bhrf1表达对喜树碱诱发鼻咽癌细胞凋亡的影响
作者：黄海 周江红 胡晋红 潘星华 余龙 孔宪涛 周水淼 李兆基 孙喜元 傅强
单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(黄海、周水淼、李兆基)；第二军医大学附属长海医院药局(周江红、胡晋红)；Yale University, USA(潘星华)；上海复旦大学遗传学研究所(余龙、孙喜元、傅强)；第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心实验室(孔宪涛)
关键词：
中华医学杂志/980222 非洲淋巴细胞瘤病毒(EB)感染与鼻咽癌的发生和发展具有相关性，EB病毒基因bhrf1与原癌基因bcl-2具有同源性并保护细胞免于凋亡。我们通过构建携有bhrf1 (BamHI-H right ward reading frame Ⅰ)的高表达载体并转导到鼻咽癌细胞株CNE2细胞中，然后观察用DNA损伤性药物喜树碱处理后其细胞生物学行为的改变，以探讨bhrfl表达对鼻咽癌细胞凋亡能力的影响。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.bhrf1重组表达载体的构建和鉴定：质粒bhrf1-pSG5和pcDNA3用XBaⅠ和EcoRI酶切，回收纯化bhrf1和pcDNA3片段，T4连接酶连接。
2.重组表达质粒的转染及筛选：(1) 通过脂质体介导将质粒bhrf1-pcDNA3转导到CNE2细胞中，加 G418筛选稳定表达新霉素抗性的细胞；(2) Northern杂交检测转染细胞bhrf1的表达。
3.bhrf1达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡能力的影响：将bhrf1-CNE2细胞、空载体-CNE2细胞和CNE2细胞用低浓度的喜树碱处理后：(1) 用MTT评价细胞的生存情况；(2) 用流式细胞仪分析细胞周期各时相分布的改变；(3) 原位末端标记法检测各组细胞的凋亡情况；(4) 检测软琼脂集落形成情况。
二、结果
, 百拇医药
1.重组bhrf1高表达载体的酶切鉴定：重组bhrf1-pcDNA3质粒用XBaⅠ和EcoRⅠ酶切后，电泳检查发现其有大小约0.9kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)。
A pcDNA3质粒；B XBaⅠ和EcoRⅠ酶切后提纯的pcDNA3片段；C bhrf1片段；D bhrf1-pcDNA3重组质粒(XBaⅠ、EcoRⅠ酶切后)；E λDNA/HindⅢ+EcorIM arkers；F、bhrf1-psG5质粒(XBaⅠ、EcoRⅠ酶切后)；G bhrf1-psG5质粒图1 重组bhrf1表达质粒的酶切电泳图谱
2.转染细胞bhrf1表达的检测：bhrf1-CNE2细胞的mRNA为阳性，而对照组的mRNA未显影，说明bhrf1在转染细胞中已经表达(图2)。
, 百拇医药
B bhrf1探针杂交；a. bhrf1-CNE2细胞；b. 空载体-CNE2细胞；c.CNE2细胞图2 Northern杂交检测转染细胞bhrf1的表达
3.bhrf1表达对CNE2细胞生存能力的影响：对照组的肿瘤细胞在加喜树碱培养后，细胞数在48小时内即迅速下降，致第6、7天，细胞全部死亡；而bhrf1-CNE2细胞组则表现为持续缓慢的下降，至第10天细胞才基本死亡。
4.bhrf1表达对CNE2细胞周期分布的影响：从表1可见，在喜树碱处理前，bhrf1-CNE2细胞位于G1期的百分比较对照组为高，而位 于 S期的细胞百分比较少，其间的差异有显著的意义
(0.01
, http://www.100md.com (P>0.05)。在处理后，bhrf1-CNE2细胞的凋亡率小于对照组(0.01
细胞内的棕色团块为生物素标记的损伤DNA ×400倍图3 原位末端标记法检测CNE2细胞的凋亡情况
