几丁糖管修复周围神经缺损的实验研究
作者：匡勇 侯春林 苟三怀 顾其胜 徐国祥 李清海
单位：200003 上海,第二军医大学附属长征医院骨科(匡勇、侯春林、苟三怀);上海其胜生物材料技术研究所(顾其胜、徐国祥、李清海)
关键词：几丁糖；周围神经缺损；神经再生
中华创伤杂志/980204.htm 【摘要】 目的 了解几丁糖(chitosan)在修复周围神经缺损中的作用。方法 用2%水溶性几丁糖制成长1.2cm、内径1.2～1.6mm、壁厚200μm的导管,桥接大鼠坐骨神经缺损1.0cm,以对侧正常坐骨神经为对照组。术后16周进行显微解剖学、组织学、辣根过氧化物酶(HRP)示踪等检查。结果 几丁糖导管内有较多的再生神经纤维,相应节段的脊髓前角可见到标记阳性的运动神经元。几丁糖导管变薄,无异物及炎症反应。结论 几丁糖神经导管可为缺损神经提供良好的生长环境。
, http://www.100md.com Nerve Regeneration through Chitosan Nerve Guide in Rats KUANG Yong, HOU Chun-lin, GOU San-huai, et al. Dept. of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Aim To evaluate the nerve regeneration after the implantation of a biodegradable chitosan nerve guide tube in the sciatic nerve in the rats. Methods The biodegradable nerve guide tube with diameter of 1.2～1.6mm and wall of 200um was made of 2% chitosan. Sciatic nerve defects for 1.0mm long were made and bridged with the nerve guide tubes. The nonoperated sciatic nerve from the contralateral leg was used as a control. After 16 weeks, we evaluated the nerve regeneration with horseradish peroxidase (HRP) tracing, histological method and microdissective technique, and the counts of myelinated axons both of the regenerated nerve and of the control were also evaluated. Results The guide tubes successfully enabled the sciatic nerve regeneration across a 10mm gap. HRP labelling for motor neurons in the anterior horn of the spinal cord was positive. A large number of regenerated myelinated axons in the nerve guide could be seen. Remains of chitosan were still present after 16 weeks implantation, but there was no foreign body or inflammatory reaction at this stage. Conclusion Chitosan guide can provide ideal conditions for regeneration and maturation of damaged nerves.
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【Key words】 Chitosan Peripheral nerve damage Nerve regeneration
利用可吸收性生物材料制成的神经导管来修复周围神经缺损,在近十余年中已受到人们的高度重视。笔者曾用几丁质神经导管对4例周围神经缺损患者进行治疗,其中神经缺损最长者达4.5cm。术后6个月,3例患者感觉、运动及肌电检查提示神经功能基本恢复正常,另1例感觉恢复[1]。几丁糖(chitosan)是从几丁质(chitin)脱乙酰基而衍化来的一种高分子化合物,在体内具有良好的生物相容性和可吸收性。笔者将医用几丁糖制成神经导管,修复大鼠坐骨神经缺损1.0cm,对其效果进行初步的探讨。姫ぁ迹拢裕薄材料与方法
一、神经导管的制备
用2%水溶性几丁糖(上海其胜生物材料技术研究所提供)无菌条件下置于特殊模具中制成长1.2cm、内径1.2～1.6mm、壁厚200μm的导管。导管置于75%酒精中、室温下保存,用前24小时等渗盐水漂洗脱去酒精。
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二、手术方法
雄性Wistar大鼠12只(中国科学院上海动物中心提供),体重200～250g。按每百克体重10mg胺酮作腹腔麻醉,俯卧位固定,右侧股后部斜切口,分开臀肌间隙,暴露坐骨神经。切除坐骨神经6mm,自然回缩后置入1.2cm长的神经导管,10倍显微镜下将两端神经置入导管各1mm,使神经实际缺损为1.0cm,11-0尼龙线将神经外膜与管壁各固定1针。左侧坐骨神经为正常对照组。术后16周处死动物,观察神经再生情况。
三、检查项目
1.大体观察:术后定期观察足趾溃疡发生及愈合时间,展趾恢复时间及程度,神经导管在体内的吸收情况。
