肾综合征出血热患者汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的初步研究
作者：陈龙邦 王彦宏
单位：210002 南京军区南京总医院(陈龙邦)；第四军医大学西京医院(王彦宏)
关键词：
中华传染病杂980217 肾综合征出血热(HFRS)患者病程中存在着错综复杂的免疫调节功能异常[1～4]。为了进一步探讨汉坦病毒感染过程中机体免疫调节功能失衡的机制，我们进行了从HFRS患者外周血建立病毒抗原特异性T细胞克隆的初步工作。
材料和方法
一、病毒抗原
以汉坦病毒L99株感染Vero E6细胞，待感染细胞免疫荧光达“++++”时冻融，收集培养上清，经56℃30分钟灭活。正常Vero E6细胞培养上清同法处理作为对照。
, 百拇医药
二、淋巴细胞
选择5例不同病期(发热期1例、少尿期1例、多尿期2例、恢复期1例)的HFRS住院患者，无菌采静脉抗凝血，常规分离淋巴细胞。
三、实验方法
(一) 抗原增殖试验 将自HFRS患者外周血分离的单个核细胞(PBM)用RPMI-1640培养液(含15%灭活人AB血清)调整为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔0.2ml，并加入不同浓度的汉坦病毒抗原，37℃、5% CO2下培养6天。培养结束前12小时，每孔加入3H-TdR 1 μCi。收集细胞测3H-TdR掺入量，按下式计算刺激指数(SI)：
SI=抗原刺激细胞3H-TdR掺入cpm值/对照抗原细胞3H-TdR掺入cpm值。
, 百拇医药
(二) PBM的活化与T细胞克隆 从1例对L99株抗原增殖反应阳性的HFRS患者(多尿期)采血50ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBM，用含10%灭活人AB血清和终浓度1∶30的L99株抗原的RPMI-1640调至2×106/ml，加入96孔圆底板(每孔0.2ml)，37℃、5% CO2条件下培养7天。在第7天时，用密度梯度离心分离母细胞，用有限稀释法进行克隆。每孔种入1个细胞/0.2ml，培养液含终浓度1∶30 L99株抗原及重组人IL-2(Gibco产品)200IU/ml经105及3000 rad照射的自身PBM，置37℃、5% CO2下培养，每3天补充L99株抗原及IL-2，至14日可见克隆生长，再过7天后，将有克隆生长的培养孔细胞转移至48孔培养板，加入饲养细胞、抗原及IL-2进行扩展。
(三) 汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的筛选 克隆细胞以1×104/孔，加入2×105经射线照射的自身PBM、1∶30的L99株抗原或破伤风毒素(T.T，Gibco产品)20μg/ml，37℃、5%CO2下培养3天，培养结束前8小时，每孔加入1 μCi3H-TdR，收集细胞测cpm值，计算SI。
, 百拇医药
(四) T克隆株表面标志的鉴定 采用间接免疫荧光法[1]。
结 果
一、HFRS患者PBM对汉坦病毒抗原的增殖反应
我们测定了5例HFRS患者外周血PBM对汉坦病毒L99株抗原的增殖反应，结果见表1。可见SI与血清特异性抗体滴度无明显关系。
表1 HFRS患者PBM对汉坦病
毒抗原的增殖反应 例号
病期
抗-HFRS-IgG滴度
SI
, 百拇医药
例1
多尿期
1∶2048
9.9
例2
发热期
1∶80
2.1
例3
少尿期
1∶1024
1.8
例4
, 百拇医药
多尿期
1∶5120
2.6
例5
恢复期
1∶5120
3.1
选择SI较高的例1 PBM进行活化与克隆，其淋巴细胞SI从活化前的9.9增加到26.8，CD4/CD8比值从0.8增至1.2。
二、T克隆株对多种抗原的反应
从近400孔稀释孔中得到24株T细胞克隆，其中4株以汉坦病毒抗原特异的方式增殖，见表2。
, 百拇医药
三、T克隆细胞株的表型
4株汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的细胞表面标志为CD3+、CD4-、CD8+。表2 T克隆细胞株对多种抗原的增殖反应(cpm,
±s)
克隆煮
L99株抗原
Vero E6对照
T.T
1640对照
B2
, 百拇医药
3334±109
88±10
145±22
102±27
F6
4341±216
161±28
213±16
254±66
H1
1949±62
208±14
, 百拇医药
195±20
187±27
K5
2362±150
97±9
186±36
137±45
讨 论
T细胞克隆技术是研究T细胞免疫调节网络功能的重要手段[5]。国内外学者已成功建立了登革热、分枝杆菌、乙型肝炎等特异性T细胞克隆。汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的研究，将有助于阐明T细胞不同组份在HFRS发病机制及免疫保护中的作用。目前这一方面的研究国内外尚鲜见报道。
