庚型肝炎肝脏免疫组化研究
作者：杨志国 许家璋 陈万荣 徐俊杰 乐美兆 王海涛
单位：210002 南京，解放军第81医院肝病研究所(杨志国、许家璋、徐俊杰、乐美兆)；北京军事医院学科学院五所(陈万荣、王海涛)
关键词：肝炎病毒，庚型；免疫组织化学；活组织检查，针吸
中华传染病杂980213 【摘要】 目的 探讨庚型肝炎病毒(HGV)抗原在肝组织中定位，进一步研究HGV引起肝脏损害的机制。方法 采用HGVNS5区抗原制备单克隆抗体(McAb)，对4例经临床和病理确诊的血清HGV RNA阳性的慢性庚型肝炎患者肝活检标本，进行免疫组化观察。结果 1例呈阳性染色，光镜观察显示：特异染色大部分定位于肝细胞胞浆中，部分有核着色和膜型染色，呈黄色或棕黄色颗粒状，阳性细胞数量少，大多散在分布，部分呈灶性分布；阳性细胞周围可见较多淋巴细胞浸润。结论 HGV抗原可在肝细胞中定位，大多呈胞浆型，部分呈核型和膜型，HGV属嗜肝病毒；免疫损伤可能参与了庚型肝炎的肝脏损伤机制。
, 百拇医药
Immunohistochemical research on liver tissue of patients with hepatitis G Yang Zhiguo, Xu Jiazhang, Chen Wanrong, et al. The Institute of Liver Disease, The 81st Hopsital of PLA, Nanjing 210002
【Abstract】 Objective To study the distribution of hepatitis G virus (HGV) in liver tissue and discuss the mechanisms of liver damage induced by HGV.Methods Monoclonal antibody (McAb) were expressed from the region of HGV NS5 nucleic acid sequence, Liver tissue were taken by liver biopsy from four patients with hepatitis G (all with serum HGV RNA positive) which were comformed by clinical and pathological diagnosis. Immunohistochemical assay were performed with HGV NS5 McAb. Results One of four samples showed positive staining (yellow or brown), some of which located in cytoplasm and some of which in cytonucleus and cytomembrane. The number of positive staining cells are not more. More of them disrtibuted scatteredly, some of them located. Lyphocyte can be seen around positive staining cells.Conclusion HGVAg may exist in hepatocyte, HGV is hepatotropic virus; Immunoreaction may take part in the mechanisms of liver damage.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis G virus Immunohistochemistry Biopsy, Needle
庚型肝炎病毒(HGV)是1995年发现的一种新型肝炎病毒[1，2]，一年多来，国内外学者对其分子生物学、流行病学的研究取得了不少的进展[3～5]，而在庚型肝炎(HG)临床病理特征和病毒定位方面报道较少。我们曾在国内报道了17例庚型肝炎临床和病理分析[6]，最近，我们同军事医学科学院微生物流行病研究所合作，成功地制备了HGV单克隆抗体，建立了庚型肝炎免疫组化方法，并作了初步应用，现报道如下。
材料与方法
一、研究对象及取材
选择4例慢性庚型肝炎为实验组，血清HGV RNA(RT-PCR)均为阳性，其中HGV单独感染者3例，HGV+HAV感染者1例；4例单独HCV感染的慢性丙型肝炎为对照组，血清HCV RNA及抗-HCV-IgG均呈阳性。以上病例均经临床和病理确诊，肝功能均为异常，在病情活动期行肝脏穿刺活检，同时做常规光镜、电镜检查，供免疫组化染色的组织学标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，作4 μm厚连续切片待检。
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二、试剂来源
