免疫吸附抗介质治疗内毒素休克的实验研究
作者：龙海波 张训 侯凡凡姫
单位：510515 广州,第一军医大学附属南方医院肾内科龙海波(现在第一军医大学珠江医院肾内科)、张训、侯凡凡
关键词：内毒素；休克；肿瘤坏死因子；免疫吸附
中华创伤杂志/980211.htm 【摘要】 目的 观察应用免疫吸附的方法特异性清除循环肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对内毒素休克的影响。方法 利用新西兰白兔内毒素休克模型,研究经抗TNF-α单克隆抗体亲和免疫吸附柱血液灌流对平均动脉压、血浆TNF-α活性、肝肾功能及存活率的影响。结果 免疫吸附治疗后,血浆TNF-α水平迅速下降,低血压状态明显改善,延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生,实验动物存活率明显提高。结论 免疫吸附特异性清除循环TNF-α可能是一条治疗内毒素休克的新的有效途径。
To Deal with Endotoxin Shock with Immunoabsorptive Antiamboceptor in Lab LONG Hai-bo, ZHANG Xun, HOU Fan-fan. Dept. of Nephrology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
, http://www.100md.com
【Abstract】 Aim To evaluate the therapeutic effect of specific removal of circulating tumor necrosis factor-α (TNF-α) by immunoabsorption in endotoxin shock. Methods Some New Zealand white rabbits were injected intravenously with Lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli O111:B4 8.0×109 cfu/kg.B.W) and underwent hemoperfusion through the immunoabsorbent colums against TNF-α at 1 hour after being injected with LPS. The mean arterial pressure (MAP), plasma levels of TNF-α, serum levels of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), alpha-hydrobulyric dehydrogenase (HBDH) and alkaline phosphatase (AKP), as well as blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) were detected. The survival rate of rabbits at 24 hours was observed, too. Results Immunoabsorption could remove the circulating TNF-α rapidly and effectively, raise MAP significantly, ameliorate the LPS-induced renal dysfunction, and delay and attenuate the injury of liver, myocardium, cellular membranes and lysosomes in endotoxin shock. Moreover, the survival rate of rabbits at 24 hours increased, too. Conclusion Specific removal of circulating TNF-α by immunoabsorption may be a new and effective therapy for endotoxin shock.
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【Key words】 Endotoxin Shock Tumor necrosis factor Immunoabsorption
尽管内毒素休克的治疗方法很多,但其病死率仍然高达50%～70%[1]。研究表明,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是内毒素休克时机体内最先出现的、起关键作用的介质,但目前国内外有关拮抗TNF-α以减轻内毒素休克病理损害的研究在临床上往往并不适用。本研究旨在观察应用免疫吸附的方法特异性清除循环TNF-α对内毒素休克的影响,为通过免疫吸附进行抗介质治疗内毒素休克提供理论依据,并探讨其临床应用的可能性。
材料与方法
一、抗TNF-α单克隆抗体亲和免疫吸附剂的制备[2]