2.组织学检查:切取右侧坐骨神经远、中、近各段,左侧坐骨神经中段,部分以 10%甲醛固定,HE染色,观察神经生长情况。另一部分用2%戊二醛固定,1%锇酸二次固定,环氧树脂包埋,半薄切片(0.5～1μm),甲苯胺蓝染色,观察再生的有髓神经纤维。超薄切片,醋酸双氧铀柠檬铅染色,高压透射电镜观察再生神经纤维的超微结构。
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3.辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪检查:术后16周,取4只动物于右侧坐骨神经远侧端,用微量注射器刺入神经束内缓缓注入30%HRP(过氧化物酶纯度值>3.0, Sigma)2μl,注射部位用镊子轻轻挫伤,使其易于摄取HRP。观察72小时,在深麻醉下开胸,用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)150ml、1%多聚甲醛和2%戊二醛250ml、10%蔗糖150ml经心脏灌注。取脊髓腰膨大段固定于相同溶剂中3～4小时,作横断面25μm连续冰冻切片,封片后在显微镜下观察脊髓前角中HRP标记阳性的运动神经元。
4.图像分析:用电脑图像分析处理系统测定神经远、中、近各段有髓神经纤维的数目、直径、轴束/神经纤维比值(G比)。每个视野测定100～400根神经纤维。
5.统计学处理:数据间用配对t检验。
结 果
一、大体观察
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术后2周起,手术侧足趾均出现红肿(12/12),其中8只出现溃疡(8/12),4只动物足趾部分坏死脱落骨外露(4/12)。6周时溃疡开始干燥,部分愈合,10周时全部愈合。足趾感觉运动功能术后即刻丧失,12周时有主动抓笼动作出现,针刺足底有较迟钝的展爪动作,16周时抓笼有力,针刺反应灵敏,提示足趾的感觉运动已恢复。几丁糖导管明显变薄,但外观仍较完整,表面有一层富含血管的结缔组织薄膜包裹,两端无明显粘连与缩窄(附图)。神经导管与周围组织易于分离,远、近断神经干与周围组织粘连明显(手术时分离所致)。用镊子轻拉神经近段可使整个神经在张力下移动,无断裂。剥开几丁糖导管,见再生神经已将远、近端神经连接。中段神经较细小,神经连接处未见明显瘢痕形成。
1.低倍镜下见再生神经位于神经导管中央,导管变得松散,分层的导管之间也有再生的神经纤维。纵切面见再生神经纤维排列整齐通过神经导管。高倍镜下
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附图 术后16周,几丁糖导管变薄,表面有一层薄膜(↑),神经已连接 ×10
见再生神经纤维密集,形态正常,周边神经密度与中央神经密度相同,未见瘢痕。沿材料界面有少数巨噬细胞。与正常神经相比,再生的有髓神经明显细小。
2.透射电镜观察,再生的有髓神经和无髓神经排列整齐,髓鞘结构正常。雪旺氏细胞较多,细胞完整,胞浆丰富。数量不等的神经纤维由成纤维细胞包绕成束,胶原纤维增生。几丁糖内的细胞为单核巨细胞,胞体内有大量异物颗粒,可能为吞噬的几丁糖颗粒。未发现有浆细胞及淋巴细胞。
三、HRP标记结果
在脊髓腰膨大灰质前角中,发现HRP标记成黄褐色的运动神经元。高倍镜下数量不等,每个视野1～5个。
四、图像分析
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再生神经各段的有髓神经纤维数量明显多于正常神经,但直径小于正常神经,两者之间相差非常显著(P<0.001)。轴索/G比两者间无差异(P>0.05)。
讨 论
近年来的研究提示,短距离的神经缺损应用生物性导管修复后,其疗效与自体神经移植无明显差异[2]。生物材料通常分为两大类,即非吸收性和可吸收性生物材料。前者由于术后长期存留于体内可造成神经受压而需再次手术取出[3],因此难以为人们所接收。可吸收性神经导管多选用组织相容性极佳的生物材料制成,在体内无异物及炎症反应,随着神经再生的完成而逐渐消失,如聚乳糖(polyglactin)[4]、聚羟基乙酸(PGA)[5]等。笔者所选用的几丁糖是几丁质脱去N-乙酰基的衍生物,分子量在70万左右,化学名为氨基葡萄糖多聚体。其生物学特性与几丁质类似,但比几丁质更具柔韧性,经动物实验证实体内组织相容性好,可吸收[6]。笔者制成的几丁糖神经导管为半透明状,在75%酒精中可长期保存,并保持良好的柔韧性,当用等渗盐水漂洗后脆性增大。从实验中发现,该导管吸收较缓慢,200μm厚的导管在体内16周时仍较完整。这既保证了再生神经的顺利生长,也能防止瘢痕的侵入。Brunelli等[7]认为,理想的神经导管应具备:(1)具有良好的生物相容性和可降解性,能与周围组织融为一体并支持神经再生及成熟;(2)具有足够的长度和直径;(3)导管全长有神经再生所需的物质;(4)可防止瘢痕侵入。几丁糖神经导管与这些条件相近。目前存在的缺点是该材料脆性仍较高,当管壁较薄时易碎裂塌陷。理想的管壁厚度应是在神经再生成熟后即消失,过早消失会导致外周纤维组织侵入,使细小的神经受压迫。管壁过厚会使材料滞留体内,可能会产生局部压迫作用。如何提高几丁糖管壁的强度及韧性,有待进一步研究。
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从再生神经形态学中观察到,再生的神经纤维远较正常神经纤维多,这是由于近端轴索侧支形成的结果。较多数量的神经纤维为长入远侧神经端提供了更多的机会。在神经再生16周时,G比与正常神经相似,提示神经已成熟。但神经直径却与正常的相差较大,这种差距即使在更长时间的观察中也是无法消失的[8]。这很可能是神经修复后功能始终无法崐恢复到正常的原因之一。
参 考 文 献
1 苟三怀,侯春林,王东荣,等.几丁质桥接周围神经的实验研究及临床应用.中华骨科杂志, 1996, 16∶148-151.