HGV NS5区单克隆抗体(McAb)(琼脂双扩散法效价为1∶50～100)，HGV RNA 5′-非编码区引物(扩增片段为170bp)，生物素标记羊抗鼠IgG，及亲和素标记HRP均由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
三、肝脏免疫组化
按文献[7]方法：石蜡切片经脱蜡、H2O2-甲醇洗、胃蛋白酶消化后，加入单克隆抗体(工作浓度1∶50)，37℃温育2小时；PBS洗后加生物素标记羊抗鼠IgG(工作浓度1∶80)，37℃温育1小时；PBS洗后加亲和素标记HRP(工作浓度1∶160)，37℃温育1小时后DAB染色，苏木素衬染；脱水，透明，封片后镜检。实验组和对照组均按上述方法进行免疫组化染色，实验组同时设立如下二类对照试验：(1) 用正常鼠血清(工作浓度1∶50)代替McAb，(2) 用PBS代替生物素标记羊抗鼠IgG。
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结果
一、免疫组化染色结果
4例慢性庚型肝炎肝组织中有1例HGV单独感染者肝组织呈阳性染色，特异McAb染色阳性信号呈黄色或棕黄色颗粒状，阳性反应部位大多定位于肝细胞胞浆，呈胞浆均质型，部分核着色和呈膜型染色；阳性细胞数量少，大多呈散在分布于肝小叶内，部分呈灶性分布，相邻肝细胞呈阴性反应；阳性细胞周围可见较多淋巴细胞浸润。2例对照及4例丙型肝炎患者肝组织标本均呈阴性反应。
二、光镜、电镜检查结果
4例HGV感染者肝组织学检查显示：肝正常肝小叶结构存在，肝细胞均有不同程度浊肿，均有轻度点状坏死，汇管区轻度增宽，纤维组织轻度增生，肝细胞间及汇管区均见少量到中等量淋巴细胞浸润，其中免疫组化染色阳性的单独HGV感染者及HGV+HAV感染者可见肝界板有局灶性破坏而呈轻度碎屑样坏死；电镜观察显示：大部分肝细胞核膜光滑平整，染色质分布均匀，小部分有核切迹形成，此时常见核异染色质增多，大部分胞质内有明显糖原积聚，严重时粗面内质网和线粒体被挤向核周，线粒体肿胀，滑面内质网扩张，窦周间隙增宽，贮脂细胞和胶原纤维增生。
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讨论
自发现HGV以来，HGV和HG已成为国内外研究热点，由于HGV常合并HCV或/和HBV感染，HGV合并HCV或HBV感染者的临床表现同单独HCV或HBV感染者所致临床表现比较并没有明显的差异，所以目前对HGV是否单独致病尚存在争议[6]。我们用HGV-NS5区McAb对4例慢性庚肝患者肝组织进行免疫组化染色观察，其中1例单独HGV感染者肝组织呈特异染色阳性反应，大多为胞浆均质型，部分呈核型和膜型，这表明HGV也属于一种嗜肝病毒，其NS5区抗原在肝细胞内被表达，HGV有可能直接参与了对肝细胞的损伤机制；免疫组化染色阳性细胞周围及汇管区都可见少量到中等量淋巴细胞浸润。
临床和病理资料表明[4～6]，庚型肝炎起病隐匿，临床症状轻，阳性体征少，慢性化程度高，病理损害也较轻。3例单独HGV感染者中仅有1例出现局灶性肝细胞界板破坏，呈轻度碎屑状坏死，无中度以上碎屑状坏死和桥形坏死。本实验结果HGV-NS5区抗原阳性细胞数量少，大多呈散在分布，仅阳性细胞周围及汇管区有少量到中等量的淋巴细胞浸润，这是否说明是由于HGV在肝组织中数量较少，对肝细胞的损害较轻，同时免疫反应对肝组织的损伤也不严重，使得庚型肝炎因症状轻而不易被发现，隐匿起病，临床表现轻，病理损害也轻，并使其得不到及时治疗而表现为很高的慢性化倾向或是庚型肝炎本身就是一种极易慢性化的疾病，目前我们正积累病例，做进一步的研究。
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(本研究承蒙军事医学科学院五所徐在海研究员悉心指导，特此感谢)
本课题系全军“九五”课题
参考文献
1 Simons JN,Pilot TJ, Leary TP, et al. Identification of two flavivirus genomes in the GB hepatitis agent. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:3401-3404.
2 Linnen J, Wages J,Zhang ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion-transmissible agent. Science,1996,271:505-508.
, 百拇医药
3 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1996，20：249-251.
4 张定风.庚型肝炎研究的现状.中华肝脏病杂志，1997，5：1-4.
5 聂青和.己型、庚型及其它新型肝炎病毒研究概况.国外医学流行病学传染病学分册，1997，24：19-23.
6 许家璋，王晓英，隋云华，等.17例庚型肝炎临床病理分析.实用肝脏病杂志，1997，2：27-30.
