腰椎间盘纤维性主胶原基因表达的观察
作者：吕振华 胡有谷 冯传汉
单位：266003 青岛大学医学院附属医院骨科研究室(吕振华、胡有谷)；北京医科大学人民医院骨病骨肿瘤研究室(冯传汉)
关键词：椎间盘；腰椎；基因表达；胶原；原位杂交
中华外科杂志980202 【摘要】 目的 探讨腰椎间盘组织主要胶原成分——Ⅰ型、Ⅱ型胶原在细胞中基因表达的规律，作为今后的基因调控工作的基础。方法 利用核酸分子的原位杂交技术，分别以Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因的cDNA探针对胎儿、成人和病理椎间盘组织切片中椎间盘细胞的胶原mRNA进行原位杂交，观察不同阶段胶原基因表达的水平。以胶原的特异性天狼星红染色进行不同阶段的胶原蛋白水平的观察。结果 Ⅰ型胶原mRNA的阳性杂交信号集中于纤维环的外层，Ⅱ型胶原基因在髓核中高表达。成人和病理椎间盘组织中未检出Ⅱ型胶原基因的杂交信号，Ⅰ型胶原mRNA表达水平减弱，髓核中出现其阳性杂交信号。对胶原的天狼星红染色结果与之相符。结论 随着年龄的增长，胶原基因表达的规律发生显著变化。成人和病理椎间盘呈现胶原基因的低表达，Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因的表达出现异常现象；髓核内出现Ⅰ型胶原基因表达。
, http://www.100md.com
Gene expression of fibrous main collagen in the lumbar disc Lu Zhenhua,Hu Yougu,Feng Chuanhan.Department of Orthopaedics,Affiliated Hospital of Qingdao Medical College,Qingdao University, Qingdao 266003.
【Abstract】 Objective To study the patterns of gene expression of main collagen,type Ⅰand type Ⅱ in lumbar discs.Methods The level of collagen gene mRNA expression of type Ⅰ and type Ⅱ was investigated by in situ hybridization on fetal,adults and pathologic specimens with cDNA probe.Collagen in various specimens was observed by staining of sirius scarlet.Results Positive mRNA hybridization signals of collagen typeⅠwere concentrated around outlayer of annulus fibrosus.TypeⅡ collagen was highly expressed in nucleus pulposus.In adult and pathologic specimens,no hybridization signal of type Ⅱ collagen was observed,and the expression level of type Ⅱ collagen mRNA decreased.Positive signals appeared in nucleus pulposus.Conclusion Obvious changes took place in the regulation of collagen gene expression with aging.Expression of collagn in adult and pathological disc was decreased.Abnormal appearance could be seen between collagen gene type Ⅰ and type Ⅱ.Expression of collagen type Ⅰ mRNA appeared in nucleus pulposus.
, http://www.100md.com
【Key words】 Intervertebral disk Lumbar vertebrae Gene expression Collagen
In situ hybridization