生物凝胶A 5M(美国Bio-Rad公司)经交联、脱硫后筛选直径250～300μm的珠粒,崐以溴化氰活化后偶联抗TNF-α单克隆抗体(第四军医大学免疫学教研室惠赠),未结合位点以甘氨酸溶液封闭。制成的免疫吸附剂抗体含量为1.56mg/ml,抗体偶联率为72.5%。
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二、微型血液灌流器的制作
将免疫吸附剂或未偶联抗体的生物凝胶A湿珠粒装填入内径1cm,长8.5cm的柱形玻璃容器内,容量为6.5ml,分别制成免疫吸附柱和空灌流柱。
三、内毒素休克动物模型建立
新西兰白兔65只,雌雄不限,体重(2.26±0.18)kg,由第一军医大学南方医院动物所提供,3%戊巴比妥钠(30～35mg/kg)经耳缘静脉麻醉后,右颈总动脉、左颈外静脉和股动脉插管,股动脉导管与多道生理记录仪相连接以检测注射内毒素(LPS)后3小时内平均动脉压(MAP)的变化。动物全身肝素化(6.5mg/kg),经颈外静脉一次注入自制大肠杆菌LPS(Escherichia coli O111:B4 8.0×109 cfu/kg),然后随机分为三组:(1)对照组(兔数=25):仅观察血压和抽取血样,无其他处理;(2)空灌流组(免数=25):经空灌流柱进行血液灌流2小时;(3)免疫吸附组(兔数=15):经免疫吸附柱进行血液灌流2小时。
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四、血液灌流方式
于注射LPS后1小时开始,血液自右颈总动脉引出,流经P-1蠕动泵(Pharmacia-LKB产品)和微型血液灌流器,从左颈外静脉回输体内,血流量为5ml/min,持续进行2小时,灌流过程中每30分钟追加肝素0.5～1.0mg抗凝。抽取血样后均补入等量的等渗盐水或肝素盐水。灌流结束后,用等渗盐水缓慢回血,结扎血管,缝合包扎伤口。
五、指标检测
1.血浆TNF-α活性测定:于注射LPS前,注射LPS后1、2、3、6、12、24小时留取血标本(每组各时相标本数均为8),采用L929细胞毒法测定[3]。
2.肝肾功能及血清酶测定:于注射LPS前、注射LPS后6、24小时留取血标本(每组各时相标本数均为8),利用康宁550全自动生化分析仪(美国CIBA—CORNING公司)检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)及AKP的变化。
, 百拇医药
六、统计学分析
数据以均数±标准差(
±s)表示。完全随机设计的多个样本均数比较采用方差分析,其两两比较采用Q检验。同组内不同时间比较采用t检验。率的比较采用χ2检验。P<0.05为显著性差异的标准。
结 果
一、血浆TNF-α活性变化
对照组与空灌流组于注射LPS后2小时达峰值,呈陡直的单峰曲线,二组间比较无显著性差异。免疫吸附组注射LPS后2、3、6小时TNF-α活性明显低于其他两组(表1)。
二、MAP变化
注射LPS后,对照组与空灌流组呈双相下降,两组间比较无显著性差异。自免疫吸崐附治疗后0.5小时开始,MAP比治疗前明显升高,治疗2小时观察结束时明显高于其他两组(表2)。
, 百拇医药
三、血清学指标
注射LPS后,对照组和空灌流组6小时ALT、AST、BUN、Cr、LDH和HBDH均明显升高;24小时升高更明显,且与6小时比较差异显著;24小时AKP亦明显升高;二组间同一时间比较均无显著性差异。免疫吸附组6小时上述指标与注射LPS前比较无显著性差异,明显低于其他两组;24小时BUN、Cr、HBDH及AKP仍与注射LPS前无差异,AST、ALT、LDH虽较注射LPS前增高,但均明显低于其他两组(表3)。
四、动物存活率
对照组与空灌流组之间比较无显著性差异。免疫吸附组注射LPS后12、24小时存活率明显高于其他两组(表4)。
讨 论
内毒素休克的多器官功能衰竭乃机体过份的免疫应答所产生的多种内源性细胞因子所致,其中TNF-α是最早释放且起关键作用的介质,其作用机制包括[1，4，5]:(1)诱导一氧化氮(NO)的合成。(2)诱导内皮素(ET)的合成与释放。(3)诱导氧自由基(OFR)的产生及脂质过氧化作用。(4)介导血小板活化因子
, 百拇医药
表1 注射LPS后血浆TNF-α活性变化(U/ml,±s, 兔数=8) 时间
(小时)
对照组
空灌流组
免疫吸附组
0
2.9±1.6
3.3±1.9
2.0±1.4
1
1184.6±223.7
, 百拇医药
1156.2±176.9
1158.5±203.8
2
1448.6±226.9
1440.8±174.3
43.6±10.4*
3
219.6±26.8
235.2±31.0
49.9±25.2*
6
, 百拇医药
50.7±14.1
39.1±12.3
25.0±9.1*
12
9.4±5.6
14.3±9.7
10.4±8.3
24
27.0±10.6
26.3±9.7
26.4±6.9
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05表2 注射LPS后不同时间MAP变化(kPa,±s,兔数=8) 时间
, 百拇医药
(小时)
对照组
空灌流组
免疫吸附组
0
13.8±1.5
14.7±2.2
14.0±1.4