5.原位末端标记法检测bhrf1表达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡能力的影响：凋亡细胞内可见棕色团块染色(图3)。经喜树碱处理后各组的凋亡指数分别为，bhrf1-CNE2细胞：29.5±5.43；空载体-CNE2细胞：69.7±12.42；CNE2细胞：73.3±14.33。经统计学处理(t检验)，bhrf1-CNE2细胞与空载体-CNE2和CNE2细胞间的差异有显著意义(P<0.01)；空载体-CNE2细胞与CNE2细胞间的差异无显著意义(P>0.05)。
, 百拇医药
6.软琼脂集落形成情况：如表2，未
表1 bhrf1基因表达抑制喜树碱致鼻咽癌细胞凋亡的流式细胞仪检测结果(%) 细胞
用药前
用药后
凋亡率
G1期
G2期
S期
凋亡率
G1期
G2期
S期
, 百拇医药
CNE2
0.4
46.6
17.2
36.2
32.3
67.4
24.1
8.5
空载体-CNE2
0.5
48.5
, 百拇医药 18.4
33.1
29.5
62.3
27.2
10.5
bhrf1-CNE2
0.2
59.2
23.2
17.6
15.2
53.4
, 百拇医药
9.4
37.2
表2 bhrf1表达对CNE2细胞集落形成能力影响的研究(
±s) 细胞
喜树碱
处理
集落形成率
(%)
CNE2
-
53.63±11.45
空载体-CNE2
, 百拇医药
-
55.50±7.16
bhrf1-CNE2
-
53.53±7.86
CNE2
+
8.93±7.77
空载体-CNE2
+
10.43±7.47
bhrf1-CNE2
, 百拇医药
+
31.86±6.79
经喜树碱处理的三组细胞的集落形成率间的差别无显著意义(P>0.05)；经喜树碱处理的三组细胞间，bhrf1-CNE2细胞组的集落形成率大于对照组，其与两对照组间的差别有非常显著的意义(P<0.01)，CNE2与空载体-CNE2组间的差别无显著意义(P>0.05)，以上数据处理为χ检验。
三、讨论
bhrfl是EB病毒基因编码的一种即早期蛋白，其与bcl-2具有部分相同的蛋白序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细胞程序性死亡、维持持续生长的能力[1]。Dawson发现，将bhrf1转染到人鳞癌细胞株 SCC12F细胞中，bhrf1在肿瘤细胞中的表达可延缓细胞的终末分化、增加抵抗DNA损伤药物和促进其在无血清情况下生存以达到防止细胞凋亡的发生[2，3]。
, http://www.100md.com
喜树碱为细胞周期特异性药物，其主要 作用于S期，可选择性地抑制拓扑异构酶Ⅰ，而干扰DNA的复制，阻止细胞进入分裂期，引起肿瘤细胞DNA裂解而导致肿瘤细胞凋亡的发生[4]。
本研究发现，bhrf1可调节CNE2细胞周期的分布，提高其位于G1期细胞的百分比，从而提高其对喜树碱的耐受性，抑制喜树碱诱发的细胞凋亡的发生，其凋亡率明显低于对照组，并延长其在低浓度喜树碱中的生存时间。在喜树碱处理后，bhrf1表达细胞的S期细胞百分比增多，说明其DNA合成活跃，细胞的修复能力增强，其软琼脂集落形成能力强于对照组。
本实验结果证明，bhrf1的表达可通过促使CNE2细胞周期的重新分布而增强其抵抗DNA损伤药物诱发的细胞凋亡，提示其可能与鼻咽癌的发生和发展有关。
本课题为全军医药卫生青年基金资助项目参考文献
, http://www.100md.com 1Hickish T, Robertson D, Clarke P, et al. Ultrastructural localization of BHRF1: An Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res, 1994, 54：2808-2811.
2Huen D, Rowe M, Dawson C, et al. Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a viral homologue of bcl-2, protects human B cells from programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90：8479-8483.
3Dawson CW, Eliopoulos AG, Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene, 1995, 9：69-77.