腰椎间盘中含有多种胶原成分，现已发现有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型和Ⅺ型等。其中Ⅰ型胶原是椎间盘纤维性胶原的主要成分之一，主要分布在椎间盘纤维环的外层，耐受牵张力，也是骨、肌腱、韧带、皮肤等组织的主要胶原成分。Ⅱ型胶原是软骨胶原，在软骨、玻璃体和椎间盘髓核中含量丰富，耐受压力。二者的共同存在和协同作用在维持椎间盘的力学特性中发挥重要作用。当其质和量发生变化时，必然引起椎间盘承受应力的降低和增加损伤的机会。我们利用核酸探针的原位杂交技术，对Ⅰ型、Ⅱ型胶原mRNA在不同年龄标本椎间盘细胞的定位，用组化技术对Ⅰ型、Ⅱ型胶原在椎间盘组织中的分布进行了观察研究，旨在了解Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因在椎间盘组织中表达的变化。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、标本的制备
1.胎儿标本：正常胎龄8个月保胎失败而引产的胎儿，4小时内取出脊柱，分离椎体、软骨终板，切下腰椎间盘，迅速置于液氮中，备用。
2.成人标本：正常男性，52岁，因脑外伤死亡。完整切下腰椎间盘后，迅速置液氮备用。
3.病理椎间盘：腰椎间盘突出症患者术中切取的腰椎间盘组织，置于无菌小瓶，密封后置液氮备用。
二、研究方法
1.椎间盘组织切片胶原的特异性染色:(1)将标本制成大小约1.0cm×0.8cm×0.3cm的组织块，在以磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲的4%多聚甲醛中固定1小时，PBS洗涤10min×3，石蜡包埋。(2)载玻片流水洗涤，洗液浸泡过夜，双蒸水彻底冲洗。3-氨丙基，3-乙氧基甲硅烷(APES)处理后，干燥备用。(3)常规石蜡切片、展片，切片厚度为10μm。(4)50℃烤片过夜，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。(5)称取天狼星红50mg溶于饱和苦味酸100ml，配成天狼星红染色剂。切片置入天狼星红染色剂，室温下30分钟。双蒸水洗涤。(6)偏光显微镜90度(或270度)观察。
, 百拇医药
2.原位杂交切片制备：(1)载玻片、盖玻片经洗涤剂浸泡、洗涤，铬酸洗液浸泡过夜，双蒸水冲洗；250℃干烤3小时，APES处理，干燥后备用。(2)组织块从液氮中取出后，立即以OCT包埋，冰冻切片机切片，切片厚度45μm。切片置PBS缓冲的4%多聚甲醛(pH7.4)中固定10分钟，PBS洗涤2min×3。37℃干燥2小时，密封，置于-70℃低温冰箱中备用。(3)杂交前所用试剂均以焦碳酸三乙酯(DEPC)处理的双蒸水配制。
3.探针的制备:Ⅰ型胶原cDNA探针由中国预防医学科学院劳动卫生研究所提供。Jm1b：编码人Pro α1(Ⅰ)肽链的全部核苷酸序列，长度为4.6kb，载体为pUC质粒，重组位点为EcoRⅠ。限制性内切酶图谱含有Ⅱ型胶原cDNA探针序列的重组质粒pHCAR3由芬兰Turku大学提供。
质粒转化、质粒的大量制备和插入片段的回收按文献[1]方法进行。探针的地高辛标记和标记效率的检测按BM公司操作手册进行。
, 百拇医药
4.组织切片上的原位杂交:(1)去污剂处理：0.2% TritonX-100-PBS处理15分钟，室温，PBS 3min×2。(2)蛋白酶处理：蛋白酶K(Gibco)10μg/ml，37℃孵育30分钟。冰冷的0.2%甘氨酸-PBS 3min×3中止蛋白酶作用。(3)酸酐处理：0.25%乙酸酐处理10分钟。(4)预杂交：在由0.01%BSA、0.01聚乙烯吡咯烷酮、2×SSC(标准柠檬酸盐氯化钠液)、50mmol Tris-HCl(pH7.2)、0.4mg/ml鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺组成的预杂交液中(42℃)孵育2小时。
5.杂交：试剂均以DEPC处理的双蒸水配制。(1)杂交液的配制：按苏慧慈法[2]配制。(2)杂交液中加入地高辛标记的cDNA探针并使之终浓度为2ng/μl，探针杂交液煮沸10分钟，迅速置冰中，小心吸除切片上的预杂交液，立即加入30μl探针杂交液，小心覆以盖玻片，封口膜封闭。42℃杂交16小时。(3)杂交后的洗涤与显色、观察：2×SSC，40℃，5min×4。0.1×SSC，40℃，30min×2。马来酸缓冲液，25℃2分钟。阻断缓冲液，25℃，30分钟。地高辛抗体(1∶500)37℃孵育2小时。马来酸缓冲液洗涤，15min×2。显色缓冲液洗涤3分钟。NBT/BCIP避光显色37℃下2小时，镜下观察，显色满意后，马来酸缓冲液5分钟、Tris-EDTA2分钟中止显色。
, 百拇医药
结 果
一、椎间盘组织切片Ⅰ型胶原天狼星红染色
1.胎儿椎间盘组织切片：纤维环胶原纤维排列整齐。纤维环最外层为染成红色的Ⅰ型胶原，主要集中在纤维环的外层(图1)。随纤维环外层向内，Ⅰ型胶原的着色逐渐减轻，与Ⅱ型胶原相互移行(图2)，纤维环中Ⅱ型胶原的含量随近髓核而逐渐增加。髓核中未见Ⅰ型胶原染色。
