膜内成骨期；Ⅲ期：软骨形成期；Ⅳ期：软骨内成骨期。分别于骨折术后2、5、10、15天断髓处死动物，取不同骨折分期标本。开胸取下骨折的肋骨，修剪周围的软组织，用4%多聚甲醛固定，4℃过夜，用0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗，置入20%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)pH值7.4的磷酸缓冲液中，室温下脱钙10天，中间换液一次，用0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡4小时，软蜡包埋。切片厚度5μm，37℃烤片过夜。
3.免疫组织化学研究：实验所用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SPTM)试剂盒由美国ZYMED公司提供。切片经二甲苯脱蜡4小时，梯度酒精水化，0.3%过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶，5%羊血清封闭后，加1∶100稀释的兔抗鼠TGF-β1抗体(美国Santa Cruz公司)，4℃过夜，复温冲洗后加1∶300稀释的羊抗兔抗体，37℃孵育30分钟，冲洗后再加1∶300稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，37℃孵育30分钟，冲洗后用二氨基联苯胺(DAB)显色，梯度酒精脱水二甲苯透明后封片。
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结 果
1.损伤反应期：骨折邻近的骨膜内层细胞浅着色或不显色(图1)。
2.膜内成骨期：邻近骨折处的骨膜内层细胞分裂增殖并向成骨细胞分化，骨膜内层细胞和成骨细胞显色，成骨细胞着色较深(图2)。
3.软骨形成期：骨折断端间的肉芽组织中出现软骨细胞团，幼稚的软骨细胞显色浅，成熟软骨细胞着色深(图3)。
4.软骨内成骨期：在膜内成骨区和软骨区间形成钙化前缘。附近的软骨细胞肥大，基质钙化，成骨细胞随血管进入钙化的软骨基质，肥大的软骨细胞不显色，成骨细胞着色较深(图4)。
讨 论
本研究的主要目的在于了解TGF-β1在骨折局部的来源和分布，其表达量和定位的改变与组织学变化的关系。实验结果表明，在大鼠骨折愈合过程不同阶段，TGF-β1在骨折局部始终存在，但来源不同。早期主要由血小板释放，后期则主要由修复细胞自身产生，其中软骨细胞表达量最多，这与国外的研究结果相同[2]。国内有关研究资料表明用提纯的外源性TGF-β局部注射，可诱导小鼠股骨膜下成骨[3]。
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在损伤反应期，血肿形成并凝固时，血小板脱颗粒，释放TGF-β1。骨膜生发层细胞受刺激而分裂增殖，组织学上可见血肿延伸范围与骨膜增生范围一致。骨膜细胞自身也产生少量TGF-β1，与软组织创伤修复类似，早期肉芽组织中的单核巨噬细胞也分泌TGF-β1。上述来源的TGF-β1趋化炎性细胞，促进修复细胞分裂增殖，并协调众多细胞因子的作用，为进一步修复做好准备。
在膜内成骨期，受TGF-β1等因子刺激而分裂增殖的骨膜细胞向成骨细胞分化，以膜内成骨的方式形成骨组织。成骨细胞在分泌骨基质的同时，也能产生TGF-β1。骨折愈合首先启动的是膜内成骨过程。有关研究结果表明在大鼠骨膜下注射外源性TGF-β能诱导膜内成骨[4]。
在软骨形成期，肉芽组织中出现软骨细胞团，并逐渐扩大，最终取代肉芽组织而连接骨断端。有关研究已证明TGF-β能诱导间质细胞向软骨细胞分化，并形成软骨组织[5]。在大鼠骨膜下注射外源性TGF-β能在局部诱导软骨形成[6]。在此期，TGF-β1主要来源于软骨细胞自身的合成，正如实验中所见软骨细胞和间质细胞都显色，成熟软骨细胞显色最深。
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在软骨内成骨期，钙化的软骨基质中有TGF-β1储存，破骨细胞在进行吸收时活化基质中的TGF-β，这有助于前成骨细胞向成骨细胞分化。此外，TGF-β1尚能趋化成骨细胞到达成骨部位，成骨细胞产生的TGF-β1将储存于骨基质中。在骨痂的塑建和重建过程中，局部释放的TGF-β协调骨吸收和骨形成过程，使骨折修复并恢复原先骨的解剖结构。
在骨折愈合的不同阶段，产生TGF-β1的细胞是不同的，表达量也不同，上述变化与组织学改变密切相关。而且与相应细胞的功能状态密切相关，这说明TGF-β1是参与调节骨折修复的重要因子。但机体对骨折愈合过程的调控是复杂的，单一因子不能解释其全部内容。关于骨折愈合过程中其它相关因子的表达，以及生长因子局部应用促进骨折愈合等问题，尚待进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Bolander ME.Regulation of fracture repair by growth factors.Proc Soc Exp Bio Med,1992,200:165-170.
2 Joyce ME,Jingushi S,Bolander ME.Transforming growth factor-β in the regulation of fracture repair.Orthop Clin North Am,1990,21:199-209.
3 孙玉鹏，陆裕朴，胡蕴玉，等.牛血小板TGF-β提取纯化及其诱导小鼠股骨成骨作用.中华骨科杂志，1995,15:610-613.
4 Noda M，Camilliere JJ.In vivo stimulation of bone formation by transforming growth factor-β.Endocrinology,1989,124:2991-2994.
, 百拇医药
5 Seyedin SM,Thomas TC,Thompsom AY,et al.Purification and characterization of two cartilage-inducing factors from bovine demineralized bone.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:2267-2271.
6 Joyce ME,Roberts AB,Sporn MB,et al.Transforming growth factor-β and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur.J Cell Biol,1990,110:2195-2207.
(收稿：1997-04-28 修回：1997-11-14), 百拇医药