5
10.9±2.3
10.6±0.3
11.3±1.9
15
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11.6±1.9
11.4±1.1
11.9±2.0
30
9.2±2.7
10.8±0.9
10.4±0.6
60
8.6±2.2
10.6±0.5
10.5±1.6
90
, 百拇医药
9.2±2.0
10.4±0.7
11.6±1.4△
120
8.4±2.4
10.2±0.7
11.6±1.3△
150
8.5±2.4
10.5±1.2
12.0±1.7△
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180
8.8±2.3
10.5±1.3
12.4崐±1.2△*
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05,与注射LPS后1小时比较,△P<0.05表3 注射LPS后不同时间血清学检查结果比较(±s,兔数=8) 组别
时间
(小时)
ALT(IU/L)
AST(IU/L)
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BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
LDH(IU/L)
HBDH(IU/L)
AKP(IU/L)
A
0
18.8±8.7
24.7±9.0
5.5±0.8
66.5±12.1
92.2±19.3
, 百拇医药
97.2±29.5
45.0±15.7
6
34.0±7.7△
53.9±18.7△
8.2±0.9△
84.3±9.8△
221.5±70.5△
211.7±63.1△
24
, 百拇医药
61.9±23.7△▲
131.5±31.1△▲
10.8±1.9△▲
108.2±27.6△▲
723.0±314.6△▲
378.0±179.1△▲
124.7±59.3△
B
0
20.2±9.1
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21.2±8.6
5.2±0.8
70.0±12.3
86.3±25.1
92.0±25.5
40.3±20.9
6
31.6±8.3△
51.9±13.5△
8.4±1.7△
86.1±11.5△
, 百拇医药
197.2±55.1△
183.3±57.3△
24
58.2±10.2△▲
120.7±19.7△▲
11.5±2.2△▲
119.4±23.6△▲
671.4±209.7△▲
305.8±112.6△▲
, 百拇医药
109.4±42.8△
C
0
19.2±9.0
22.9±11.6
5.4±0.9
68.3±17.5
88.8±28.1
95.3±29.6
46.2±15.4
6
22.4±5.2*
, 百拇医药
33.2±6.4*
6.3±0.7*
71.0±9.5*
114.3±43.0*
110.0±46.7*
24
35.8±17.8△*
81.4±36.8△*▲
6.4±1.3*
69.5±12.5*
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216.5±72.7△▲*
113.7±28.6*
56.7±14.8*
注A:对照组;B:空灌流组;C:免疫吸附组。与注射LPS前比较,△P<0.05 同组内24小时与6小时比较,▲P<0.05 与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05表4 动物存活率比较 组别
注射LPS后6小时
注射LPS后12小时
注射LPS后24小时
存活数/总数
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存活率(%)
存活数/总数
存活率(%)
存活数/总数
存活率(%)
对照组
22/25
88.0
14/25
56.0
9/25
36.0
空灌流组
, 百拇医药
20/25
80.0
12/25
48.0
8/25
32.0
免疫吸附组
14/15
93.3
12/15
80.0*
11/15
73.3*
, 百拇医药
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05(PAF)、白三烯、前列腺素及血栓素A2(TXA2)等脂类介质的产生。(5)诱导白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8和γ-干扰素(IFN-γ)等多肽介质的产生。(6)激活内皮细胞表面的粘附受体,刺激内皮细胞产生粘附因子。