2.成人标本：纤维环中胶原纤维的直径增加，排列略呈紊乱，Ⅰ型胶原的染色增加。髓核中有分布、走向不规则的Ⅰ型胶原纤维出现(图3)。
二、Ⅰ型、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交
1.胎儿椎间盘切片原位杂交结果：低倍镜下，髓核与纤维环细胞密集，细胞分布比较均匀。高倍镜下，髓核内细胞多为圆形、多角形，形态符合类软骨细胞和脊索细胞。在髓核和纤维环的不同区域内的类成纤维细胞、脊索细胞中有Ⅰ型胶原mRNA的散在表达。在纤维环的近外层，阳性表达细胞密集。高倍镜下可见胞浆内着色颗粒(图4)。Ⅱ型胶原cDNA探针杂交阳性细胞集中于髓核和纤维环内层髓核、纤维环移行区域，有阳性与阴性细胞混杂(图5)。髓核内类软骨细胞胞浆中有大量蓝紫色颗粒，杂交信号强(图6)。纤维环中成纤维细胞未见杂交信号。
, 百拇医药
2.成人椎间盘标本原位杂交结果：组织纤维化明显，细胞数减少。细胞形态变化比较明显，髓核细胞和纤维环细胞中，可见散在Ⅰ型胶原基因阳性表达(图7)。胞浆中杂交信号较弱(图8)。髓核和纤维环未见Ⅱ型胶原基因杂交阳性细胞(图9)。
3.病理椎间盘组织高度纤维化，未见杂交信号(图10)。
讨 论
胶原蛋白是结缔组织中重要的蛋白质大分子，构成生物细胞间的框架。既往的研究中，人们已发现15种类型的胶原蛋白分子，其中5种在人体中含量丰富。70年代末以来，人们开始对椎间盘中胶原的类型和数量进行分析和研究。Eyre和Muir[3]首先利用溴化氰裂解、磷酸纤维素层析，发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原在椎间盘组织中规律性的分布。Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，占椎间盘Ⅰ型胶原总量的40%。随外层向髓核方向，Ⅰ型胶原逐渐减少，Ⅱ型胶原含量逐渐增加，髓核则为Ⅱ型胶原构成。
, 百拇医药
Ⅰ型胶原的分子构型为[α1(Ⅰ)]2α2。长约300nm，直径1.5nm。由约1 050个氨基酸构成，分子量约3×105。胶原分子在细胞的粗面内质网的核蛋白体合成，经过细胞内外的修饰，在细胞外聚合成胶原原纤维。Ⅰ型胶原分子有12～15个羟赖氨酸残基，亚氨基酸的糖化作用弱，分子的水含量较低，能够耐受强的张力和剪力。故Ⅰ型胶原抗牵张应力强。直径1mm的Ⅰ型胶原纤维能够耐受20～40kg的张力。但由于低糖化作用，使其水含量低，不耐受压力[4]。
本实验中对Ⅰ型胶原mRNA在不同发育阶段的椎间盘中表达的研究表明：(1)胎儿时期，纤维环主要由成纤维细胞和胶原纤维排列组成。细胞排列整齐，组织结构清晰完整。Ⅰ型胶原由纤维环的成纤维细胞活跃表达，在纤维环中层偏外处表达最高，成簇排列的细胞群几乎所有细胞均有mRNA的表达，纤维环内层及近髓核处，杂交信号逐渐减弱，阳性细胞散在。在髓核中未见Ⅰ型胶原mRNA的表达。组化染色也显示Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，构成纤维环的Ⅰ型胶原来自纤维环的成纤维细胞。(2)成人阶段，椎间盘组织细胞出现退变。细胞数明显减少，mRNA表达水平降低。同时，髓核内细胞出现杂交信号。Ⅰ型胶原染色显示，成人椎间盘中Ⅰ型胶原含量明显增加，在髓核内出现Ⅰ型胶原染色。Ⅰ型胶原成为椎间盘纤维环和髓核胶原的主要成分。
, 百拇医药
Kaapa等[5]在对2周～5个月猪椎间盘创伤模型瘢痕组织进行Ⅰ型胶原免疫组化的观察研究中发现，Ⅰ型胶原间接免疫荧光染色显著增强，反映组织中新合成胶原修饰的前羟化酶活性水平也在创伤后迅速增加，髓核组织中出现类成纤维细胞。本实验中我们观察到，在退变的椎间盘组织细胞的胶原基因表达中发现了类似变化，其细胞有Ⅰ型胶原基因mRNA表达。
Ⅱ型胶原的分子构型由三条α1(Ⅱ)链构成，但氨基酸构成上与Ⅰ型胶原有明显的不同。Ⅱ型胶原分子中羟赖氨酸残基含量达36～72个。这些亚氨基酸的意义在于其携带有侧链和高糖化作用；羟赖氨酸侧链经糖化作用后产生二糖衍生物(葡萄糖基半乳糖羟赖氨酸)和单糖衍生物(半乳糖基羟赖氨酸)。糖化作用使水分子在亚氨基酸的侧链聚集，使胶原更适于承受压力，髓核中Ⅱ型胶原的糖化羟赖氨酸占羟赖氨酸总量的60%～70%。结果使Ⅱ型胶原体积大于Ⅰ型胶原体积的25%[6]。氨基酸构成的不同，使Ⅱ型胶原与Ⅰ型胶原的功能不同；高羟化(水化)纤维更适于变形，承受和吸引压力。髓核和纤维环内层的胶原绝大多数是Ⅱ型胶原，在承受压力方面起重要作用。
, http://www.100md.com