2 Mackinnon SE, Dellon AL. Clinical nerve reconstruction with a biodegradable polyglycolic acid tube. Plast Reconstr Surg, 1990, 85∶419-424.
, 百拇医药
3 Lundborg G, Dahlin LB, Danielsen N. Ulnar nerve repair by the silicone chamber technique-case report. Scand J Plast Reconstr Hand Surgery, 1991, 25∶79-82.
4 Molander H, Olsson Y, Engkvist O, et al. Regeneration of peripheral nerve through a polyglactin tube. Muscle and Nerve, 1982, 5∶54-57.
5 Dellon AL, Mackinnon SE. An alternative to the classical nerve graft for the management of the short nerve gap. Plast Reconstr Surg, 1988, 82∶849-856.
, 百拇医药
6 李由,周韵秋,侯春林,等.几丁糖眼内应用的实验研究.第二军医大学学报, 1997, 18∶444-450.
7 Brunelli GA, Vigasio A, Brunelli GR. Different conduits in peripheral nerve surgery. Microsurgery, 1994, 15∶176-178.
8 den Dunnen WFA, van der ler B, Schakenraad JM, et al. Long-term evaluation of nerve regeneration in biodegradable nerve guide. Microsurgery, 1993, 14∶508-510.
本课题受国家自然科学基金资助(No. 39470216)
(收稿:1998-01-05), 百拇医药
单位：200003 上海,第二军医大学附属长征医院骨科(匡勇、侯春林、苟三怀);上海其胜生物材料技术研究所(顾其胜、徐国祥、李清海)
关键词：几丁糖；周围神经缺损；神经再生
中华创伤杂志/980204.htm 【摘要】 目的 了解几丁糖(chitosan)在修复周围神经缺损中的作用。方法 用2%水溶性几丁糖制成长1.2cm、内径1.2～1.6mm、壁厚200μm的导管,桥接大鼠坐骨神经缺损1.0cm,以对侧正常坐骨神经为对照组。术后16周进行显微解剖学、组织学、辣根过氧化物酶(HRP)示踪等检查。结果 几丁糖导管内有较多的再生神经纤维,相应节段的脊髓前角可见到标记阳性的运动神经元。几丁糖导管变薄,无异物及炎症反应。结论 几丁糖神经导管可为缺损神经提供良好的生长环境。
, http://www.100md.com Nerve Regeneration through Chitosan Nerve Guide in Rats KUANG Yong, HOU Chun-lin, GOU San-huai, et al. Dept. of Orthopaedics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Aim To evaluate the nerve regeneration after the implantation of a biodegradable chitosan nerve guide tube in the sciatic nerve in the rats. Methods The biodegradable nerve guide tube with diameter of 1.2～1.6mm and wall of 200um was made of 2% chitosan. Sciatic nerve defects for 1.0mm long were made and bridged with the nerve guide tubes. The nonoperated sciatic nerve from the contralateral leg was used as a control. After 16 weeks, we evaluated the nerve regeneration with horseradish peroxidase (HRP) tracing, histological method and microdissective technique, and the counts of myelinated axons both of the regenerated nerve and of the control were also evaluated. Results The guide tubes successfully enabled the sciatic nerve regeneration across a 10mm gap. HRP labelling for motor neurons in the anterior horn of the spinal cord was positive. A large number of regenerated myelinated axons in the nerve guide could be seen. Remains of chitosan were still present after 16 weeks implantation, but there was no foreign body or inflammatory reaction at this stage. Conclusion Chitosan guide can provide ideal conditions for regeneration and maturation of damaged nerves.