国内外有关拮抗TNF-α以减轻内毒素休克病理损害的研究大致可分为:(1)阻断TNF-α基因转录。(2)抑制TNF-α mRNA翻译,如肾上腺糖皮质激素[6]。(3)抗TNF-α单克隆抗体(MTA)被动免疫[7]。(4)阻止TNF-α与靶器官TNF-α受体结合,如可溶性TNF-α受体(sTNFR)和TNF-受体-IgG蛋白复合物[6]。(5)作用于调节TNF-α介质的药物,如IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、PAF拮抗剂[6]。(6)抑制TNF-α效应瀑布的后续反应,如环氧化酶抑制剂、NO抑制剂、ET抑制剂[4，5]。然而,目前的抗介质研究尽管方法很多,也能取得一定疗效,但仍然存在许多问题[6～9]:(1)被动免疫必须在细菌感染前或感染后及早期(2.5小时内)应用才具有保护作用;TNF-α基因转录、翻译一旦启动,糖皮质激素等就不能再抑制TNF-α的合成。因而崐其应用受病程限制,在临床上往往并不适用。(2)拮抗TNF-α对内毒素休克防护作用的细胞和分子机制尚不完全清楚。(3)MTA和sTNFR等价格昂贵,而被动免疫需大量用药。(4)输注MTA或sTNFR等可能 导致异种蛋白反应等副作用。
, 百拇医药
此外,有报道用血浆置换或血液灌流清除TNF-α等有害成份治疗内毒素休克取得一定疗效,但常规血液净化对致病介质的清除缺乏特异性,效率不高,且易引起其他并发症[10]。
本实验结果表明,免疫吸附治疗可快速高效地清除循环TNF-α,抑制其高峰的出现。随着循环TNF-α水平的降低,低血压状态明显改善,延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生,从而使实验动物的存活率显著提高。这可能与循环TNF-α被清除后,NO、ET、OFR、TXA2、IL-1、IL-6和IFN-γ等的合成与释放减少,微血管血流灌注得到明显改善有关。
本研究与目前国内外的抗TNF-α方法相比,具有以下优点:(1)毋需输注大量抗体,而且当血液灌流结束后,免疫吸附柱经2mol/L盐酸胍溶液冲洗,循环30分钟可将结合的TNF-α洗脱而复用,因而既大大节省了经济开支,又可避免出现异种蛋白反应等副作用。(2)能在TNF-α水平已明显升高时,对其加以清除,在实际工作中可能为更多的病人赢得治疗机会。(3)体外循环量小,对血流动力学的影响小于血浆置换等。因此,通过免疫吸附进行特异性抗介质(如TNF-α)治疗内毒素休克可能是一条新的有效途径。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Petros A, Lamb G, Leone A, et al. Effects of a nitric oxide synthase inhibitor in humans with septic shock. Cardiovasc Res, 1994, 28∶34-39.
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3 Hay H, Cohen J. Studies on the specificity of the L929 cell bioassay for the measurement of tumor necrosis factor. J Clin Lab Immunol, 1989, 29∶151-155.
, 百拇医药
4 Kam PCA, Govender G. Nitric oxide: Basic science and clinical applications. Anaesthesia, 1994, 49∶515-521.
5 Billau A, Bone RC, Cheadle WG, et al. Cytokines and their interactions with other inflammatory mediators in the pathogensis of sepsis and septic shock. Eur J Clin Invest, 1991, 21∶559-573.
6 Giroir BP, Porath J, Laas T, et al. Mediators of septic shock: New approaches for interrupting the endogenous inflammatory cascade. Crit Care Med, 1993, 21∶780-789.
, 百拇医药
7 Tracey KJ, Fong Y, Hesse DG, et al. Anti-cachetin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature, 1987, 330∶662-664.
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9 Silva AT, Cohen J, Ostlund RE, et al. Prophylactic and therapeutic effects of a monoclonal antibody to TNF-α in experimental gram-negative shock. J Infect Dis, 1990, 162∶421-427.
0 Bellomo R, Tipping P, Boyce N. Tumor necrosis factor clearances during veno-venous hemodiafiltration in the critically Ⅲ. ASAIO Transaction, 1991, 37∶M322-323.