人类Ⅱ型原胶原mRNA的cDNA克隆首先由Elima等构建和确定[7]。Ⅱ型胶原又分为ⅡA和ⅡB，ⅡA可能与发育过程有关，ⅡB是软骨中的主要胶原。Ⅱ型胶原基因的第2个外显子与Ⅰ型胶原相似。N-前肽中有69个氨基酸和10个半胱氨酸的序列在Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原中高度一致。
髓核胚胎时期主要由类成软骨细胞、脊索细胞和软骨基质样物质构成，成人以软骨细胞为主。Kosher等[8]对鸡胚肢体的软骨分化期间Ⅰ型和Ⅱ型胶原基因mRNA水平的检测发现，在软骨发育、软骨细胞浓聚的阶段，Ⅱ型胶原基因的表达迅速增加。同时，在分化的软骨细胞中出现Ⅰ型胶原mRNA，但未能检测出Ⅰ型胶原。肢体发育中的软骨细胞由合成Ⅰ型胶原的前软骨细胞分化而成，合成具有软骨特征的Ⅱ型胶原，停止Ⅰ型胶原的合成 。
对不同发育阶段椎间盘组织中Ⅱ型胶原mRNA杂交检测以及对不同发育阶段椎间盘组织中Ⅱ型胶原mRNA检测的结果表明：胎儿时期来自穿越软骨终板的血液供应较为丰富的椎间盘组织，髓核中类软骨细胞和脊索细胞合成代谢旺盛，Ⅱ型胶原基因表达活跃，大量合成Ⅱ型胶原，使类软骨细胞和部分脊索细胞成为髓核和部分纤维环内层胶原成分的细胞来源。这些合成的Ⅱ型胶原，含有较丰富的亚氨基酸，侧链丰富、糖化程度高，含水量大，构成髓核的软骨样基质。完成椎间盘自身的生长、发育和发挥髓核承受压力的正常生理功能。随着年龄的增长和椎间盘的退变，髓核内细胞Ⅱ型胶原基因的表达趋于静止。髓核细胞数明显减少。髓核和纤维环的细胞未见杂交阳性细胞。这一胶原基因表达的变化促进了髓核的纤维化，使髓核Ⅱ型胶原的合成代谢障碍。髓核的力学特性逐步发生变化。
, 百拇医药
图1 胎儿椎间盘天狼星红组化染色(×100) 图2 胎儿椎间盘天狼星红组化染色(×100)图3 成人椎间盘髓核天狼星红组化染色(×100) 图4 胎儿椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图5 胎儿椎间盘Ⅱ型胶原mRNA原原位杂交(×200) 图6 胎儿椎间盘Ⅱ型胶原mRNA原位杂交(×400) 图7 成人椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图8 成人椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位要交(×400) 图9 成人椎间盘髓核Ⅱ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图10 病现椎间盘组织胶原镜下观察(×200)
注：本课题受山东省科委资助
参 考 文 献
1 J.萨姆布鲁克.质粒载体.见：分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1992.1-69.
2 苏慧慈.组织切片上的原位杂交步骤.见：原位杂交.北京：科学出版社,1994.127-135.
, http://www.100md.com
3 Eyre DR,Muir H.TypesⅠ and Ⅱ collagens in intervertebral disc.interchanging radial distributions in annulus fibrosus.Biochem J,1976，157:267-270.
4 Prockop KJ.The biosynthesis of collagen and its disorder.N Engl J Med,1979,301:13-23.
5 Kaapa E,Han X,Holm S,et al.Collagen synthesis and typesⅠ,Ⅲ,Ⅳ collagens in an animal model of disc degeneration.Spine,1995,20:59-67.
6 Grynpas MD,Eyre DR.Collagen of intervertebral disc. X-ray diffraction evidence for differdnces in the native molecular packing of typesⅠ,Ⅱ collagen.Trans Orthop Res Coc,1980,5:13-21.
7 Elima K,Makela JK.Construction and identification of a cDNA clone for human typeⅡ procollagen mRNA.Biochem J,1985,229:183-189.
8 Kosher RA,Kulyk WM, Steven G.Collagen gene expression during limb cartilage differentiation.J Cell Biol,1986，102:1151-1156.
