原发性肝癌转移与ras p53基因及其蛋白表达的关系*
作者：郑世曦1 刘丽江2 邵永胜3 郑清平1 阮幼冰1 武忠弼1
单位：1同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室 湖北省武汉市 430030;武汉职工医学院 2病理教研室; 3附属医院外科 430015
关键词：基因，p53；蛋白质P53/代谢；肝肿瘤/病理学；癌，肝细胞/病理学；肿瘤转移
华人消化杂志980205.htm Relationship between ras p53 gene RNA and protein expression and HCC metastasis*
ZHENG Shi-Xi1, LIU Li-Jiang2, SHAO Yong-Sheng3, ZHENG Qing-Ping1, RUAN You-Bing1 and WU Zhong-Bi1
, 百拇医药
1Department of Ultrastructural Pathology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
2Department of Pathology, and 3Department of Surgery, Wuhan Postgraduate Medical College, Wuhan 430015, Hubei Province, China
Subject headings genes, p53; protein P53/metabolism; liver neoplasms/pathology; carcinoma, hepatocellular/pathology; neoplasm metastasis
, 百拇医药
Abstract
AIM To understand the relationship between the expression of both ras and p53 gene RNA and protein and the metastasis of primary hepatocellular carcinoma (HCC).
METHODS Immunohistochemistry and slot blot were used to study ras and p53 gene protein and RNA in 14 cases of HCC with metastasis and 16 cases of HCC without metastasis respectively.
RESULTS After microwave treatment, the positive rates of both p21 and p53 protein in 14 cases of HCC with metastasis were significantly higher than that without metastasis (11/14 vs 5/16, P=0.014 and 12/14 vs 7/16, P=0.026， respectively). The results of slot blot showed that OD value of N-ras RNA in HCC with metastasis was 3 to 5 times higher than that in HCC without metastasis, whereas OD value of p53 RNA had no difference between the two groups.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Immunohistochemistry of p21 and p53 protein after antigen retrieval is a useful index for patients with HCC metastatic potential.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 了解ras,p53基因及其蛋白表达与原发性肝细胞癌(HCC)转移的关系.
方法 应用免疫组化、狭缝杂交分别对14例HCC有转移者和16例无转移者癌组织中ras,p53基因蛋白和RNA表达进行了研究.
结果 经微波修复抗原后，在14例有转移HCC组织中，P21和P53蛋白的阳性例数分别为11例和12例，在16例无转移HCC组织中，其阳性例数分别为5例和7例，两组间具有极显著性差异(P值分别为0.014和0.026). HCC有转移组N-ras RNA为无转移组的3～5倍，而两组间P53 RNA量则几乎相等.
, 百拇医药
结论 经微波修复抗原后，P21和P53蛋白的免疫组化染色可作为衡量HCC转移潜能的指标.
0 引言
ras癌基因和p53抑癌基因分别编码Mr 21 000和Mr 53 000的蛋白—P21和P53蛋白. P21和P53蛋白异常表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关[1，2]，但也有少数学者认为并没有关系[3]. 产生分歧的原因可能与多种因素有关，其中标本处理方法不同可能是重要原因之一. 我们通过微波修复抗原后对石蜡包埋的原发性肝癌(HCC)组织中P21和P53蛋白表达及癌组织中ras和p53基因存在状况进行了研究，以了解它们与HCC转移的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 男性HCC手术标本30例，其中14例患者经影象学检查发现有肝外脏器转移或经病理学检查发现门静脉癌栓或肝门淋巴结内有癌细胞；另外16例患者无转移. 部分标本经40?g/L多聚甲醛固定6?h，常规石蜡包埋；另取部分立即投入液氮保存. pan ras p21小鼠抗人抗体(工作浓度1∶80)及p53小鼠抗人抗体(Pab 1801,工作浓度1∶40)系Dako公司产品. N-ras,p53(5～8外显子)cDNA探针均购于北京中山试剂公司，〔α-32P〕-dCTP购于北京原子能研究所. SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司.