本课题受国家自然科学基金资助
(收稿:1997-07-15 修回:1997-11-05), 百拇医药
单位：510515 广州,第一军医大学附属南方医院肾内科龙海波(现在第一军医大学珠江医院肾内科)、张训、侯凡凡
关键词：内毒素；休克；肿瘤坏死因子；免疫吸附
中华创伤杂志/980211.htm 【摘要】 目的 观察应用免疫吸附的方法特异性清除循环肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对内毒素休克的影响。方法 利用新西兰白兔内毒素休克模型,研究经抗TNF-α单克隆抗体亲和免疫吸附柱血液灌流对平均动脉压、血浆TNF-α活性、肝肾功能及存活率的影响。结果 免疫吸附治疗后,血浆TNF-α水平迅速下降,低血压状态明显改善,延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生,实验动物存活率明显提高。结论 免疫吸附特异性清除循环TNF-α可能是一条治疗内毒素休克的新的有效途径。
To Deal with Endotoxin Shock with Immunoabsorptive Antiamboceptor in Lab LONG Hai-bo, ZHANG Xun, HOU Fan-fan. Dept. of Nephrology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
, http://www.100md.com
【Abstract】 Aim To evaluate the therapeutic effect of specific removal of circulating tumor necrosis factor-α (TNF-α) by immunoabsorption in endotoxin shock. Methods Some New Zealand white rabbits were injected intravenously with Lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli O111:B4 8.0×109 cfu/kg.B.W) and underwent hemoperfusion through the immunoabsorbent colums against TNF-α at 1 hour after being injected with LPS. The mean arterial pressure (MAP), plasma levels of TNF-α, serum levels of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), lactate dehydrogenase (LDH), alpha-hydrobulyric dehydrogenase (HBDH) and alkaline phosphatase (AKP), as well as blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) were detected. The survival rate of rabbits at 24 hours was observed, too. Results Immunoabsorption could remove the circulating TNF-α rapidly and effectively, raise MAP significantly, ameliorate the LPS-induced renal dysfunction, and delay and attenuate the injury of liver, myocardium, cellular membranes and lysosomes in endotoxin shock. Moreover, the survival rate of rabbits at 24 hours increased, too. Conclusion Specific removal of circulating TNF-α by immunoabsorption may be a new and effective therapy for endotoxin shock.
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【Key words】 Endotoxin Shock Tumor necrosis factor Immunoabsorption
尽管内毒素休克的治疗方法很多,但其病死率仍然高达50%～70%[1]。研究表明,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是内毒素休克时机体内最先出现的、起关键作用的介质,但目前国内外有关拮抗TNF-α以减轻内毒素休克病理损害的研究在临床上往往并不适用。本研究旨在观察应用免疫吸附的方法特异性清除循环TNF-α对内毒素休克的影响,为通过免疫吸附进行抗介质治疗内毒素休克提供理论依据,并探讨其临床应用的可能性。
材料与方法
一、抗TNF-α单克隆抗体亲和免疫吸附剂的制备[2]