(收稿：1997-03-14 修回：1997-11-14), 百拇医药
单位：266003 青岛大学医学院附属医院骨科研究室(吕振华、胡有谷)；北京医科大学人民医院骨病骨肿瘤研究室(冯传汉)
关键词：椎间盘；腰椎；基因表达；胶原；原位杂交
中华外科杂志980202 【摘要】 目的 探讨腰椎间盘组织主要胶原成分——Ⅰ型、Ⅱ型胶原在细胞中基因表达的规律，作为今后的基因调控工作的基础。方法 利用核酸分子的原位杂交技术，分别以Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因的cDNA探针对胎儿、成人和病理椎间盘组织切片中椎间盘细胞的胶原mRNA进行原位杂交，观察不同阶段胶原基因表达的水平。以胶原的特异性天狼星红染色进行不同阶段的胶原蛋白水平的观察。结果 Ⅰ型胶原mRNA的阳性杂交信号集中于纤维环的外层，Ⅱ型胶原基因在髓核中高表达。成人和病理椎间盘组织中未检出Ⅱ型胶原基因的杂交信号，Ⅰ型胶原mRNA表达水平减弱，髓核中出现其阳性杂交信号。对胶原的天狼星红染色结果与之相符。结论 随着年龄的增长，胶原基因表达的规律发生显著变化。成人和病理椎间盘呈现胶原基因的低表达，Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因的表达出现异常现象；髓核内出现Ⅰ型胶原基因表达。
, http://www.100md.com
Gene expression of fibrous main collagen in the lumbar disc Lu Zhenhua,Hu Yougu,Feng Chuanhan.Department of Orthopaedics,Affiliated Hospital of Qingdao Medical College,Qingdao University, Qingdao 266003.
【Abstract】 Objective To study the patterns of gene expression of main collagen,type Ⅰand type Ⅱ in lumbar discs.Methods The level of collagen gene mRNA expression of type Ⅰ and type Ⅱ was investigated by in situ hybridization on fetal,adults and pathologic specimens with cDNA probe.Collagen in various specimens was observed by staining of sirius scarlet.Results Positive mRNA hybridization signals of collagen typeⅠwere concentrated around outlayer of annulus fibrosus.TypeⅡ collagen was highly expressed in nucleus pulposus.In adult and pathologic specimens,no hybridization signal of type Ⅱ collagen was observed,and the expression level of type Ⅱ collagen mRNA decreased.Positive signals appeared in nucleus pulposus.Conclusion Obvious changes took place in the regulation of collagen gene expression with aging.Expression of collagn in adult and pathological disc was decreased.Abnormal appearance could be seen between collagen gene type Ⅰ and type Ⅱ.Expression of collagen type Ⅰ mRNA appeared in nucleus pulposus.
, http://www.100md.com
【Key words】 Intervertebral disk Lumbar vertebrae Gene expression Collagen
In situ hybridization