, 百拇医药
1.2 方法 石蜡切片5?μm经微波修复抗原后采用免疫组化(SABC法)检测pan ras P21及P53蛋白[4]. 阳性对照为已知其阳性的乳腺癌组织，以PBS代替一抗作阴性对照. 应用狭缝杂交检测组织中ras和P53 RNA. ras,P53 cDNA探针标记、癌组织RNA提取及狭缝杂交过程均按分子克隆[5]进行. 放射自显影片经TJTY-300图象分析仪处理背景并扫描，测每一狭缝斑点的积分光密度值.
2 结果
2.1 免疫组化结果 对pan ras P21蛋白而言，凡癌细胞浆中和(或)胞核上有棕黄色颗粒即为阳性；对P53蛋白而言，凡大于5%的癌细胞胞核被染成棕黄色即为阳性；癌细胞浆着染和小于5%的癌细胞胞核着染视为阴性[2]. 14例HCC有转移者中，pan ras P21,P53蛋白阳性例数分别为11例和12例；16例HCC无转移者中其阳性例数分别为5例和7例(图1，2). HCC有转移组两种蛋白的表达率均显著高于未转移组(P值分别为0.014和0.026).
, 百拇医药
2.2 狭缝杂交结果 HCC转移组N-ras RNA的平均A(OD)值为5.85，无转移组平均A(OD)值为1.67；HCC转移组P53 RNA的平均A值为4.32，无转移组平均A值为4.28(图3，4).
图1 pan ras P21免疫组化结果(SABC法，×200) 阳性颗粒分布于癌细胞胞浆和胞核内.
图2 P53免疫组化结果(SABC法，×200) 阳性颗粒分布于胞核内.
图3 HCC组织中N-ras RNA狭缝杂交结果 左侧四条带为无转移组.
图4 HCC组织中P53 RNA狭缝杂交结果 左侧四条带为无转移组.
3 讨论
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ras基因家族中包括Ha-ras,Ki-ras和N-ras三种癌基因，它们通过编码的pan ras P21蛋白来行使细胞转化功能. 所以，研究P21蛋白的表达可以了解ras基因激活、扩增情况. p53抑癌基因通过其编码的野生型P53蛋白抑制细胞转化，但由于其T1/2短而不能被检测出来. 当p53基因发生突变或野生型P53蛋白与某些成分结合失去其功能而成为突变型P53蛋白时，其T1/2大大延长，故可以利用免疫学方法检测出来. 鉴于ras基因和p53抑癌基因在肿瘤发生、发展中起重要作用，所以深入研究ras和p53的意义，将为人类控制肿瘤发生、预防肿瘤发展起重要作用. 石蜡包埋的组织标本为我们研究其蛋白表达提供了极大的方便，但组织在固定、包埋过程中常会失活，应用免疫组化检测时常常会出现假阴性[6]. 微波是一种高频电磁波，能发射出高能量，当用其处理这些组织后，能使其抗原性得以恢复，从而提高免疫组化的阳性率[7]. Takeshi et al[1]和Gallo et al[2]应用微波修复抗原技术分别对石蜡包埋的肺腺癌和甲状腺癌癌组织中的P53蛋白进行的免疫组化研究表明，其表达与局部及全身转移密切相关. Takeshi et al[1]发现在浸润转移癌的早期就能检出P21蛋白. 我们对微波修复抗原后的HCC标本癌组织中pan ras P21和P53蛋白进行的研究也表明，它们的出现与转移密切相关.
, http://www.100md.com
我们对HCC癌组织总RNA中N-ras，p53基因进行的研究表明，转移组N-ras RNA的表达为未转移组的3～5倍，与P21蛋白结果相一致；但是两组P53 RNA的表达无明显差别，此结果与P53蛋白的结果不一致. 究其原因可能有下列几点：①p53基因的某些突变如移码突变(frameshift mutations)和无意义突变(non-sense mutations)无稳定的P53蛋白产生[8]. ②p53基因虽未发生突变，但P53蛋白可以与某些成分结合形成稳定的无功能的P53蛋白[8]. ③发生于5～8外显子之外的基因突变产生了突变型P53蛋白. 由此可见，我们认为，经微波修复抗原后，P21,P53蛋白的免疫组化染色可作为衡量HCC转移的重要指标.
郑世曦，男，1967-03-28生，湖北省武汉市人，汉族. 1990年同济医科大学临床医学专业毕业，医学博士，主要从事于肝癌的实验与临床基础研究，发表中英文论文10篇.