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【Key words】 Chitosan Peripheral nerve damage Nerve regeneration
利用可吸收性生物材料制成的神经导管来修复周围神经缺损,在近十余年中已受到人们的高度重视。笔者曾用几丁质神经导管对4例周围神经缺损患者进行治疗,其中神经缺损最长者达4.5cm。术后6个月,3例患者感觉、运动及肌电检查提示神经功能基本恢复正常,另1例感觉恢复[1]。几丁糖(chitosan)是从几丁质(chitin)脱乙酰基而衍化来的一种高分子化合物,在体内具有良好的生物相容性和可吸收性。笔者将医用几丁糖制成神经导管,修复大鼠坐骨神经缺损1.0cm,对其效果进行初步的探讨。姫ぁ迹拢裕薄材料与方法
一、神经导管的制备
用2%水溶性几丁糖(上海其胜生物材料技术研究所提供)无菌条件下置于特殊模具中制成长1.2cm、内径1.2～1.6mm、壁厚200μm的导管。导管置于75%酒精中、室温下保存,用前24小时等渗盐水漂洗脱去酒精。
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二、手术方法
雄性Wistar大鼠12只(中国科学院上海动物中心提供),体重200～250g。按每百克体重10mg胺酮作腹腔麻醉,俯卧位固定,右侧股后部斜切口,分开臀肌间隙,暴露坐骨神经。切除坐骨神经6mm,自然回缩后置入1.2cm长的神经导管,10倍显微镜下将两端神经置入导管各1mm,使神经实际缺损为1.0cm,11-0尼龙线将神经外膜与管壁各固定1针。左侧坐骨神经为正常对照组。术后16周处死动物,观察神经再生情况。
三、检查项目
1.大体观察:术后定期观察足趾溃疡发生及愈合时间,展趾恢复时间及程度,神经导管在体内的吸收情况。
2.组织学检查:切取右侧坐骨神经远、中、近各段,左侧坐骨神经中段,部分以 10%甲醛固定,HE染色,观察神经生长情况。另一部分用2%戊二醛固定,1%锇酸二次固定,环氧树脂包埋,半薄切片(0.5～1μm),甲苯胺蓝染色,观察再生的有髓神经纤维。超薄切片,醋酸双氧铀柠檬铅染色,高压透射电镜观察再生神经纤维的超微结构。
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3.辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪检查:术后16周,取4只动物于右侧坐骨神经远侧端,用微量注射器刺入神经束内缓缓注入30%HRP(过氧化物酶纯度值>3.0, Sigma)2μl,注射部位用镊子轻轻挫伤,使其易于摄取HRP。观察72小时,在深麻醉下开胸,用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)150ml、1%多聚甲醛和2%戊二醛250ml、10%蔗糖150ml经心脏灌注。取脊髓腰膨大段固定于相同溶剂中3～4小时,作横断面25μm连续冰冻切片,封片后在显微镜下观察脊髓前角中HRP标记阳性的运动神经元。
4.图像分析:用电脑图像分析处理系统测定神经远、中、近各段有髓神经纤维的数目、直径、轴束/神经纤维比值(G比)。每个视野测定100～400根神经纤维。
5.统计学处理:数据间用配对t检验。
结 果
一、大体观察
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术后2周起,手术侧足趾均出现红肿(12/12),其中8只出现溃疡(8/12),4只动物足趾部分坏死脱落骨外露(4/12)。6周时溃疡开始干燥,部分愈合,10周时全部愈合。足趾感觉运动功能术后即刻丧失,12周时有主动抓笼动作出现,针刺足底有较迟钝的展爪动作,16周时抓笼有力,针刺反应灵敏,提示足趾的感觉运动已恢复。几丁糖导管明显变薄,但外观仍较完整,表面有一层富含血管的结缔组织薄膜包裹,两端无明显粘连与缩窄(附图)。神经导管与周围组织易于分离,远、近断神经干与周围组织粘连明显(手术时分离所致)。用镊子轻拉神经近段可使整个神经在张力下移动,无断裂。剥开几丁糖导管,见再生神经已将远、近端神经连接。中段神经较细小,神经连接处未见明显瘢痕形成。
1.低倍镜下见再生神经位于神经导管中央,导管变得松散,分层的导管之间也有再生的神经纤维。纵切面见再生神经纤维排列整齐通过神经导管。高倍镜下
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附图 术后16周,几丁糖导管变薄,表面有一层薄膜(↑),神经已连接 ×10
见再生神经纤维密集,形态正常,周边神经密度与中央神经密度相同,未见瘢痕。沿材料界面有少数巨噬细胞。与正常神经相比,再生的有髓神经明显细小。
2.透射电镜观察,再生的有髓神经和无髓神经排列整齐,髓鞘结构正常。雪旺氏细胞较多,细胞完整,胞浆丰富。数量不等的神经纤维由成纤维细胞包绕成束,胶原纤维增生。几丁糖内的细胞为单核巨细胞,胞体内有大量异物颗粒,可能为吞噬的几丁糖颗粒。未发现有浆细胞及淋巴细胞。
三、HRP标记结果