腰椎间盘中含有多种胶原成分，现已发现有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型和Ⅺ型等。其中Ⅰ型胶原是椎间盘纤维性胶原的主要成分之一，主要分布在椎间盘纤维环的外层，耐受牵张力，也是骨、肌腱、韧带、皮肤等组织的主要胶原成分。Ⅱ型胶原是软骨胶原，在软骨、玻璃体和椎间盘髓核中含量丰富，耐受压力。二者的共同存在和协同作用在维持椎间盘的力学特性中发挥重要作用。当其质和量发生变化时，必然引起椎间盘承受应力的降低和增加损伤的机会。我们利用核酸探针的原位杂交技术，对Ⅰ型、Ⅱ型胶原mRNA在不同年龄标本椎间盘细胞的定位，用组化技术对Ⅰ型、Ⅱ型胶原在椎间盘组织中的分布进行了观察研究，旨在了解Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因在椎间盘组织中表达的变化。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、标本的制备
1.胎儿标本：正常胎龄8个月保胎失败而引产的胎儿，4小时内取出脊柱，分离椎体、软骨终板，切下腰椎间盘，迅速置于液氮中，备用。
2.成人标本：正常男性，52岁，因脑外伤死亡。完整切下腰椎间盘后，迅速置液氮备用。
3.病理椎间盘：腰椎间盘突出症患者术中切取的腰椎间盘组织，置于无菌小瓶，密封后置液氮备用。
二、研究方法
1.椎间盘组织切片胶原的特异性染色:(1)将标本制成大小约1.0cm×0.8cm×0.3cm的组织块，在以磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲的4%多聚甲醛中固定1小时，PBS洗涤10min×3，石蜡包埋。(2)载玻片流水洗涤，洗液浸泡过夜，双蒸水彻底冲洗。3-氨丙基，3-乙氧基甲硅烷(APES)处理后，干燥备用。(3)常规石蜡切片、展片，切片厚度为10μm。(4)50℃烤片过夜，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。(5)称取天狼星红50mg溶于饱和苦味酸100ml，配成天狼星红染色剂。切片置入天狼星红染色剂，室温下30分钟。双蒸水洗涤。(6)偏光显微镜90度(或270度)观察。
, 百拇医药
2.原位杂交切片制备：(1)载玻片、盖玻片经洗涤剂浸泡、洗涤，铬酸洗液浸泡过夜，双蒸水冲洗；250℃干烤3小时，APES处理，干燥后备用。(2)组织块从液氮中取出后，立即以OCT包埋，冰冻切片机切片，切片厚度45μm。切片置PBS缓冲的4%多聚甲醛(pH7.4)中固定10分钟，PBS洗涤2min×3。37℃干燥2小时，密封，置于-70℃低温冰箱中备用。(3)杂交前所用试剂均以焦碳酸三乙酯(DEPC)处理的双蒸水配制。
3.探针的制备:Ⅰ型胶原cDNA探针由中国预防医学科学院劳动卫生研究所提供。Jm1b：编码人Pro α1(Ⅰ)肽链的全部核苷酸序列，长度为4.6kb，载体为pUC质粒，重组位点为EcoRⅠ。限制性内切酶图谱含有Ⅱ型胶原cDNA探针序列的重组质粒pHCAR3由芬兰Turku大学提供。
质粒转化、质粒的大量制备和插入片段的回收按文献[1]方法进行。探针的地高辛标记和标记效率的检测按BM公司操作手册进行。
, 百拇医药
4.组织切片上的原位杂交:(1)去污剂处理：0.2% TritonX-100-PBS处理15分钟，室温，PBS 3min×2。(2)蛋白酶处理：蛋白酶K(Gibco)10μg/ml，37℃孵育30分钟。冰冷的0.2%甘氨酸-PBS 3min×3中止蛋白酶作用。(3)酸酐处理：0.25%乙酸酐处理10分钟。(4)预杂交：在由0.01%BSA、0.01聚乙烯吡咯烷酮、2×SSC(标准柠檬酸盐氯化钠液)、50mmol Tris-HCl(pH7.2)、0.4mg/ml鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺组成的预杂交液中(42℃)孵育2小时。
5.杂交：试剂均以DEPC处理的双蒸水配制。(1)杂交液的配制：按苏慧慈法[2]配制。(2)杂交液中加入地高辛标记的cDNA探针并使之终浓度为2ng/μl，探针杂交液煮沸10分钟，迅速置冰中，小心吸除切片上的预杂交液，立即加入30μl探针杂交液，小心覆以盖玻片，封口膜封闭。42℃杂交16小时。(3)杂交后的洗涤与显色、观察：2×SSC，40℃，5min×4。0.1×SSC，40℃，30min×2。马来酸缓冲液，25℃2分钟。阻断缓冲液，25℃，30分钟。地高辛抗体(1∶500)37℃孵育2小时。马来酸缓冲液洗涤，15min×2。显色缓冲液洗涤3分钟。NBT/BCIP避光显色37℃下2小时，镜下观察，显色满意后，马来酸缓冲液5分钟、Tris-EDTA2分钟中止显色。
, 百拇医药
结 果
一、椎间盘组织切片Ⅰ型胶原天狼星红染色
