非放射性DNA探针检测金黄色葡萄球菌耐甲氧西林基因
作者：莫岚 王其南
单位：430042 重庆医科大学附属第一医院
关键词：
中华传染病杂980220 用常规的药敏试验检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(金葡菌，MRSA)，耗时较长，且结果不够准确。由于只有MRSA才含有mecA基因，而甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)中并没有等位的mecA基因，采用DNA探针可能与MRSA的染色体DNA进行杂交，特异性强，且不受生长条件等因素的影响，尤其是对难以确定的临界耐药株(MIC=0.5～8mg/L)，用核酸杂交法可获得较客观的结果。我们利用合成的寡核苷酸，标记物为Bio-11-dUTP，检测固定于硝酸纤维滤膜(NC)上的DNA，对60株金葡菌(40株MRSA，20株MSSA)进行了Southern blot分析，现将结果报道如下。
材料与方法
, 百拇医药
一、主要试剂
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TDT)购自Promega公司；聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖400型、牛血清白蛋白(组分V)均购自Sigma公司；鲑精DNA(salmon sperm DNA SSD)购自Sigma公司；链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶结合物(streptavidin-alkaline phosphatase conjugate, SA-AP)，BRL公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)、硝基蓝四氮唑(NBT)、去离子甲酰胺(forma-mide)均购自华美生物工程公司；硝酸纤维素滤膜(NC)购自德国柏林格尔曼海姆有限公司。
二、方法
(一) 寡核苷酸的标记 核苷酸序列：5′1581ATCTGTACTGGGTTA-
, 百拇医药
ATC15983′，寡核苷酸的标记参照试剂盒说明书操作。用Sephadex G-50柱分离纯化标记的探针。
(二) Southern杂交 参照文献[1]将DNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维滤膜上——毛细管转移，按常规方法进行杂交。
(三) 生物素寡核苷酸探针的斑点杂交(dot blot) 将提取的DNA或PCR产物直接点在经过处理的NC膜上，经NaOH变性后与生物素标记的探针杂交，方法同(二)。
(四) 生物素寡核苷酸探针杂交灵敏度测定 将PCR产物定量后，稀释成不同浓度，然后点在NC膜上，进行预杂交、杂交、洗膜处理，最后显色，以确定杂交的最小DNA量。
(五) 探针标记物的检测 采用生物素-链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶显色体系检测参照试剂盒说明书操作。
, 百拇医药
结 果
一、生物素标记的探针与固定于NC膜上的DNA杂交结果
检测金葡菌mecA基因PCR结果见附图，Southern blot菌检mecA基因结果，可见杂交后经显色MRSA出现杂交带，而MSSA及标准株未见条带，Southern blot结果与PCR结果完全一致，证实其533bp片段为MRSA mecA基因特异性产物。
二、Southern blot、PCR与药敏法检测结果比较
60株金葡菌用药敏法检出40株MRSA，用PCR及Southern blot均检出mecA基因。其MIC2株为2mg/L,1株为1mg/L，说明用药敏法检出MRSA结果有时不够准确。
三、生物素探针斑点杂交
, 百拇医药
MRSA经dot blot显示出蓝色圆点，而MSSA及金葡菌标准株未见显色。
四、生物素探针杂交敏感度测定
生物素寡核苷酸探针可检出4ng目的DNA量。
a. 标准分子量(PCR Marker, 1543,994,695,515,377,237bp)
b～f. 耐甲氧西林金葡菌
g. 甲氧西林敏感金葡菌
h. 金葡菌标准株ATCC25923
附图 耐甲氧西林金葡菌mecA基因PCR扩增结果
讨 论
, 百拇医药
MRSA对β-内酰胺抗生素耐药主要是由于mecA基因编码低亲合力的PBP 2a产生而导致耐药，其他一些因素如β-内酰胺酶的过量产生，femA、femB基因的存在加重了MRSA的耐药程度[2]。DNA杂交法(Southern blot)克服了药敏法检测MRSA的缺点，通过PCR方法对MRSA特有的mecA基因进行扩增，采用毛细管转移将DNA从琼脂糖凝胶中转移至NC膜上，酶促生物素标记寡核苷酸作为探针，与固定于NC膜上的DNA杂交，最后用生物素-链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶显色体系显色，以及用斑点杂交等证实533bp DNA片段为MRSA mecA基因特异性产物，40株MRSA，PCR结果及Southern blot结果均阳性，20株MSSA中，3株PCR及Southern blot检出mecA基因。生物素寡核苷酸探针斑点杂交敏感度为4ng DNA量。由此可见，用特异性DNA探针与mecA基因进行核酸杂交，是鉴定MRSA比较可靠的方法，具有以下优点：1 特异性强；2 敏感性较高；3 耗时较短(与药敏法比较)且结果客观，尤其是传统方法难以确定的临界株(MCI为0.5～8mg/L)，采用核酸杂交法可以获得客观结果，为临床医师合理选用抗生素治疗葡萄球菌感染提供了依据。
参考文献
1 Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y 1989.