4Shimizu T, Pommier Y. DNA fragmentation induced by protease activation in p53-null human leukemia HL60 cells undergoing apoptosis following treatment with the topoisomerase Ⅰ inhibitor camptothecin: cell-free system studies. Experimental Cell Res, 1996, 226：292-301. (收稿：1997-04-02 修回：1997-11-03), 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(黄海、周水淼、李兆基)；第二军医大学附属长海医院药局(周江红、胡晋红)；Yale University, USA(潘星华)；上海复旦大学遗传学研究所(余龙、孙喜元、傅强)；第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心实验室(孔宪涛)
关键词：
中华医学杂志/980222 非洲淋巴细胞瘤病毒(EB)感染与鼻咽癌的发生和发展具有相关性，EB病毒基因bhrf1与原癌基因bcl-2具有同源性并保护细胞免于凋亡。我们通过构建携有bhrf1 (BamHI-H right ward reading frame Ⅰ)的高表达载体并转导到鼻咽癌细胞株CNE2细胞中，然后观察用DNA损伤性药物喜树碱处理后其细胞生物学行为的改变，以探讨bhrfl表达对鼻咽癌细胞凋亡能力的影响。
, 百拇医药
一、材料与方法
1.bhrf1重组表达载体的构建和鉴定：质粒bhrf1-pSG5和pcDNA3用XBaⅠ和EcoRI酶切，回收纯化bhrf1和pcDNA3片段，T4连接酶连接。
2.重组表达质粒的转染及筛选：(1) 通过脂质体介导将质粒bhrf1-pcDNA3转导到CNE2细胞中，加 G418筛选稳定表达新霉素抗性的细胞；(2) Northern杂交检测转染细胞bhrf1的表达。
3.bhrf1达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡能力的影响：将bhrf1-CNE2细胞、空载体-CNE2细胞和CNE2细胞用低浓度的喜树碱处理后：(1) 用MTT评价细胞的生存情况；(2) 用流式细胞仪分析细胞周期各时相分布的改变；(3) 原位末端标记法检测各组细胞的凋亡情况；(4) 检测软琼脂集落形成情况。
二、结果
, 百拇医药
1.重组bhrf1高表达载体的酶切鉴定：重组bhrf1-pcDNA3质粒用XBaⅠ和EcoRⅠ酶切后，电泳检查发现其有大小约0.9kb的片段，提示重组高表达载体构建成功(图1)。
A pcDNA3质粒；B XBaⅠ和EcoRⅠ酶切后提纯的pcDNA3片段；C bhrf1片段；D bhrf1-pcDNA3重组质粒(XBaⅠ、EcoRⅠ酶切后)；E λDNA/HindⅢ+EcorIM arkers；F、bhrf1-psG5质粒(XBaⅠ、EcoRⅠ酶切后)；G bhrf1-psG5质粒图1 重组bhrf1表达质粒的酶切电泳图谱
2.转染细胞bhrf1表达的检测：bhrf1-CNE2细胞的mRNA为阳性，而对照组的mRNA未显影，说明bhrf1在转染细胞中已经表达(图2)。
, 百拇医药
B bhrf1探针杂交；a. bhrf1-CNE2细胞；b. 空载体-CNE2细胞；c.CNE2细胞图2 Northern杂交检测转染细胞bhrf1的表达
3.bhrf1表达对CNE2细胞生存能力的影响：对照组的肿瘤细胞在加喜树碱培养后，细胞数在48小时内即迅速下降，致第6、7天，细胞全部死亡；而bhrf1-CNE2细胞组则表现为持续缓慢的下降，至第10天细胞才基本死亡。
4.bhrf1表达对CNE2细胞周期分布的影响：从表1可见，在喜树碱处理前，bhrf1-CNE2细胞位于G1期的百分比较对照组为高，而位 于 S期的细胞百分比较少，其间的差异有显著的意义
(0.01
, http://www.100md.com (P>0.05)。在处理后，bhrf1-CNE2细胞的凋亡率小于对照组(0.01
细胞内的棕色团块为生物素标记的损伤DNA ×400倍图3 原位末端标记法检测CNE2细胞的凋亡情况
5.原位末端标记法检测bhrf1表达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡能力的影响：凋亡细胞内可见棕色团块染色(图3)。经喜树碱处理后各组的凋亡指数分别为，bhrf1-CNE2细胞：29.5±5.43；空载体-CNE2细胞：69.7±12.42；CNE2细胞：73.3±14.33。经统计学处理(t检验)，bhrf1-CNE2细胞与空载体-CNE2和CNE2细胞间的差异有显著意义(P<0.01)；空载体-CNE2细胞与CNE2细胞间的差异无显著意义(P>0.05)。
