胃癌中癌基因ras c-myc mRNA表达的临床意义
作者：施秀清1 李 功1 李春生1 倪灿荣2 栾 汛1 曲 阳1
单位：1解放军203医院消化内科 黑龙江省齐齐哈尔市 161000;2第二军医大学病理教研室
关键词：基因，ras；基因，MYC；RNA，信使/分析；基因表达；胃肿瘤/遗传学
华人消化杂志980212.htm Oncogene ras, c-myc mRNA expression in gastric carcinoma and its clinical significance
SHI Xiu-Qing1, LI Gong1, LI Chun-Sheng1, NI Chan-Rong2, LUAN Xun1 and QU Yang1
, http://www.100md.com
1Department of Gastroenterology, Department of Pathology Chinese PLA 203 Hospital, Qiqihaer 161000
2Department of Pathology, the 2nd Military Medical University, Shanghai
Subject headings genes, ras; genes, myc; RNA, messenger/analysis; gene expression
AbstractAbstract
AIM To study the independent and combined effects of ras and c-myc mRNA expression in the tumor occurrence and to seek evidence for early diagnosis of gastric carcinoma.
, 百拇医药
METHODS In situ hybridization histochemistry (ISH) was used to examine the expression of H-ras, K-ras, C-myc mRNA in 88 cases of gastric carcinoma tissue, and an analysis with clinical data was made.
RESULTS K-ras, H-ras and C-myc mRNA expression rate in the tumor tissues was 78.4%， 70.5% and 58.0%, and it was 28.4%，27.3% and 20.5% in the neighboring regions of the tumor respectively, with a tendency of step-down. The oncogene expression was not related to clinical and pathological type and the metastasis to lymph nodes. C-myc mRNA expression was closely related to the survival time of patients (P<0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION K-ras, H-ras and C-myc mRNA expression is a valuable reference for the early diagnosis of gastric carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 探索癌基因ras和c-myc mRNA在胃癌发生中单独和协同作用关系，选择胃癌的早期诊断依据.
方法 应用原位分子杂交(ISH)技术，检测88例胃癌组织中H-ras，K-ras, C-myc mRNA的表达，结合临床资料综合分析.
结果 K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达分别为78.4%，70.5%和58.0%，在癌旁区的阳性表达分别为28.4%，27.3%和20.5%，呈梯度下降趋势，3种癌基因的表达与胃癌的临床分型、组织学分类及有无淋巴结转移无关，C-myc mRNA的表达与患者生存期关系密切(P<0.05).
, 百拇医药
结论 K-ras,H-ras,C-myc mRNA的表达可作为胃癌早期诊断的参考依据.
0 引言
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其生存率的提高有赖于搞好二级预防，以及时地检出癌前病变或早期癌. 目前胃癌的基础研究已进入了分子和基因水平阶段. 作者应用原位分子杂交技术检测88例胃癌肿瘤区、移行区和癌旁区粘膜的癌基因K-ras,H-ras和C-myc mRNA的表达，并与正常粘膜组织对照，旨在探讨其在胃癌的发生、发展中各自和协同作用关系、作用范围、阶段和从分子水平估计预后，为选择胃癌的早期诊断和治疗方法提供依据.
1 对象和方法
1.1 对象 胃癌组织88例均系本院1990年以来胃癌手术切除标本；男62例，女26例，年龄35岁～70岁，平均53.2岁；临床分型：蕈伞型9例，溃疡型50例，浸润型29例；组织学分类：高分化腺癌10例，中分化腺癌39例，低分化腺癌30例，粘液腺癌9例；正常粘膜5例. 有随访结果53例，其中术后生存期>3a者29例，<3a者24例.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 标本制备 胃癌组织标本均严格按标准取材后固定在40g/L多聚甲醛(1g/L DEPC消毒水配制)18h，150g/L蔗糖缓冲液浸泡标本24h，均用新鲜乙醇、二甲苯脱水、透明、包埋，4μm石蜡切片，切片时尽量避免RNasc污染.