1.胎儿椎间盘组织切片：纤维环胶原纤维排列整齐。纤维环最外层为染成红色的Ⅰ型胶原，主要集中在纤维环的外层(图1)。随纤维环外层向内，Ⅰ型胶原的着色逐渐减轻，与Ⅱ型胶原相互移行(图2)，纤维环中Ⅱ型胶原的含量随近髓核而逐渐增加。髓核中未见Ⅰ型胶原染色。
2.成人标本：纤维环中胶原纤维的直径增加，排列略呈紊乱，Ⅰ型胶原的染色增加。髓核中有分布、走向不规则的Ⅰ型胶原纤维出现(图3)。
二、Ⅰ型、Ⅱ型胶原mRNA原位杂交
1.胎儿椎间盘切片原位杂交结果：低倍镜下，髓核与纤维环细胞密集，细胞分布比较均匀。高倍镜下，髓核内细胞多为圆形、多角形，形态符合类软骨细胞和脊索细胞。在髓核和纤维环的不同区域内的类成纤维细胞、脊索细胞中有Ⅰ型胶原mRNA的散在表达。在纤维环的近外层，阳性表达细胞密集。高倍镜下可见胞浆内着色颗粒(图4)。Ⅱ型胶原cDNA探针杂交阳性细胞集中于髓核和纤维环内层髓核、纤维环移行区域，有阳性与阴性细胞混杂(图5)。髓核内类软骨细胞胞浆中有大量蓝紫色颗粒，杂交信号强(图6)。纤维环中成纤维细胞未见杂交信号。
, 百拇医药
2.成人椎间盘标本原位杂交结果：组织纤维化明显，细胞数减少。细胞形态变化比较明显，髓核细胞和纤维环细胞中，可见散在Ⅰ型胶原基因阳性表达(图7)。胞浆中杂交信号较弱(图8)。髓核和纤维环未见Ⅱ型胶原基因杂交阳性细胞(图9)。
3.病理椎间盘组织高度纤维化，未见杂交信号(图10)。
讨 论
胶原蛋白是结缔组织中重要的蛋白质大分子，构成生物细胞间的框架。既往的研究中，人们已发现15种类型的胶原蛋白分子，其中5种在人体中含量丰富。70年代末以来，人们开始对椎间盘中胶原的类型和数量进行分析和研究。Eyre和Muir[3]首先利用溴化氰裂解、磷酸纤维素层析，发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原在椎间盘组织中规律性的分布。Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，占椎间盘Ⅰ型胶原总量的40%。随外层向髓核方向，Ⅰ型胶原逐渐减少，Ⅱ型胶原含量逐渐增加，髓核则为Ⅱ型胶原构成。
, 百拇医药
Ⅰ型胶原的分子构型为[α1(Ⅰ)]2α2。长约300nm，直径1.5nm。由约1 050个氨基酸构成，分子量约3×105。胶原分子在细胞的粗面内质网的核蛋白体合成，经过细胞内外的修饰，在细胞外聚合成胶原原纤维。Ⅰ型胶原分子有12～15个羟赖氨酸残基，亚氨基酸的糖化作用弱，分子的水含量较低，能够耐受强的张力和剪力。故Ⅰ型胶原抗牵张应力强。直径1mm的Ⅰ型胶原纤维能够耐受20～40kg的张力。但由于低糖化作用，使其水含量低，不耐受压力[4]。
本实验中对Ⅰ型胶原mRNA在不同发育阶段的椎间盘中表达的研究表明：(1)胎儿时期，纤维环主要由成纤维细胞和胶原纤维排列组成。细胞排列整齐，组织结构清晰完整。Ⅰ型胶原由纤维环的成纤维细胞活跃表达，在纤维环中层偏外处表达最高，成簇排列的细胞群几乎所有细胞均有mRNA的表达，纤维环内层及近髓核处，杂交信号逐渐减弱，阳性细胞散在。在髓核中未见Ⅰ型胶原mRNA的表达。组化染色也显示Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，构成纤维环的Ⅰ型胶原来自纤维环的成纤维细胞。(2)成人阶段，椎间盘组织细胞出现退变。细胞数明显减少，mRNA表达水平降低。同时，髓核内细胞出现杂交信号。Ⅰ型胶原染色显示，成人椎间盘中Ⅰ型胶原含量明显增加，在髓核内出现Ⅰ型胶原染色。Ⅰ型胶原成为椎间盘纤维环和髓核胶原的主要成分。
, 百拇医药
Kaapa等[5]在对2周～5个月猪椎间盘创伤模型瘢痕组织进行Ⅰ型胶原免疫组化的观察研究中发现，Ⅰ型胶原间接免疫荧光染色显著增强，反映组织中新合成胶原修饰的前羟化酶活性水平也在创伤后迅速增加，髓核组织中出现类成纤维细胞。本实验中我们观察到，在退变的椎间盘组织细胞的胶原基因表达中发现了类似变化，其细胞有Ⅰ型胶原基因mRNA表达。
Ⅱ型胶原的分子构型由三条α1(Ⅱ)链构成，但氨基酸构成上与Ⅰ型胶原有明显的不同。Ⅱ型胶原分子中羟赖氨酸残基含量达36～72个。这些亚氨基酸的意义在于其携带有侧链和高糖化作用；羟赖氨酸侧链经糖化作用后产生二糖衍生物(葡萄糖基半乳糖羟赖氨酸)和单糖衍生物(半乳糖基羟赖氨酸)。糖化作用使水分子在亚氨基酸的侧链聚集，使胶原更适于承受压力，髓核中Ⅱ型胶原的糖化羟赖氨酸占羟赖氨酸总量的60%～70%。结果使Ⅱ型胶原体积大于Ⅰ型胶原体积的25%[6]。氨基酸构成的不同，使Ⅱ型胶原与Ⅰ型胶原的功能不同；高羟化(水化)纤维更适于变形，承受和吸引压力。髓核和纤维环内层的胶原绝大多数是Ⅱ型胶原，在承受压力方面起重要作用。
, http://www.100md.com