7 徐在海，初连瑞，孔祥英，等.ABC和BA法的染色敏感性及其在病毒抗原定位中的应用.中华免疫学杂志，1986，2：241-243., 百拇医药
单位：210002 南京，解放军第81医院肝病研究所(杨志国、许家璋、徐俊杰、乐美兆)；北京军事医院学科学院五所(陈万荣、王海涛)
关键词：肝炎病毒，庚型；免疫组织化学；活组织检查，针吸
中华传染病杂980213 【摘要】 目的 探讨庚型肝炎病毒(HGV)抗原在肝组织中定位，进一步研究HGV引起肝脏损害的机制。方法 采用HGVNS5区抗原制备单克隆抗体(McAb)，对4例经临床和病理确诊的血清HGV RNA阳性的慢性庚型肝炎患者肝活检标本，进行免疫组化观察。结果 1例呈阳性染色，光镜观察显示：特异染色大部分定位于肝细胞胞浆中，部分有核着色和膜型染色，呈黄色或棕黄色颗粒状，阳性细胞数量少，大多散在分布，部分呈灶性分布；阳性细胞周围可见较多淋巴细胞浸润。结论 HGV抗原可在肝细胞中定位，大多呈胞浆型，部分呈核型和膜型，HGV属嗜肝病毒；免疫损伤可能参与了庚型肝炎的肝脏损伤机制。
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Immunohistochemical research on liver tissue of patients with hepatitis G Yang Zhiguo, Xu Jiazhang, Chen Wanrong, et al. The Institute of Liver Disease, The 81st Hopsital of PLA, Nanjing 210002
【Abstract】 Objective To study the distribution of hepatitis G virus (HGV) in liver tissue and discuss the mechanisms of liver damage induced by HGV.Methods Monoclonal antibody (McAb) were expressed from the region of HGV NS5 nucleic acid sequence, Liver tissue were taken by liver biopsy from four patients with hepatitis G (all with serum HGV RNA positive) which were comformed by clinical and pathological diagnosis. Immunohistochemical assay were performed with HGV NS5 McAb. Results One of four samples showed positive staining (yellow or brown), some of which located in cytoplasm and some of which in cytonucleus and cytomembrane. The number of positive staining cells are not more. More of them disrtibuted scatteredly, some of them located. Lyphocyte can be seen around positive staining cells.Conclusion HGVAg may exist in hepatocyte, HGV is hepatotropic virus; Immunoreaction may take part in the mechanisms of liver damage.
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【Key words】 Hepatitis G virus Immunohistochemistry Biopsy, Needle
庚型肝炎病毒(HGV)是1995年发现的一种新型肝炎病毒[1，2]，一年多来，国内外学者对其分子生物学、流行病学的研究取得了不少的进展[3～5]，而在庚型肝炎(HG)临床病理特征和病毒定位方面报道较少。我们曾在国内报道了17例庚型肝炎临床和病理分析[6]，最近，我们同军事医学科学院微生物流行病研究所合作，成功地制备了HGV单克隆抗体，建立了庚型肝炎免疫组化方法，并作了初步应用，现报道如下。
材料与方法
一、研究对象及取材
选择4例慢性庚型肝炎为实验组，血清HGV RNA(RT-PCR)均为阳性，其中HGV单独感染者3例，HGV+HAV感染者1例；4例单独HCV感染的慢性丙型肝炎为对照组，血清HCV RNA及抗-HCV-IgG均呈阳性。以上病例均经临床和病理确诊，肝功能均为异常，在病情活动期行肝脏穿刺活检，同时做常规光镜、电镜检查，供免疫组化染色的组织学标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，作4 μm厚连续切片待检。