1.2.2 探针与标记 K-ras, H-ras, C-myc(均由日本国立预防研究所小山浩赠送)，生物素标记缺口平移Kit购自美国Enzo公司，按说明书方法操作[1，2].
1.2.3 操作步骤 切片用新鲜乙醇，二甲苯脱蜡至无菌水中，无菌PBS洗，按文献报道适当修改的方法进行[3，4]，微波三挡浸在缓冲柠檬酸盐(0.01mol/L，pH 6.0)中5min×2(95℃)，蛋白和核酸分离，PBS洗，蛋白酶K(2mg/L)，37℃，30min，PBS洗，40g/L多聚甲醛固定5min;PBS洗，乙醇脱水，2.5g/L乙酸酐(内含0.1mol/L三乙醇胺9g/L NaCl,pH 8.0)洗10min. 预杂交：0.5kg/L去离子甲酰胺：2×ssc 42℃,3h;杂交：杂交液中内含探针浓度2mg/L，5ml去离子甲酰胺，2ml 20×ssc， 0.5ml 10g/L变性鲑精DNA，2ml 0.5kg/L硫酸葡聚糖，0.2ml 50×Denhardt, K-ras, H-ras和C-myc cDNA探针45℃杂交18h. 杂交后洗，均生物素化，抗生物素抗体1∶1000， 37℃ 1h，ABC复合物1∶100，37℃ 40min，DAB-HO显色8min. 结果判定标准及对照设计，参考有关文献[5，6].
, 百拇医药
2 结果
K-ras,H-ras和C-myc mRNA在胃癌中的表达见表1-4.
表1 癌基因mRNA在胃癌中的表达 mRNA癌基因
肿瘤区
癌 旁
不典型增生
正常粘膜
n
%
n
%
n∶9
, 百拇医药
n∶5
K-ras
69
78.4
25
28.4
3/9
0
H-ras
62
70.5
24
27.3
, 百拇医药
3/9
0
C-myc
51
58.0
18
20.5
2/9
0
表2 癌基因mRNA在不同类型胃癌中的表达 癌组织类型
K-ras
H-ras
C-myc
, http://www.100md.com
n
%
n
%
n
%
高分化
7/10
70.0
7/10
70.0
5/10
50.0
, http://www.100md.com 中分化
34/39
87.2
32/39
82.0
27/39
69.2
低分化
21/30
70.0
15/30
50.0
14/30
, 百拇医药
46.7
粘液
7/9
77.7
8/9
88.8
5/9
55.6
蕈伞型
7/9
77.8
7/9
77.8
, 百拇医药
5/9
55.6
溃疡型
36/50
72.0
32/50
64.0
31/50
62.0
浸润型
19/29
65.6
17/29
, 百拇医药
58.6
16/29
55.2
表3 癌基因mRNA表达与淋巴结转移 淋巴结转移
n
K-ras
H-ras
C-myc
+
-
+
-
+
, http://www.100md.com
-
有
63
49
14
46
17
36
27
无
25
20
5
17
, 百拇医药
8
11
14
表4 癌基因mRNA表达与术后生存的关系 生存期(a)
n
K-ras
H-ras
C-myc
-
+
-
+
-
, 百拇医药
+
>3
29
14
15
14
15
11
18
<3
24
10
14
11
, 百拇医药
13
16
8
3 讨论
应用原位分子杂交技术对88例胃癌组织检测的结果表明，K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达率分别为78.0%，70.0%和58.0%；癌旁组织及移行区正常粘膜上皮的阳性表达率分别为28.4%，27.3%，20.5%和18.2%，17.0%，19.3%，正常粘膜均呈阴性反应，与肿瘤区相比差异均有非常显著意义(P<0.01)；阳性表达从肿瘤区至癌旁区正常粘膜呈梯度下降趋势. 上述结果提示，胃癌细胞具有癌基因的激活、突变，与文献报道[7-10]结果一致. 癌旁粘膜上皮也有K-ras,H-ras和C-myc阳性表达，提示该区已有癌基因的突变和激活，细胞已非属正常细胞，有恶性转化的可能. 3种癌基因mRNA表达与肿瘤的分化程度及临床分型无统计学意义(P>0.05). 与淋巴结有无转移无关(P>0.05). c-myc基因定位于人类8号染色体上，其编码Mr 62 000产物有直接调节其他基因转录作用. Ninomiya et al[10]应用C-myc产物检测213例胃癌，其阳性率为23.5%，浸润型生长者多见，但与淋巴结转移，组织学类型及血管、淋巴管侵犯无关. 本研究应用C-myc探针检测88例胃癌中mRNA的表达，其阳性率要高于Ninomiya等的报道，同样与淋巴结转移，组织学类型无关. K-ras,H-ras,mRNA在胃癌中的表达与肿瘤患者的生存期无关，而C-myc mRNA表达与患者的存活期关系密切(P<0.05)与文献报道一致[7-10].