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助，No. 39070376.
通讯作者 郑世曦，430030，湖北省武汉市，同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室，现在中国科学院上海药物研究所药理一室，200031，上海市太原路294号.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39070376.
Correspondence to: Dr. ZHENG Shi-Yi, Department of Pharmacology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 294 Taiyuan Road, Shanghai 200031, China
, http://www.100md.com
Tel. +86*21* 64311833-309
收稿日期 1997-09-02
4 参考文献
1 Takeshi I, Keiko H, Yasuhiro Y, Fujiwara Y, Yamakido M. Prognostic significance of p53 and ras gene abnormalities in lung adenocarcinoma patients with stage I disease after curative resection. Jpn J Cancer Res, 1994;85(12):1240-1246
2 Gallo O, Franchi A, Bianchi S, Boddi V, Gianneli E, Alajimo E. p53 oncoprotein expression in parotid gland carcinoma is associated with clinical outcome. Cancer, 1995;75(8):2037-2044
, 百拇医药
3 Brambilla E, Gazzeri S, Moro D, de Fromental CC, Gouyer V, Jacrot M. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. Am J Pathol, 1993;143(1):199-210
4 Zheng SX, Wu ZB, Ruan YB. The relationship between 67kD laminin receptor expression and the metastasis of HCC. J Tongji Med Univ, 1997;17(in press)
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab Press, 1989:B1
, 百拇医药
6 Fischer CJ, Gillett CE, Vojtesek B, Barnes DM, Millis RR. Problems with p53 immunohistochemical staining: the effect of fixation and variation in methods of evaluation. Br J Cancer, 1994;69(1):26-31
7 Resnick JM, Cherwitz D, Knapp D, Uhlman D, Niehans CA. A microwave method that enhances detection of aberrant p53 expression in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Arch Pathol Lab Med, 1995;119(4):360-366
8 Soussi T, Legros Y, Lubin R, Ory K, Schlichtholz B. Mutifactorial analysis of alteration in human cancer: A review. Int J Cancer, 1994;57(1):1-9, 百拇医药(郑世曦1 刘丽江2 邵永胜3 郑清平1 阮幼冰1 武忠弼1)
单位：1同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室 湖北省武汉市 430030;武汉职工医学院 2病理教研室; 3附属医院外科 430015
关键词：基因，p53；蛋白质P53/代谢；肝肿瘤/病理学；癌，肝细胞/病理学；肿瘤转移
华人消化杂志980205.htm Relationship between ras p53 gene RNA and protein expression and HCC metastasis*
ZHENG Shi-Xi1, LIU Li-Jiang2, SHAO Yong-Sheng3, ZHENG Qing-Ping1, RUAN You-Bing1 and WU Zhong-Bi1
, 百拇医药
1Department of Ultrastructural Pathology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
2Department of Pathology, and 3Department of Surgery, Wuhan Postgraduate Medical College, Wuhan 430015, Hubei Province, China
Subject headings genes, p53; protein P53/metabolism; liver neoplasms/pathology; carcinoma, hepatocellular/pathology; neoplasm metastasis
, 百拇医药
Abstract
AIM To understand the relationship between the expression of both ras and p53 gene RNA and protein and the metastasis of primary hepatocellular carcinoma (HCC).
METHODS Immunohistochemistry and slot blot were used to study ras and p53 gene protein and RNA in 14 cases of HCC with metastasis and 16 cases of HCC without metastasis respectively.
RESULTS After microwave treatment, the positive rates of both p21 and p53 protein in 14 cases of HCC with metastasis were significantly higher than that without metastasis (11/14 vs 5/16, P=0.014 and 12/14 vs 7/16, P=0.026， respectively). The results of slot blot showed that OD value of N-ras RNA in HCC with metastasis was 3 to 5 times higher than that in HCC without metastasis, whereas OD value of p53 RNA had no difference between the two groups.
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CONCLUSION Immunohistochemistry of p21 and p53 protein after antigen retrieval is a useful index for patients with HCC metastatic potential.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 了解ras,p53基因及其蛋白表达与原发性肝细胞癌(HCC)转移的关系.