, 百拇医药
我们采用有限稀释法，以自身PBM为饲养细胞，从HFRS患者外周血建立了四株汉坦病毒L99株抗原特异性T细胞克隆。但我们在实验中发现，克隆产率及特异性克隆的阳性率均较低，且T克隆株在体外的长期维持非常困难，其原因有待进一步探讨。
我们建立的汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的细胞表型为CD3+、CD4-及CD8+，说明其具有CD8+细胞的表型特征。但CD8+细胞包含杀伤性T细胞(TC)及抑制性T细胞(TS)，由于TC对靶细胞的杀伤受到MHC的限制，因此要进一步研究克隆细胞株的杀伤作用，有赖于建立适宜的、与克隆细胞株来源相一致的汉坦病毒感染靶细胞。
本课题为国家自然科学基金资助项目(3910011)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Chen LB,Yang WS.Abnormalities of T cell immunoregulation in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome J Infect Dis,1990,161:1016-1019.
2 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热患者自发性抑制性T细胞功能的检测及其临床意义.中华传染病杂志，1989，7：205-208.
3 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热患者外周血单核细胞产生IL-1和PGE2的水平及其与IL-2的关系.中国免疫学杂志，1990，6：235-237.
4 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热干扰素系统的研究.中华传染病杂志，1991，9：38-40.
5 Kurane I,Meager A,Ennis FA.
Dengue virus-specific human T cell clones.Serotype crossactive proliferation,interferon gamma production and cytotoxic activity.J Exp Med,1989,170:763-775., 百拇医药
单位：210002 南京军区南京总医院(陈龙邦)；第四军医大学西京医院(王彦宏)
关键词：
中华传染病杂980217 肾综合征出血热(HFRS)患者病程中存在着错综复杂的免疫调节功能异常[1～4]。为了进一步探讨汉坦病毒感染过程中机体免疫调节功能失衡的机制，我们进行了从HFRS患者外周血建立病毒抗原特异性T细胞克隆的初步工作。
材料和方法
一、病毒抗原
以汉坦病毒L99株感染Vero E6细胞，待感染细胞免疫荧光达“++++”时冻融，收集培养上清，经56℃30分钟灭活。正常Vero E6细胞培养上清同法处理作为对照。
, 百拇医药
二、淋巴细胞
选择5例不同病期(发热期1例、少尿期1例、多尿期2例、恢复期1例)的HFRS住院患者，无菌采静脉抗凝血，常规分离淋巴细胞。
三、实验方法
(一) 抗原增殖试验 将自HFRS患者外周血分离的单个核细胞(PBM)用RPMI-1640培养液(含15%灭活人AB血清)调整为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔0.2ml，并加入不同浓度的汉坦病毒抗原，37℃、5% CO2下培养6天。培养结束前12小时，每孔加入3H-TdR 1 μCi。收集细胞测3H-TdR掺入量，按下式计算刺激指数(SI)：
SI=抗原刺激细胞3H-TdR掺入cpm值/对照抗原细胞3H-TdR掺入cpm值。
, 百拇医药
(二) PBM的活化与T细胞克隆 从1例对L99株抗原增殖反应阳性的HFRS患者(多尿期)采血50ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBM，用含10%灭活人AB血清和终浓度1∶30的L99株抗原的RPMI-1640调至2×106/ml，加入96孔圆底板(每孔0.2ml)，37℃、5% CO2条件下培养7天。在第7天时，用密度梯度离心分离母细胞，用有限稀释法进行克隆。每孔种入1个细胞/0.2ml，培养液含终浓度1∶30 L99株抗原及重组人IL-2(Gibco产品)200IU/ml经105及3000 rad照射的自身PBM，置37℃、5% CO2下培养，每3天补充L99株抗原及IL-2，至14日可见克隆生长，再过7天后，将有克隆生长的培养孔细胞转移至48孔培养板，加入饲养细胞、抗原及IL-2进行扩展。