生物凝胶A 5M(美国Bio-Rad公司)经交联、脱硫后筛选直径250～300μm的珠粒,崐以溴化氰活化后偶联抗TNF-α单克隆抗体(第四军医大学免疫学教研室惠赠),未结合位点以甘氨酸溶液封闭。制成的免疫吸附剂抗体含量为1.56mg/ml,抗体偶联率为72.5%。
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二、微型血液灌流器的制作
将免疫吸附剂或未偶联抗体的生物凝胶A湿珠粒装填入内径1cm,长8.5cm的柱形玻璃容器内,容量为6.5ml,分别制成免疫吸附柱和空灌流柱。
三、内毒素休克动物模型建立
新西兰白兔65只,雌雄不限,体重(2.26±0.18)kg,由第一军医大学南方医院动物所提供,3%戊巴比妥钠(30～35mg/kg)经耳缘静脉麻醉后,右颈总动脉、左颈外静脉和股动脉插管,股动脉导管与多道生理记录仪相连接以检测注射内毒素(LPS)后3小时内平均动脉压(MAP)的变化。动物全身肝素化(6.5mg/kg),经颈外静脉一次注入自制大肠杆菌LPS(Escherichia coli O111:B4 8.0×109 cfu/kg),然后随机分为三组:(1)对照组(兔数=25):仅观察血压和抽取血样,无其他处理;(2)空灌流组(免数=25):经空灌流柱进行血液灌流2小时;(3)免疫吸附组(兔数=15):经免疫吸附柱进行血液灌流2小时。
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四、血液灌流方式
于注射LPS后1小时开始,血液自右颈总动脉引出,流经P-1蠕动泵(Pharmacia-LKB产品)和微型血液灌流器,从左颈外静脉回输体内,血流量为5ml/min,持续进行2小时,灌流过程中每30分钟追加肝素0.5～1.0mg抗凝。抽取血样后均补入等量的等渗盐水或肝素盐水。灌流结束后,用等渗盐水缓慢回血,结扎血管,缝合包扎伤口。
五、指标检测
1.血浆TNF-α活性测定:于注射LPS前,注射LPS后1、2、3、6、12、24小时留取血标本(每组各时相标本数均为8),采用L929细胞毒法测定[3]。
2.肝肾功能及血清酶测定:于注射LPS前、注射LPS后6、24小时留取血标本(每组各时相标本数均为8),利用康宁550全自动生化分析仪(美国CIBA—CORNING公司)检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)及AKP的变化。
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六、统计学分析
数据以均数±标准差(
±s)表示。完全随机设计的多个样本均数比较采用方差分析,其两两比较采用Q检验。同组内不同时间比较采用t检验。率的比较采用χ2检验。P<0.05为显著性差异的标准。结 果
一、血浆TNF-α活性变化
对照组与空灌流组于注射LPS后2小时达峰值,呈陡直的单峰曲线,二组间比较无显著性差异。免疫吸附组注射LPS后2、3、6小时TNF-α活性明显低于其他两组(表1)。
二、MAP变化
注射LPS后,对照组与空灌流组呈双相下降,两组间比较无显著性差异。自免疫吸崐附治疗后0.5小时开始,MAP比治疗前明显升高,治疗2小时观察结束时明显高于其他两组(表2)。
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三、血清学指标
注射LPS后,对照组和空灌流组6小时ALT、AST、BUN、Cr、LDH和HBDH均明显升高;24小时升高更明显,且与6小时比较差异显著;24小时AKP亦明显升高;二组间同一时间比较均无显著性差异。免疫吸附组6小时上述指标与注射LPS前比较无显著性差异,明显低于其他两组;24小时BUN、Cr、HBDH及AKP仍与注射LPS前无差异,AST、ALT、LDH虽较注射LPS前增高,但均明显低于其他两组(表3)。
四、动物存活率
对照组与空灌流组之间比较无显著性差异。免疫吸附组注射LPS后12、24小时存活率明显高于其他两组(表4)。
讨 论
内毒素休克的多器官功能衰竭乃机体过份的免疫应答所产生的多种内源性细胞因子所致,其中TNF-α是最早释放且起关键作用的介质,其作用机制包括[1，4，5]:(1)诱导一氧化氮(NO)的合成。(2)诱导内皮素(ET)的合成与释放。(3)诱导氧自由基(OFR)的产生及脂质过氧化作用。(4)介导血小板活化因子
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表1 注射LPS后血浆TNF-α活性变化(U/ml,
±s, 兔数=8) 时间(小时)
对照组
空灌流组
免疫吸附组
0
2.9±1.6
3.3±1.9
2.0±1.4
1
1184.6±223.7
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1156.2±176.9
1158.5±203.8
2
1448.6±226.9
1440.8±174.3
43.6±10.4*
3
219.6±26.8
235.2±31.0
49.9±25.2*
6
, 百拇医药
50.7±14.1
39.1±12.3
25.0±9.1*
12
9.4±5.6
14.3±9.7
10.4±8.3
24
27.0±10.6
26.3±9.7
26.4±6.9
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05表2 注射LPS后不同时间MAP变化(kPa,