方法 应用免疫组化、狭缝杂交分别对14例HCC有转移者和16例无转移者癌组织中ras,p53基因蛋白和RNA表达进行了研究.
结果 经微波修复抗原后，在14例有转移HCC组织中，P21和P53蛋白的阳性例数分别为11例和12例，在16例无转移HCC组织中，其阳性例数分别为5例和7例，两组间具有极显著性差异(P值分别为0.014和0.026). HCC有转移组N-ras RNA为无转移组的3～5倍，而两组间P53 RNA量则几乎相等.
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结论 经微波修复抗原后，P21和P53蛋白的免疫组化染色可作为衡量HCC转移潜能的指标.
0 引言
ras癌基因和p53抑癌基因分别编码Mr 21 000和Mr 53 000的蛋白—P21和P53蛋白. P21和P53蛋白异常表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关[1，2]，但也有少数学者认为并没有关系[3]. 产生分歧的原因可能与多种因素有关，其中标本处理方法不同可能是重要原因之一. 我们通过微波修复抗原后对石蜡包埋的原发性肝癌(HCC)组织中P21和P53蛋白表达及癌组织中ras和p53基因存在状况进行了研究，以了解它们与HCC转移的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 男性HCC手术标本30例，其中14例患者经影象学检查发现有肝外脏器转移或经病理学检查发现门静脉癌栓或肝门淋巴结内有癌细胞；另外16例患者无转移. 部分标本经40?g/L多聚甲醛固定6?h，常规石蜡包埋；另取部分立即投入液氮保存. pan ras p21小鼠抗人抗体(工作浓度1∶80)及p53小鼠抗人抗体(Pab 1801,工作浓度1∶40)系Dako公司产品. N-ras,p53(5～8外显子)cDNA探针均购于北京中山试剂公司，〔α-32P〕-dCTP购于北京原子能研究所. SABC试剂盒购于武汉博士德生物工程公司.
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1.2 方法 石蜡切片5?μm经微波修复抗原后采用免疫组化(SABC法)检测pan ras P21及P53蛋白[4]. 阳性对照为已知其阳性的乳腺癌组织，以PBS代替一抗作阴性对照. 应用狭缝杂交检测组织中ras和P53 RNA. ras,P53 cDNA探针标记、癌组织RNA提取及狭缝杂交过程均按分子克隆[5]进行. 放射自显影片经TJTY-300图象分析仪处理背景并扫描，测每一狭缝斑点的积分光密度值.
2 结果
2.1 免疫组化结果 对pan ras P21蛋白而言，凡癌细胞浆中和(或)胞核上有棕黄色颗粒即为阳性；对P53蛋白而言，凡大于5%的癌细胞胞核被染成棕黄色即为阳性；癌细胞浆着染和小于5%的癌细胞胞核着染视为阴性[2]. 14例HCC有转移者中，pan ras P21,P53蛋白阳性例数分别为11例和12例；16例HCC无转移者中其阳性例数分别为5例和7例(图1，2). HCC有转移组两种蛋白的表达率均显著高于未转移组(P值分别为0.014和0.026).
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2.2 狭缝杂交结果 HCC转移组N-ras RNA的平均A(OD)值为5.85，无转移组平均A(OD)值为1.67；HCC转移组P53 RNA的平均A值为4.32，无转移组平均A值为4.28(图3，4).
图1 pan ras P21免疫组化结果(SABC法，×200) 阳性颗粒分布于癌细胞胞浆和胞核内.
图2 P53免疫组化结果(SABC法，×200) 阳性颗粒分布于胞核内.
图3 HCC组织中N-ras RNA狭缝杂交结果 左侧四条带为无转移组.
图4 HCC组织中P53 RNA狭缝杂交结果 左侧四条带为无转移组.