2 Franciolli M, Bille J, Glauser MP, et al. Beta-lactam resistance mechanisms of methicillin-resistant S. aureus. J Infect Dis, 1991, 163:514-532., 百拇医药
单位：430042 重庆医科大学附属第一医院
关键词：
中华传染病杂980220 用常规的药敏试验检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(金葡菌，MRSA)，耗时较长，且结果不够准确。由于只有MRSA才含有mecA基因，而甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)中并没有等位的mecA基因，采用DNA探针可能与MRSA的染色体DNA进行杂交，特异性强，且不受生长条件等因素的影响，尤其是对难以确定的临界耐药株(MIC=0.5～8mg/L)，用核酸杂交法可获得较客观的结果。我们利用合成的寡核苷酸，标记物为Bio-11-dUTP，检测固定于硝酸纤维滤膜(NC)上的DNA，对60株金葡菌(40株MRSA，20株MSSA)进行了Southern blot分析，现将结果报道如下。
材料与方法
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一、主要试剂
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TDT)购自Promega公司；聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖400型、牛血清白蛋白(组分V)均购自Sigma公司；鲑精DNA(salmon sperm DNA SSD)购自Sigma公司；链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶结合物(streptavidin-alkaline phosphatase conjugate, SA-AP)，BRL公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)、硝基蓝四氮唑(NBT)、去离子甲酰胺(forma-mide)均购自华美生物工程公司；硝酸纤维素滤膜(NC)购自德国柏林格尔曼海姆有限公司。
二、方法
(一) 寡核苷酸的标记 核苷酸序列：5′1581ATCTGTACTGGGTTA-
, 百拇医药
ATC15983′，寡核苷酸的标记参照试剂盒说明书操作。用Sephadex G-50柱分离纯化标记的探针。
(二) Southern杂交 参照文献[1]将DNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维滤膜上——毛细管转移，按常规方法进行杂交。
(三) 生物素寡核苷酸探针的斑点杂交(dot blot) 将提取的DNA或PCR产物直接点在经过处理的NC膜上，经NaOH变性后与生物素标记的探针杂交，方法同(二)。
(四) 生物素寡核苷酸探针杂交灵敏度测定 将PCR产物定量后，稀释成不同浓度，然后点在NC膜上，进行预杂交、杂交、洗膜处理，最后显色，以确定杂交的最小DNA量。
(五) 探针标记物的检测 采用生物素-链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶显色体系检测参照试剂盒说明书操作。
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结 果
一、生物素标记的探针与固定于NC膜上的DNA杂交结果
检测金葡菌mecA基因PCR结果见附图，Southern blot菌检mecA基因结果，可见杂交后经显色MRSA出现杂交带，而MSSA及标准株未见条带，Southern blot结果与PCR结果完全一致，证实其533bp片段为MRSA mecA基因特异性产物。
二、Southern blot、PCR与药敏法检测结果比较
60株金葡菌用药敏法检出40株MRSA，用PCR及Southern blot均检出mecA基因。其MIC2株为2mg/L,1株为1mg/L，说明用药敏法检出MRSA结果有时不够准确。
三、生物素探针斑点杂交
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MRSA经dot blot显示出蓝色圆点，而MSSA及金葡菌标准株未见显色。
四、生物素探针杂交敏感度测定
生物素寡核苷酸探针可检出4ng目的DNA量。
a. 标准分子量(PCR Marker, 1543,994,695,515,377,237bp)b～f. 耐甲氧西林金葡菌
g. 甲氧西林敏感金葡菌
h. 金葡菌标准株ATCC25923
附图 耐甲氧西林金葡菌mecA基因PCR扩增结果
讨 论
, 百拇医药
MRSA对β-内酰胺抗生素耐药主要是由于mecA基因编码低亲合力的PBP 2a产生而导致耐药，其他一些因素如β-内酰胺酶的过量产生，femA、femB基因的存在加重了MRSA的耐药程度[2]。DNA杂交法(Southern blot)克服了药敏法检测MRSA的缺点，通过PCR方法对MRSA特有的mecA基因进行扩增，采用毛细管转移将DNA从琼脂糖凝胶中转移至NC膜上，酶促生物素标记寡核苷酸作为探针，与固定于NC膜上的DNA杂交，最后用生物素-链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶显色体系显色，以及用斑点杂交等证实533bp DNA片段为MRSA mecA基因特异性产物，40株MRSA，PCR结果及Southern blot结果均阳性，20株MSSA中，3株PCR及Southern blot检出mecA基因。生物素寡核苷酸探针斑点杂交敏感度为4ng DNA量。由此可见，用特异性DNA探针与mecA基因进行核酸杂交，是鉴定MRSA比较可靠的方法，具有以下优点：1 特异性强；2 敏感性较高；3 耗时较短(与药敏法比较)且结果客观，尤其是传统方法难以确定的临界株(MCI为0.5～8mg/L)，采用核酸杂交法可以获得客观结果，为临床医师合理选用抗生素治疗葡萄球菌感染提供了依据。
参考文献
1 Sambrook J, Fristsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y 1989.
2 Franciolli M, Bille J, Glauser MP, et al. Beta-lactam resistance mechanisms of methicillin-resistant S. aureus. J Infect Dis, 1991, 163:514-532., 百拇医药