在脊髓腰膨大灰质前角中,发现HRP标记成黄褐色的运动神经元。高倍镜下数量不等,每个视野1～5个。
四、图像分析
, 百拇医药
再生神经各段的有髓神经纤维数量明显多于正常神经,但直径小于正常神经,两者之间相差非常显著(P<0.001)。轴索/G比两者间无差异(P>0.05)。
讨 论
近年来的研究提示,短距离的神经缺损应用生物性导管修复后,其疗效与自体神经移植无明显差异[2]。生物材料通常分为两大类,即非吸收性和可吸收性生物材料。前者由于术后长期存留于体内可造成神经受压而需再次手术取出[3],因此难以为人们所接收。可吸收性神经导管多选用组织相容性极佳的生物材料制成,在体内无异物及炎症反应,随着神经再生的完成而逐渐消失,如聚乳糖(polyglactin)[4]、聚羟基乙酸(PGA)[5]等。笔者所选用的几丁糖是几丁质脱去N-乙酰基的衍生物,分子量在70万左右,化学名为氨基葡萄糖多聚体。其生物学特性与几丁质类似,但比几丁质更具柔韧性,经动物实验证实体内组织相容性好,可吸收[6]。笔者制成的几丁糖神经导管为半透明状,在75%酒精中可长期保存,并保持良好的柔韧性,当用等渗盐水漂洗后脆性增大。从实验中发现,该导管吸收较缓慢,200μm厚的导管在体内16周时仍较完整。这既保证了再生神经的顺利生长,也能防止瘢痕的侵入。Brunelli等[7]认为,理想的神经导管应具备:(1)具有良好的生物相容性和可降解性,能与周围组织融为一体并支持神经再生及成熟;(2)具有足够的长度和直径;(3)导管全长有神经再生所需的物质;(4)可防止瘢痕侵入。几丁糖神经导管与这些条件相近。目前存在的缺点是该材料脆性仍较高,当管壁较薄时易碎裂塌陷。理想的管壁厚度应是在神经再生成熟后即消失,过早消失会导致外周纤维组织侵入,使细小的神经受压迫。管壁过厚会使材料滞留体内,可能会产生局部压迫作用。如何提高几丁糖管壁的强度及韧性,有待进一步研究。
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从再生神经形态学中观察到,再生的神经纤维远较正常神经纤维多,这是由于近端轴索侧支形成的结果。较多数量的神经纤维为长入远侧神经端提供了更多的机会。在神经再生16周时,G比与正常神经相似,提示神经已成熟。但神经直径却与正常的相差较大,这种差距即使在更长时间的观察中也是无法消失的[8]。这很可能是神经修复后功能始终无法崐恢复到正常的原因之一。
参 考 文 献
1 苟三怀,侯春林,王东荣,等.几丁质桥接周围神经的实验研究及临床应用.中华骨科杂志, 1996, 16∶148-151.
2 Mackinnon SE, Dellon AL. Clinical nerve reconstruction with a biodegradable polyglycolic acid tube. Plast Reconstr Surg, 1990, 85∶419-424.
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3 Lundborg G, Dahlin LB, Danielsen N. Ulnar nerve repair by the silicone chamber technique-case report. Scand J Plast Reconstr Hand Surgery, 1991, 25∶79-82.
4 Molander H, Olsson Y, Engkvist O, et al. Regeneration of peripheral nerve through a polyglactin tube. Muscle and Nerve, 1982, 5∶54-57.
5 Dellon AL, Mackinnon SE. An alternative to the classical nerve graft for the management of the short nerve gap. Plast Reconstr Surg, 1988, 82∶849-856.
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6 李由,周韵秋,侯春林,等.几丁糖眼内应用的实验研究.第二军医大学学报, 1997, 18∶444-450.
7 Brunelli GA, Vigasio A, Brunelli GR. Different conduits in peripheral nerve surgery. Microsurgery, 1994, 15∶176-178.
8 den Dunnen WFA, van der ler B, Schakenraad JM, et al. Long-term evaluation of nerve regeneration in biodegradable nerve guide. Microsurgery, 1993, 14∶508-510.
本课题受国家自然科学基金资助(No. 39470216)
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