±s,兔数=8) 时间, 百拇医药
(小时)
对照组
空灌流组
免疫吸附组
0
13.8±1.5
14.7±2.2
14.0±1.4
5
10.9±2.3
10.6±0.3
11.3±1.9
15
, http://www.100md.com
11.6±1.9
11.4±1.1
11.9±2.0
30
9.2±2.7
10.8±0.9
10.4±0.6
60
8.6±2.2
10.6±0.5
10.5±1.6
90
, 百拇医药
9.2±2.0
10.4±0.7
11.6±1.4△
120
8.4±2.4
10.2±0.7
11.6±1.3△
150
8.5±2.4
10.5±1.2
12.0±1.7△
, http://www.100md.com
180
8.8±2.3
10.5±1.3
12.4崐±1.2△*
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05,与注射LPS后1小时比较,△P<0.05表3 注射LPS后不同时间血清学检查结果比较(
±s,兔数=8) 组别时间
(小时)
ALT(IU/L)
AST(IU/L)
, http://www.100md.com
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
LDH(IU/L)
HBDH(IU/L)
AKP(IU/L)
A
0
18.8±8.7
24.7±9.0
5.5±0.8
66.5±12.1
92.2±19.3
, 百拇医药
97.2±29.5
45.0±15.7
6
34.0±7.7△
53.9±18.7△
8.2±0.9△
84.3±9.8△
221.5±70.5△
211.7±63.1△
24
, 百拇医药
61.9±23.7△▲
131.5±31.1△▲
10.8±1.9△▲
108.2±27.6△▲
723.0±314.6△▲
378.0±179.1△▲
124.7±59.3△
B
0
20.2±9.1
, http://www.100md.com
21.2±8.6
5.2±0.8
70.0±12.3
86.3±25.1
92.0±25.5
40.3±20.9
6
31.6±8.3△
51.9±13.5△
8.4±1.7△
86.1±11.5△
, 百拇医药
197.2±55.1△
183.3±57.3△
24
58.2±10.2△▲
120.7±19.7△▲
11.5±2.2△▲
119.4±23.6△▲
671.4±209.7△▲
305.8±112.6△▲
, 百拇医药
109.4±42.8△
C
0
19.2±9.0
22.9±11.6
5.4±0.9
68.3±17.5
88.8±28.1
95.3±29.6
46.2±15.4
6
22.4±5.2*
, 百拇医药
33.2±6.4*
6.3±0.7*
71.0±9.5*
114.3±43.0*
110.0±46.7*
24
35.8±17.8△*
81.4±36.8△*▲
6.4±1.3*
69.5±12.5*
, http://www.100md.com
216.5±72.7△▲*
113.7±28.6*
56.7±14.8*
注A:对照组;B:空灌流组;C:免疫吸附组。与注射LPS前比较,△P<0.05 同组内24小时与6小时比较,▲P<0.05 与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05表4 动物存活率比较 组别
注射LPS后6小时
注射LPS后12小时
注射LPS后24小时
存活数/总数
, http://www.100md.com
存活率(%)
存活数/总数
存活率(%)
存活数/总数
存活率(%)
对照组
22/25
88.0
14/25
56.0
9/25
36.0
空灌流组
, 百拇医药
20/25
80.0
12/25
48.0
8/25
32.0
免疫吸附组
14/15
93.3
12/15
80.0*
11/15
73.3*
, 百拇医药
与对照组及空灌流组同一时间比较,*P<0.05(PAF)、白三烯、前列腺素及血栓素A2(TXA2)等脂类介质的产生。(5)诱导白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8和γ-干扰素(IFN-γ)等多肽介质的产生。(6)激活内皮细胞表面的粘附受体,刺激内皮细胞产生粘附因子。
国内外有关拮抗TNF-α以减轻内毒素休克病理损害的研究大致可分为:(1)阻断TNF-α基因转录。(2)抑制TNF-α mRNA翻译,如肾上腺糖皮质激素[6]。(3)抗TNF-α单克隆抗体(MTA)被动免疫[7]。(4)阻止TNF-α与靶器官TNF-α受体结合,如可溶性TNF-α受体(sTNFR)和TNF-受体-IgG蛋白复合物[6]。(5)作用于调节TNF-α介质的药物,如IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、PAF拮抗剂[6]。(6)抑制TNF-α效应瀑布的后续反应,如环氧化酶抑制剂、NO抑制剂、ET抑制剂[4，5]。然而,目前的抗介质研究尽管方法很多,也能取得一定疗效,但仍然存在许多问题[6～9]:(1)被动免疫必须在细菌感染前或感染后及早期(2.5小时内)应用才具有保护作用;TNF-α基因转录、翻译一旦启动,糖皮质激素等就不能再抑制TNF-α的合成。因而崐其应用受病程限制,在临床上往往并不适用。(2)拮抗TNF-α对内毒素休克防护作用的细胞和分子机制尚不完全清楚。(3)MTA和sTNFR等价格昂贵,而被动免疫需大量用药。(4)输注MTA或sTNFR等可能 导致异种蛋白反应等副作用。