, 百拇医药
总之，细胞癌变是多癌基因变异累积的结果. 因此对多癌基因检测的高表达，可作为胃癌患者早期诊断的一个有价值的参考依据，对临床治疗具有一定的指导意义.
施秀清，女，1947-10-18生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族. 1972年毕业于延边医学院医疗系，主治医师，感染控制科主任，主要从事消化疾病的诊治研究.
通讯作者 施秀清，161000，解放军203医院消化内科，黑龙江省齐齐哈尔市建设大街59号.
Correspondence to: Dr. SHI Xiou-Qing, Department of Gastroenterology, Department of Pathology, Chinese PLA 203 Hospital, 59 Jianshe Street, Qiqihaer 161000, Heilongjiang Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86*452*2112355-4431
收稿日期 1997-05-06 修回日期 1997-09-03
4 参考文献
1 倪灿荣. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京：北京科学技术出版社，1993：261-269
2 苏慧慈. 原位杂交. 北京：中国科学技术出版社，1994：34-51
3 Chan F, Yeger H, Pawlin G, Arriza JL, Swanson LW, Simmons DM et al. in situ hybridization of mRNA with biotin and digoxigenin labeled probes. J Histotechnol, 1994;17(3):301-306
, http://www.100md.com
4 Can FY, Luk CD, Cesell MS, Sawchenko PE, Swanson LW, Davis LG et al. Nonradioactive in situ hybridization technioues for routinely prepared pathology specimel and cultured cells. J Histotechnol, 1994;17(3):313-319
5 王江，倪灿荣. P53, ras P21,c-erbB-2癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征. 第二军医大学学报，1994；15(1)：20-22
6 Viaene AL, Baert JH. Localization of cytokeratin 4 mRNA in human oesophageal epithelium by non-radioactive in situ hybridization. Histochem J, 1994;26(1):50-54
, 百拇医药
7 Tatsuta M, Iishi H, Baba M, Nakaizumi A, Uehara H, Taniguchi H et al. Expression of c-myc mRNA as an aid in histologic differentiation of adenoma from well differentiated adenocarcinoma in the stomach. Cancer, 1994;73(7):1795-1799
8 Houldsworth J, Cordon-corido C, ladanyi M, Kelsen DP, Chaganti RS. Gene amplification in gastric and esophageal adenocarcinoma. Cancer Res, 1990;50(22):6417-6422
9 Czerniak B, Herz F, Corczyca W, Koss LG. Expression of ras oncogene P21 protein in early gastric carcinoma and adjucent gastric epithelia. Cancer, 1989;64(6):1467-1473
10 Ninomiya I, Yonemura Y, Matsumoto H, Sugiyama K, Kamata T, Miwa K et al. Expression of c-myc gene product in gastric carcinoma. Oncology, 1991;48(1):149-154, 百拇医药(施秀清1 李 功1 李春生1 倪灿荣2 栾 汛1 曲 阳1)
单位：1解放军203医院消化内科 黑龙江省齐齐哈尔市 161000;2第二军医大学病理教研室
关键词：基因，ras；基因，MYC；RNA，信使/分析；基因表达；胃肿瘤/遗传学
华人消化杂志980212.htm Oncogene ras, c-myc mRNA expression in gastric carcinoma and its clinical significance
SHI Xiu-Qing1, LI Gong1, LI Chun-Sheng1, NI Chan-Rong2, LUAN Xun1 and QU Yang1
, http://www.100md.com
1Department of Gastroenterology, Department of Pathology Chinese PLA 203 Hospital, Qiqihaer 161000
2Department of Pathology, the 2nd Military Medical University, Shanghai
Subject headings genes, ras; genes, myc; RNA, messenger/analysis; gene expression
AbstractAbstract
AIM To study the independent and combined effects of ras and c-myc mRNA expression in the tumor occurrence and to seek evidence for early diagnosis of gastric carcinoma.