3 讨论
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ras基因家族中包括Ha-ras,Ki-ras和N-ras三种癌基因，它们通过编码的pan ras P21蛋白来行使细胞转化功能. 所以，研究P21蛋白的表达可以了解ras基因激活、扩增情况. p53抑癌基因通过其编码的野生型P53蛋白抑制细胞转化，但由于其T1/2短而不能被检测出来. 当p53基因发生突变或野生型P53蛋白与某些成分结合失去其功能而成为突变型P53蛋白时，其T1/2大大延长，故可以利用免疫学方法检测出来. 鉴于ras基因和p53抑癌基因在肿瘤发生、发展中起重要作用，所以深入研究ras和p53的意义，将为人类控制肿瘤发生、预防肿瘤发展起重要作用. 石蜡包埋的组织标本为我们研究其蛋白表达提供了极大的方便，但组织在固定、包埋过程中常会失活，应用免疫组化检测时常常会出现假阴性[6]. 微波是一种高频电磁波，能发射出高能量，当用其处理这些组织后，能使其抗原性得以恢复，从而提高免疫组化的阳性率[7]. Takeshi et al[1]和Gallo et al[2]应用微波修复抗原技术分别对石蜡包埋的肺腺癌和甲状腺癌癌组织中的P53蛋白进行的免疫组化研究表明，其表达与局部及全身转移密切相关. Takeshi et al[1]发现在浸润转移癌的早期就能检出P21蛋白. 我们对微波修复抗原后的HCC标本癌组织中pan ras P21和P53蛋白进行的研究也表明，它们的出现与转移密切相关.
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我们对HCC癌组织总RNA中N-ras，p53基因进行的研究表明，转移组N-ras RNA的表达为未转移组的3～5倍，与P21蛋白结果相一致；但是两组P53 RNA的表达无明显差别，此结果与P53蛋白的结果不一致. 究其原因可能有下列几点：①p53基因的某些突变如移码突变(frameshift mutations)和无意义突变(non-sense mutations)无稳定的P53蛋白产生[8]. ②p53基因虽未发生突变，但P53蛋白可以与某些成分结合形成稳定的无功能的P53蛋白[8]. ③发生于5～8外显子之外的基因突变产生了突变型P53蛋白. 由此可见，我们认为，经微波修复抗原后，P21,P53蛋白的免疫组化染色可作为衡量HCC转移的重要指标.
郑世曦，男，1967-03-28生，湖北省武汉市人，汉族. 1990年同济医科大学临床医学专业毕业，医学博士，主要从事于肝癌的实验与临床基础研究，发表中英文论文10篇.
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*国家自然科学基金资助，No. 39070376.
通讯作者 郑世曦，430030，湖北省武汉市，同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室，现在中国科学院上海药物研究所药理一室，200031，上海市太原路294号.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39070376.
Correspondence to: Dr. ZHENG Shi-Yi, Department of Pharmacology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 294 Taiyuan Road, Shanghai 200031, China
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Tel. +86*21* 64311833-309
收稿日期 1997-09-02
4 参考文献
1 Takeshi I, Keiko H, Yasuhiro Y, Fujiwara Y, Yamakido M. Prognostic significance of p53 and ras gene abnormalities in lung adenocarcinoma patients with stage I disease after curative resection. Jpn J Cancer Res, 1994;85(12):1240-1246
2 Gallo O, Franchi A, Bianchi S, Boddi V, Gianneli E, Alajimo E. p53 oncoprotein expression in parotid gland carcinoma is associated with clinical outcome. Cancer, 1995;75(8):2037-2044
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3 Brambilla E, Gazzeri S, Moro D, de Fromental CC, Gouyer V, Jacrot M. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. Am J Pathol, 1993;143(1):199-210
4 Zheng SX, Wu ZB, Ruan YB. The relationship between 67kD laminin receptor expression and the metastasis of HCC. J Tongji Med Univ, 1997;17(in press)
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Lab Press, 1989:B1
, 百拇医药
6 Fischer CJ, Gillett CE, Vojtesek B, Barnes DM, Millis RR. Problems with p53 immunohistochemical staining: the effect of fixation and variation in methods of evaluation. Br J Cancer, 1994;69(1):26-31
7 Resnick JM, Cherwitz D, Knapp D, Uhlman D, Niehans CA. A microwave method that enhances detection of aberrant p53 expression in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Arch Pathol Lab Med, 1995;119(4):360-366
8 Soussi T, Legros Y, Lubin R, Ory K, Schlichtholz B. Mutifactorial analysis of alteration in human cancer: A review. Int J Cancer, 1994;57(1):1-9, 百拇医药(郑世曦1 刘丽江2 邵永胜3 郑清平1 阮幼冰1 武忠弼1)