, 百拇医药
此外,有报道用血浆置换或血液灌流清除TNF-α等有害成份治疗内毒素休克取得一定疗效,但常规血液净化对致病介质的清除缺乏特异性,效率不高,且易引起其他并发症[10]。
本实验结果表明,免疫吸附治疗可快速高效地清除循环TNF-α,抑制其高峰的出现。随着循环TNF-α水平的降低,低血压状态明显改善,延缓和显著减轻了肝肾功能损害及心肌、细胞膜和溶酶体损伤的发生,从而使实验动物的存活率显著提高。这可能与循环TNF-α被清除后,NO、ET、OFR、TXA2、IL-1、IL-6和IFN-γ等的合成与释放减少,微血管血流灌注得到明显改善有关。
本研究与目前国内外的抗TNF-α方法相比,具有以下优点:(1)毋需输注大量抗体,而且当血液灌流结束后,免疫吸附柱经2mol/L盐酸胍溶液冲洗,循环30分钟可将结合的TNF-α洗脱而复用,因而既大大节省了经济开支,又可避免出现异种蛋白反应等副作用。(2)能在TNF-α水平已明显升高时,对其加以清除,在实际工作中可能为更多的病人赢得治疗机会。(3)体外循环量小,对血流动力学的影响小于血浆置换等。因此,通过免疫吸附进行特异性抗介质(如TNF-α)治疗内毒素休克可能是一条新的有效途径。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Petros A, Lamb G, Leone A, et al. Effects of a nitric oxide synthase inhibitor in humans with septic shock. Cardiovasc Res, 1994, 28∶34-39.
2 Ostlund RE. Immunosorbent chemistry: A study of agarose-based column sorbents for the removal of lowdensity lipoprotein (LDL) from blood. Artif Organs, 1987, 11∶366-374.
3 Hay H, Cohen J. Studies on the specificity of the L929 cell bioassay for the measurement of tumor necrosis factor. J Clin Lab Immunol, 1989, 29∶151-155.
, 百拇医药
4 Kam PCA, Govender G. Nitric oxide: Basic science and clinical applications. Anaesthesia, 1994, 49∶515-521.
5 Billau A, Bone RC, Cheadle WG, et al. Cytokines and their interactions with other inflammatory mediators in the pathogensis of sepsis and septic shock. Eur J Clin Invest, 1991, 21∶559-573.
6 Giroir BP, Porath J, Laas T, et al. Mediators of septic shock: New approaches for interrupting the endogenous inflammatory cascade. Crit Care Med, 1993, 21∶780-789.
, 百拇医药
7 Tracey KJ, Fong Y, Hesse DG, et al. Anti-cachetin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature, 1987, 330∶662-664.
8 Abraham E, Wunderink R, Silverman H, et al. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor-α in patients with sepsis syndrome, a randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. JAMA, 1995, 273∶934-941.
9 Silva AT, Cohen J, Ostlund RE, et al. Prophylactic and therapeutic effects of a monoclonal antibody to TNF-α in experimental gram-negative shock. J Infect Dis, 1990, 162∶421-427.
0 Bellomo R, Tipping P, Boyce N. Tumor necrosis factor clearances during veno-venous hemodiafiltration in the critically Ⅲ. ASAIO Transaction, 1991, 37∶M322-323.
本课题受国家自然科学基金资助
(收稿:1997-07-15 修回:1997-11-05), 百拇医药