, 百拇医药
METHODS In situ hybridization histochemistry (ISH) was used to examine the expression of H-ras, K-ras, C-myc mRNA in 88 cases of gastric carcinoma tissue, and an analysis with clinical data was made.
RESULTS K-ras, H-ras and C-myc mRNA expression rate in the tumor tissues was 78.4%， 70.5% and 58.0%, and it was 28.4%，27.3% and 20.5% in the neighboring regions of the tumor respectively, with a tendency of step-down. The oncogene expression was not related to clinical and pathological type and the metastasis to lymph nodes. C-myc mRNA expression was closely related to the survival time of patients (P<0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION K-ras, H-ras and C-myc mRNA expression is a valuable reference for the early diagnosis of gastric carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 探索癌基因ras和c-myc mRNA在胃癌发生中单独和协同作用关系，选择胃癌的早期诊断依据.
方法 应用原位分子杂交(ISH)技术，检测88例胃癌组织中H-ras，K-ras, C-myc mRNA的表达，结合临床资料综合分析.
结果 K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达分别为78.4%，70.5%和58.0%，在癌旁区的阳性表达分别为28.4%，27.3%和20.5%，呈梯度下降趋势，3种癌基因的表达与胃癌的临床分型、组织学分类及有无淋巴结转移无关，C-myc mRNA的表达与患者生存期关系密切(P<0.05).
, 百拇医药
结论 K-ras,H-ras,C-myc mRNA的表达可作为胃癌早期诊断的参考依据.
0 引言
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其生存率的提高有赖于搞好二级预防，以及时地检出癌前病变或早期癌. 目前胃癌的基础研究已进入了分子和基因水平阶段. 作者应用原位分子杂交技术检测88例胃癌肿瘤区、移行区和癌旁区粘膜的癌基因K-ras,H-ras和C-myc mRNA的表达，并与正常粘膜组织对照，旨在探讨其在胃癌的发生、发展中各自和协同作用关系、作用范围、阶段和从分子水平估计预后，为选择胃癌的早期诊断和治疗方法提供依据.
1 对象和方法
1.1 对象 胃癌组织88例均系本院1990年以来胃癌手术切除标本；男62例，女26例，年龄35岁～70岁，平均53.2岁；临床分型：蕈伞型9例，溃疡型50例，浸润型29例；组织学分类：高分化腺癌10例，中分化腺癌39例，低分化腺癌30例，粘液腺癌9例；正常粘膜5例. 有随访结果53例，其中术后生存期>3a者29例，<3a者24例.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 标本制备 胃癌组织标本均严格按标准取材后固定在40g/L多聚甲醛(1g/L DEPC消毒水配制)18h，150g/L蔗糖缓冲液浸泡标本24h，均用新鲜乙醇、二甲苯脱水、透明、包埋，4μm石蜡切片，切片时尽量避免RNasc污染.