人类Ⅱ型原胶原mRNA的cDNA克隆首先由Elima等构建和确定[7]。Ⅱ型胶原又分为ⅡA和ⅡB，ⅡA可能与发育过程有关，ⅡB是软骨中的主要胶原。Ⅱ型胶原基因的第2个外显子与Ⅰ型胶原相似。N-前肽中有69个氨基酸和10个半胱氨酸的序列在Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅴ型胶原中高度一致。
髓核胚胎时期主要由类成软骨细胞、脊索细胞和软骨基质样物质构成，成人以软骨细胞为主。Kosher等[8]对鸡胚肢体的软骨分化期间Ⅰ型和Ⅱ型胶原基因mRNA水平的检测发现，在软骨发育、软骨细胞浓聚的阶段，Ⅱ型胶原基因的表达迅速增加。同时，在分化的软骨细胞中出现Ⅰ型胶原mRNA，但未能检测出Ⅰ型胶原。肢体发育中的软骨细胞由合成Ⅰ型胶原的前软骨细胞分化而成，合成具有软骨特征的Ⅱ型胶原，停止Ⅰ型胶原的合成 。
对不同发育阶段椎间盘组织中Ⅱ型胶原mRNA杂交检测以及对不同发育阶段椎间盘组织中Ⅱ型胶原mRNA检测的结果表明：胎儿时期来自穿越软骨终板的血液供应较为丰富的椎间盘组织，髓核中类软骨细胞和脊索细胞合成代谢旺盛，Ⅱ型胶原基因表达活跃，大量合成Ⅱ型胶原，使类软骨细胞和部分脊索细胞成为髓核和部分纤维环内层胶原成分的细胞来源。这些合成的Ⅱ型胶原，含有较丰富的亚氨基酸，侧链丰富、糖化程度高，含水量大，构成髓核的软骨样基质。完成椎间盘自身的生长、发育和发挥髓核承受压力的正常生理功能。随着年龄的增长和椎间盘的退变，髓核内细胞Ⅱ型胶原基因的表达趋于静止。髓核细胞数明显减少。髓核和纤维环的细胞未见杂交阳性细胞。这一胶原基因表达的变化促进了髓核的纤维化，使髓核Ⅱ型胶原的合成代谢障碍。髓核的力学特性逐步发生变化。
, 百拇医药
图1 胎儿椎间盘天狼星红组化染色(×100) 图2 胎儿椎间盘天狼星红组化染色(×100)图3 成人椎间盘髓核天狼星红组化染色(×100) 图4 胎儿椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图5 胎儿椎间盘Ⅱ型胶原mRNA原原位杂交(×200) 图6 胎儿椎间盘Ⅱ型胶原mRNA原位杂交(×400) 图7 成人椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图8 成人椎间盘Ⅰ型胶原mRNA原位要交(×400) 图9 成人椎间盘髓核Ⅱ型胶原mRNA原位杂交(×100) 图10 病现椎间盘组织胶原镜下观察(×200)
注：本课题受山东省科委资助
参 考 文 献
1 J.萨姆布鲁克.质粒载体.见：分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1992.1-69.
2 苏慧慈.组织切片上的原位杂交步骤.见：原位杂交.北京：科学出版社,1994.127-135.
, http://www.100md.com
3 Eyre DR,Muir H.TypesⅠ and Ⅱ collagens in intervertebral disc.interchanging radial distributions in annulus fibrosus.Biochem J,1976，157:267-270.
4 Prockop KJ.The biosynthesis of collagen and its disorder.N Engl J Med,1979,301:13-23.
5 Kaapa E,Han X,Holm S,et al.Collagen synthesis and typesⅠ,Ⅲ,Ⅳ collagens in an animal model of disc degeneration.Spine,1995,20:59-67.
6 Grynpas MD,Eyre DR.Collagen of intervertebral disc. X-ray diffraction evidence for differdnces in the native molecular packing of typesⅠ,Ⅱ collagen.Trans Orthop Res Coc,1980,5:13-21.
7 Elima K,Makela JK.Construction and identification of a cDNA clone for human typeⅡ procollagen mRNA.Biochem J,1985,229:183-189.
8 Kosher RA,Kulyk WM, Steven G.Collagen gene expression during limb cartilage differentiation.J Cell Biol,1986，102:1151-1156.
(收稿：1997-03-14 修回：1997-11-14), 百拇医药