(三) 汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的筛选 克隆细胞以1×104/孔，加入2×105经射线照射的自身PBM、1∶30的L99株抗原或破伤风毒素(T.T，Gibco产品)20μg/ml，37℃、5%CO2下培养3天，培养结束前8小时，每孔加入1 μCi3H-TdR，收集细胞测cpm值，计算SI。
, 百拇医药
(四) T克隆株表面标志的鉴定 采用间接免疫荧光法[1]。
结 果
一、HFRS患者PBM对汉坦病毒抗原的增殖反应
我们测定了5例HFRS患者外周血PBM对汉坦病毒L99株抗原的增殖反应，结果见表1。可见SI与血清特异性抗体滴度无明显关系。
表1 HFRS患者PBM对汉坦病
毒抗原的增殖反应 例号
病期
抗-HFRS-IgG滴度
SI
, 百拇医药
例1
多尿期
1∶2048
9.9
例2
发热期
1∶80
2.1
例3
少尿期
1∶1024
1.8
例4
, 百拇医药
多尿期
1∶5120
2.6
例5
恢复期
1∶5120
3.1
选择SI较高的例1 PBM进行活化与克隆，其淋巴细胞SI从活化前的9.9增加到26.8，CD4/CD8比值从0.8增至1.2。
二、T克隆株对多种抗原的反应
从近400孔稀释孔中得到24株T细胞克隆，其中4株以汉坦病毒抗原特异的方式增殖，见表2。
, 百拇医药
三、T克隆细胞株的表型
4株汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的细胞表面标志为CD3+、CD4-、CD8+。表2 T克隆细胞株对多种抗原的增殖反应(cpm,
±s)克隆煮
L99株抗原
Vero E6对照
T.T
1640对照
B2
, 百拇医药
3334±109
88±10
145±22
102±27
F6
4341±216
161±28
213±16
254±66
H1
1949±62
208±14
, 百拇医药
195±20
187±27
K5
2362±150
97±9
186±36
137±45
讨 论
T细胞克隆技术是研究T细胞免疫调节网络功能的重要手段[5]。国内外学者已成功建立了登革热、分枝杆菌、乙型肝炎等特异性T细胞克隆。汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的研究，将有助于阐明T细胞不同组份在HFRS发病机制及免疫保护中的作用。目前这一方面的研究国内外尚鲜见报道。
, 百拇医药
我们采用有限稀释法，以自身PBM为饲养细胞，从HFRS患者外周血建立了四株汉坦病毒L99株抗原特异性T细胞克隆。但我们在实验中发现，克隆产率及特异性克隆的阳性率均较低，且T克隆株在体外的长期维持非常困难，其原因有待进一步探讨。
我们建立的汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的细胞表型为CD3+、CD4-及CD8+，说明其具有CD8+细胞的表型特征。但CD8+细胞包含杀伤性T细胞(TC)及抑制性T细胞(TS)，由于TC对靶细胞的杀伤受到MHC的限制，因此要进一步研究克隆细胞株的杀伤作用，有赖于建立适宜的、与克隆细胞株来源相一致的汉坦病毒感染靶细胞。
本课题为国家自然科学基金资助项目(3910011)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Chen LB,Yang WS.Abnormalities of T cell immunoregulation in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome J Infect Dis,1990,161:1016-1019.
2 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热患者自发性抑制性T细胞功能的检测及其临床意义.中华传染病杂志，1989，7：205-208.
3 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热患者外周血单核细胞产生IL-1和PGE2的水平及其与IL-2的关系.中国免疫学杂志，1990，6：235-237.
4 陈龙邦，杨为松，张文彬，等.流行性出血热干扰素系统的研究.中华传染病杂志，1991，9：38-40.
5 Kurane I,Meager A,Ennis FA.
Dengue virus-specific human T cell clones.Serotype crossactive proliferation,interferon gamma production and cytotoxic activity.J Exp Med,1989,170:763-775., 百拇医药