1.2.2 探针与标记 K-ras, H-ras, C-myc(均由日本国立预防研究所小山浩赠送)，生物素标记缺口平移Kit购自美国Enzo公司，按说明书方法操作[1，2].
1.2.3 操作步骤 切片用新鲜乙醇，二甲苯脱蜡至无菌水中，无菌PBS洗，按文献报道适当修改的方法进行[3，4]，微波三挡浸在缓冲柠檬酸盐(0.01mol/L，pH 6.0)中5min×2(95℃)，蛋白和核酸分离，PBS洗，蛋白酶K(2mg/L)，37℃，30min，PBS洗，40g/L多聚甲醛固定5min;PBS洗，乙醇脱水，2.5g/L乙酸酐(内含0.1mol/L三乙醇胺9g/L NaCl,pH 8.0)洗10min. 预杂交：0.5kg/L去离子甲酰胺：2×ssc 42℃,3h;杂交：杂交液中内含探针浓度2mg/L，5ml去离子甲酰胺，2ml 20×ssc， 0.5ml 10g/L变性鲑精DNA，2ml 0.5kg/L硫酸葡聚糖，0.2ml 50×Denhardt, K-ras, H-ras和C-myc cDNA探针45℃杂交18h. 杂交后洗，均生物素化，抗生物素抗体1∶1000， 37℃ 1h，ABC复合物1∶100，37℃ 40min，DAB-HO显色8min. 结果判定标准及对照设计，参考有关文献[5，6].
, 百拇医药
2 结果
K-ras,H-ras和C-myc mRNA在胃癌中的表达见表1-4.
表1 癌基因mRNA在胃癌中的表达 mRNA癌基因
肿瘤区
癌 旁
不典型增生
正常粘膜
n
%
n
%
n∶9
, 百拇医药
n∶5
K-ras
69
78.4
25
28.4
3/9
0
H-ras
62
70.5
24
27.3
, 百拇医药
3/9
0
C-myc
51
58.0
18
20.5
2/9
0
表2 癌基因mRNA在不同类型胃癌中的表达 癌组织类型
K-ras
H-ras
C-myc
, http://www.100md.com
n
%
n
%
n
%
高分化
7/10
70.0
7/10
70.0
5/10
50.0
, http://www.100md.com 中分化
34/39
87.2
32/39
82.0
27/39
69.2
低分化
21/30
70.0
15/30
50.0
14/30
, 百拇医药
46.7
粘液
7/9
77.7
8/9
88.8
5/9
55.6
蕈伞型
7/9
77.8
7/9
77.8
, 百拇医药
5/9
55.6
溃疡型
36/50
72.0
32/50
64.0
31/50
62.0
浸润型
19/29
65.6
17/29
, 百拇医药
58.6
16/29
55.2
表3 癌基因mRNA表达与淋巴结转移 淋巴结转移
n
K-ras
H-ras
C-myc
+
-
+
-
+
, http://www.100md.com
-
有
63
49
14
46
17
36
27
无
25
20
5
17
, 百拇医药
8
11
14
表4 癌基因mRNA表达与术后生存的关系 生存期(a)
n
K-ras
H-ras
C-myc
-
+
-
+
-
, 百拇医药
+
>3
29
14
15
14
15
11
18
<3
24
10
14
11
, 百拇医药
13
16
8
3 讨论
应用原位分子杂交技术对88例胃癌组织检测的结果表明，K-ras,H-ras,C-myc mRNA在肿瘤区的阳性表达率分别为78.0%，70.0%和58.0%；癌旁组织及移行区正常粘膜上皮的阳性表达率分别为28.4%，27.3%，20.5%和18.2%，17.0%，19.3%，正常粘膜均呈阴性反应，与肿瘤区相比差异均有非常显著意义(P<0.01)；阳性表达从肿瘤区至癌旁区正常粘膜呈梯度下降趋势. 上述结果提示，胃癌细胞具有癌基因的激活、突变，与文献报道[7-10]结果一致. 癌旁粘膜上皮也有K-ras,H-ras和C-myc阳性表达，提示该区已有癌基因的突变和激活，细胞已非属正常细胞，有恶性转化的可能. 3种癌基因mRNA表达与肿瘤的分化程度及临床分型无统计学意义(P>0.05). 与淋巴结有无转移无关(P>0.05). c-myc基因定位于人类8号染色体上，其编码Mr 62 000产物有直接调节其他基因转录作用. Ninomiya et al[10]应用C-myc产物检测213例胃癌，其阳性率为23.5%，浸润型生长者多见，但与淋巴结转移，组织学类型及血管、淋巴管侵犯无关. 本研究应用C-myc探针检测88例胃癌中mRNA的表达，其阳性率要高于Ninomiya等的报道，同样与淋巴结转移，组织学类型无关. K-ras,H-ras,mRNA在胃癌中的表达与肿瘤患者的生存期无关，而C-myc mRNA表达与患者的存活期关系密切(P<0.05)与文献报道一致[7-10].