, http://www.100md.com
二、试剂来源
HGV NS5区单克隆抗体(McAb)(琼脂双扩散法效价为1∶50～100)，HGV RNA 5′-非编码区引物(扩增片段为170bp)，生物素标记羊抗鼠IgG，及亲和素标记HRP均由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
三、肝脏免疫组化
按文献[7]方法：石蜡切片经脱蜡、H2O2-甲醇洗、胃蛋白酶消化后，加入单克隆抗体(工作浓度1∶50)，37℃温育2小时；PBS洗后加生物素标记羊抗鼠IgG(工作浓度1∶80)，37℃温育1小时；PBS洗后加亲和素标记HRP(工作浓度1∶160)，37℃温育1小时后DAB染色，苏木素衬染；脱水，透明，封片后镜检。实验组和对照组均按上述方法进行免疫组化染色，实验组同时设立如下二类对照试验：(1) 用正常鼠血清(工作浓度1∶50)代替McAb，(2) 用PBS代替生物素标记羊抗鼠IgG。
, 百拇医药
结果
一、免疫组化染色结果
4例慢性庚型肝炎肝组织中有1例HGV单独感染者肝组织呈阳性染色，特异McAb染色阳性信号呈黄色或棕黄色颗粒状，阳性反应部位大多定位于肝细胞胞浆，呈胞浆均质型，部分核着色和呈膜型染色；阳性细胞数量少，大多呈散在分布于肝小叶内，部分呈灶性分布，相邻肝细胞呈阴性反应；阳性细胞周围可见较多淋巴细胞浸润。2例对照及4例丙型肝炎患者肝组织标本均呈阴性反应。
二、光镜、电镜检查结果
4例HGV感染者肝组织学检查显示：肝正常肝小叶结构存在，肝细胞均有不同程度浊肿，均有轻度点状坏死，汇管区轻度增宽，纤维组织轻度增生，肝细胞间及汇管区均见少量到中等量淋巴细胞浸润，其中免疫组化染色阳性的单独HGV感染者及HGV+HAV感染者可见肝界板有局灶性破坏而呈轻度碎屑样坏死；电镜观察显示：大部分肝细胞核膜光滑平整，染色质分布均匀，小部分有核切迹形成，此时常见核异染色质增多，大部分胞质内有明显糖原积聚，严重时粗面内质网和线粒体被挤向核周，线粒体肿胀，滑面内质网扩张，窦周间隙增宽，贮脂细胞和胶原纤维增生。
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讨论
自发现HGV以来，HGV和HG已成为国内外研究热点，由于HGV常合并HCV或/和HBV感染，HGV合并HCV或HBV感染者的临床表现同单独HCV或HBV感染者所致临床表现比较并没有明显的差异，所以目前对HGV是否单独致病尚存在争议[6]。我们用HGV-NS5区McAb对4例慢性庚肝患者肝组织进行免疫组化染色观察，其中1例单独HGV感染者肝组织呈特异染色阳性反应，大多为胞浆均质型，部分呈核型和膜型，这表明HGV也属于一种嗜肝病毒，其NS5区抗原在肝细胞内被表达，HGV有可能直接参与了对肝细胞的损伤机制；免疫组化染色阳性细胞周围及汇管区都可见少量到中等量淋巴细胞浸润。
临床和病理资料表明[4～6]，庚型肝炎起病隐匿，临床症状轻，阳性体征少，慢性化程度高，病理损害也较轻。3例单独HGV感染者中仅有1例出现局灶性肝细胞界板破坏，呈轻度碎屑状坏死，无中度以上碎屑状坏死和桥形坏死。本实验结果HGV-NS5区抗原阳性细胞数量少，大多呈散在分布，仅阳性细胞周围及汇管区有少量到中等量的淋巴细胞浸润，这是否说明是由于HGV在肝组织中数量较少，对肝细胞的损害较轻，同时免疫反应对肝组织的损伤也不严重，使得庚型肝炎因症状轻而不易被发现，隐匿起病，临床表现轻，病理损害也轻，并使其得不到及时治疗而表现为很高的慢性化倾向或是庚型肝炎本身就是一种极易慢性化的疾病，目前我们正积累病例，做进一步的研究。
, http://www.100md.com
(本研究承蒙军事医学科学院五所徐在海研究员悉心指导，特此感谢)
本课题系全军“九五”课题
参考文献
1 Simons JN,Pilot TJ, Leary TP, et al. Identification of two flavivirus genomes in the GB hepatitis agent. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:3401-3404.
2 Linnen J, Wages J,Zhang ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion-transmissible agent. Science,1996,271:505-508.
, 百拇医药
3 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1996，20：249-251.
4 张定风.庚型肝炎研究的现状.中华肝脏病杂志，1997，5：1-4.
5 聂青和.己型、庚型及其它新型肝炎病毒研究概况.国外医学流行病学传染病学分册，1997，24：19-23.
6 许家璋，王晓英，隋云华，等.17例庚型肝炎临床病理分析.实用肝脏病杂志，1997，2：27-30.
7 徐在海，初连瑞，孔祥英，等.ABC和BA法的染色敏感性及其在病毒抗原定位中的应用.中华免疫学杂志，1986，2：241-243., 百拇医药