, 百拇医药
6.软琼脂集落形成情况：如表2，未
表1 bhrf1基因表达抑制喜树碱致鼻咽癌细胞凋亡的流式细胞仪检测结果(%) 细胞
用药前
用药后
凋亡率
G1期
G2期
S期
凋亡率
G1期
G2期
S期
, 百拇医药
CNE2
0.4
46.6
17.2
36.2
32.3
67.4
24.1
8.5
空载体-CNE2
0.5
48.5
, 百拇医药 18.4
33.1
29.5
62.3
27.2
10.5
bhrf1-CNE2
0.2
59.2
23.2
17.6
15.2
53.4
, 百拇医药
9.4
37.2
表2 bhrf1表达对CNE2细胞集落形成能力影响的研究(
±s) 细胞喜树碱
处理
集落形成率
(%)
CNE2
-
53.63±11.45
空载体-CNE2
, 百拇医药
-
55.50±7.16
bhrf1-CNE2
-
53.53±7.86
CNE2
+
8.93±7.77
空载体-CNE2
+
10.43±7.47
bhrf1-CNE2
, 百拇医药
+
31.86±6.79
经喜树碱处理的三组细胞的集落形成率间的差别无显著意义(P>0.05)；经喜树碱处理的三组细胞间，bhrf1-CNE2细胞组的集落形成率大于对照组，其与两对照组间的差别有非常显著的意义(P<0.01)，CNE2与空载体-CNE2组间的差别无显著意义(P>0.05)，以上数据处理为χ检验。
三、讨论
bhrfl是EB病毒基因编码的一种即早期蛋白，其与bcl-2具有部分相同的蛋白序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细胞程序性死亡、维持持续生长的能力[1]。Dawson发现，将bhrf1转染到人鳞癌细胞株 SCC12F细胞中，bhrf1在肿瘤细胞中的表达可延缓细胞的终末分化、增加抵抗DNA损伤药物和促进其在无血清情况下生存以达到防止细胞凋亡的发生[2，3]。
, http://www.100md.com
喜树碱为细胞周期特异性药物，其主要 作用于S期，可选择性地抑制拓扑异构酶Ⅰ，而干扰DNA的复制，阻止细胞进入分裂期，引起肿瘤细胞DNA裂解而导致肿瘤细胞凋亡的发生[4]。
本研究发现，bhrf1可调节CNE2细胞周期的分布，提高其位于G1期细胞的百分比，从而提高其对喜树碱的耐受性，抑制喜树碱诱发的细胞凋亡的发生，其凋亡率明显低于对照组，并延长其在低浓度喜树碱中的生存时间。在喜树碱处理后，bhrf1表达细胞的S期细胞百分比增多，说明其DNA合成活跃，细胞的修复能力增强，其软琼脂集落形成能力强于对照组。
本实验结果证明，bhrf1的表达可通过促使CNE2细胞周期的重新分布而增强其抵抗DNA损伤药物诱发的细胞凋亡，提示其可能与鼻咽癌的发生和发展有关。
本课题为全军医药卫生青年基金资助项目参考文献
, http://www.100md.com 1Hickish T, Robertson D, Clarke P, et al. Ultrastructural localization of BHRF1: An Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res, 1994, 54：2808-2811.
2Huen D, Rowe M, Dawson C, et al. Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a viral homologue of bcl-2, protects human B cells from programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90：8479-8483.
3Dawson CW, Eliopoulos AG, Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the Bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene, 1995, 9：69-77.
4Shimizu T, Pommier Y. DNA fragmentation induced by protease activation in p53-null human leukemia HL60 cells undergoing apoptosis following treatment with the topoisomerase Ⅰ inhibitor camptothecin: cell-free system studies. Experimental Cell Res, 1996, 226：292-301. (收稿：1997-04-02 修回：1997-11-03), 百拇医药