, 百拇医药
总之，细胞癌变是多癌基因变异累积的结果. 因此对多癌基因检测的高表达，可作为胃癌患者早期诊断的一个有价值的参考依据，对临床治疗具有一定的指导意义.
施秀清，女，1947-10-18生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族. 1972年毕业于延边医学院医疗系，主治医师，感染控制科主任，主要从事消化疾病的诊治研究.
通讯作者 施秀清，161000，解放军203医院消化内科，黑龙江省齐齐哈尔市建设大街59号.
Correspondence to: Dr. SHI Xiou-Qing, Department of Gastroenterology, Department of Pathology, Chinese PLA 203 Hospital, 59 Jianshe Street, Qiqihaer 161000, Heilongjiang Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86*452*2112355-4431
收稿日期 1997-05-06 修回日期 1997-09-03
4 参考文献
1 倪灿荣. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京：北京科学技术出版社，1993：261-269
2 苏慧慈. 原位杂交. 北京：中国科学技术出版社，1994：34-51
3 Chan F, Yeger H, Pawlin G, Arriza JL, Swanson LW, Simmons DM et al. in situ hybridization of mRNA with biotin and digoxigenin labeled probes. J Histotechnol, 1994;17(3):301-306
, http://www.100md.com
4 Can FY, Luk CD, Cesell MS, Sawchenko PE, Swanson LW, Davis LG et al. Nonradioactive in situ hybridization technioues for routinely prepared pathology specimel and cultured cells. J Histotechnol, 1994;17(3):313-319
5 王江，倪灿荣. P53, ras P21,c-erbB-2癌基因蛋白在胃癌中的表达及分布特征. 第二军医大学学报，1994；15(1)：20-22
6 Viaene AL, Baert JH. Localization of cytokeratin 4 mRNA in human oesophageal epithelium by non-radioactive in situ hybridization. Histochem J, 1994;26(1):50-54
, 百拇医药
7 Tatsuta M, Iishi H, Baba M, Nakaizumi A, Uehara H, Taniguchi H et al. Expression of c-myc mRNA as an aid in histologic differentiation of adenoma from well differentiated adenocarcinoma in the stomach. Cancer, 1994;73(7):1795-1799
8 Houldsworth J, Cordon-corido C, ladanyi M, Kelsen DP, Chaganti RS. Gene amplification in gastric and esophageal adenocarcinoma. Cancer Res, 1990;50(22):6417-6422
9 Czerniak B, Herz F, Corczyca W, Koss LG. Expression of ras oncogene P21 protein in early gastric carcinoma and adjucent gastric epithelia. Cancer, 1989;64(6):1467-1473
10 Ninomiya I, Yonemura Y, Matsumoto H, Sugiyama K, Kamata T, Miwa K et al. Expression of c-myc gene product in gastric carcinoma. Oncology, 1991;48(1):149-154, 百拇医药(施秀清1 李 功1 李春生1 倪灿荣2 栾 汛1 曲 阳1)