乙型肝炎病毒基因注入大鼠肝脏后的短暂抗原表达
作者：谭龙益 叶廷军 王皓 孔宪涛
单位：200003 上海 ，第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心
关键词：乙型肝炎病毒DNA转染；肝炎，乙型；大鼠
中华传染病杂980204 【摘要】 目的 建立HBV感染的急性乙型肝炎大鼠模型。方法 将经磷酸钙沉淀的含3.2kb全序列HBV DNA的HBV-PCNCX质粒直接导入大鼠肝脏。结果 10只实验动物中，8只大鼠血清HBsAg和HBeAg阳性，肝细胞中HBV mRNA及HBsAg得到表达，肝脏出现局灶性炎性细胞浸润，肝细胞坏死、浊肿等典型的病毒性肝炎病理变化。结论 将磷酸钙沉淀后的HBV DNA导入大鼠肝脏细胞，可产生病毒抗原血症和典型的急性病毒性肝炎病理变化。
Expression of hepatitis B virus antigens in SD rat after HBV DNA transfection Tan Longyi, Ye Tingjun, Wang Hao, et al. Department of Clinical Immunology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective The objective of the study was to estabolish an appropriate animal model of infection of hepatitis B virus. Methods HBV-PCNCX plasmid with 3.2kb HBV DNA were introduced into rat livers after calcification with calcium phosphate. Results HBsAg and HBeAg were positive, as well as the serum glutamic-pyruvic transaminase were elevated in 8 of 10 rats. The mRNA of HBV were detected by the technology of in situ hybridization. Focal infiltration of lymphocytes was observed in the livers. Conclusion Transfection of HBV DNA into rats liver resulted in hepatic histological and serological changes comparable to those of HBV-induced acute hepatitis in human.
, 百拇医药
【Key words】 HBV DNA transfection Hepatitis B Rat
乙型肝炎病毒(HBV)具有严格的宿主特异性，缺乏适当的研究模型，表达HBV的肝内外细胞缺乏机体内部微环境[1，2]，种系转基因动物对HBV主要基因产物处于免疫耐受状态[3]，鸭肝病毒与HBV的生物学特性相差很大[4]，虽然这些模型曾经推动了对HBV分子生物学及致病机制的研究，但它们具有不可克服的缺点。本研究利用磷酸钙沉淀技术，将HBV3.2kb基因组DNA导入大鼠肝脏，建立了短暂的HBV抗原血症和酷似HBV自然感染的急性肝炎病理变化，现将结果报道如下。
材料和方法
一、实验材料
(一) pBluescript质粒(携带双拷贝全序列HBV DNA) 雷章恒博士提供。
, http://www.100md.com
(二) 动物SD大鼠 雄性，8周龄20只，第二军医大学动物饲养中心提供。
(三) 地高辛标记的HBV DNA探针 本中心制备；磷酸钙转染试剂盒 Promega公司生产；地高辛标记及检测试剂盒 Boeheringer Mannherin公司生产；HBsAg和HBeAg检测试剂盒 华美生物试剂公司生产。
二、实验方法
(一) 质粒pBluescript导入SD大鼠肝脏 SD大鼠10只，乙醚麻醉，在无菌条件下切除大鼠肝左叶及1/3右叶，关闭腹腔，经尾静脉缓慢推注生理盐水10ml，24小时后，将pCNCX-HBV 200μl， 2mol/L CaCl2 240μl，2×HBS 1 000μl混匀，静置30分钟，待DNA-磷酸钙沉淀形成，再次打开腹腔，用止血钳轻轻夹住门静脉以暂时阻断血流，缓慢地将含HBV DNA的混合液注入残存肝脏，关闭腹腔，持续观察。对照组仅注射pCNCX载体而无HBV DNA。
, 百拇医药
(二) 血清HBV基因表达产物的测定 心脏采血，分离血清，应用ELISA方法分别测定血清HBsAg和HBeAg，在450nm处测定A值，样本A值/阴性对照A值>2.1者为阳性，反之阴性。
(三) 组织病理学变化 取动物肝组织，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察。
(四) 血清丙氨酸转氨酶(ALT)测定 采用速率法，SYNCHRONCX4全自动生化分析仪测定。
(五) 肝细胞内HBV RNA的测定 (原位杂交) 在无RNA酶污染条件下，取新鲜大鼠肝组织，立即置于液氮保存或石蜡包埋，切片，多聚甲醛固定，地高辛标记的特异性HBV DNA探针杂交，显色，显微镜观察，照相，计算机灰度扫描，计算每个视野染色颗粒所占百分比。
(六) 肝脏免疫组织化学染色 肝组织切片，辣根过氧化物酶标记的抗-HBs染色，显微镜观察。
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结果
一、抗原变化
转染后第3天，10只实验组大鼠中，8只血清HBsAg和HBeAg阳性，第20天，血清HBsAg和HBeAg均转为阴性。而对照组血清HBsAg和HBeAg始终阴性。
二、血清转氨酶变化
转染后第20天，实验组中所有10只大鼠ALT均有升高，最高432U/L，平均124U/L，而对照仅2例升高，分别为60U/L和82U/L。
三、地高辛标记的HBV DNA探针原位杂交
转染后第3天，肝组织地高辛标记的HBV DNA探针原位杂交结果如图1所示，可见大量棕褐色颗粒存在于肝细胞浆中，提示大量HBV DNA正在转录成相应的mRNA。
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四、肝脏组织病理学变化
转染后第20天，其中7只实验组大鼠肝脏呈现局部淋巴细胞浸润。肝细胞灶性浊肿及坏死，对照组仅有2例显示局部性肝细胞浊肿，未发现肝细胞坏死。
五、肝脏免疫组织变化
图1 HBV转基因大鼠肝脏HBV DNA探针原位杂交(400)
图2 HBV转基因大鼠肝脏抗-HBs免疫组织化学染色(100)
转染后第3天，肝脏HBsAb染色结果如图2，提示：HBV抗原在肝组织获得表达。
, http://www.100md.com 讨论
为了建立有效的HBV感染研究的模型，国内外学者将HBV全基因组或某些基因片段转导至肝内外细胞系，建立了HBV表达克隆，我国学者胡以平等[5]将乙型肝炎病毒全基因组注入小鼠授精卵，获得了表达HBV的转基因小鼠，为研究HBV的生物学特性和致病机制提供了可靠的实验模型，但转基因小鼠对HBV的主要基因产物处于免疫无应答反应状态，不能全面反映HBV的致病机制。近年来，人们将HBV DNA直接导入动物肝脏，建立了与HBV自然感染相似的急性乙型肝炎动物模型[6]，这必将推动对HBV的致病机制的研究。体内转基因方法很多，最初人们将裸露的HBV DNA直接注入动物肝脏，肝脏摄取DNA后，能表达HBV产物，也能产生肝脏炎症反应，但由于DNA直接暴露在外容易被机体所清除，随后利用脂质体将HBV DNA包裹在其中，延缓机体对HBV DNA的消化，提高了HBV转染成功率。本研究利用磷酸钙沉淀技术，使DNA形成颗粒，增加了肝脏的摄入，大大促进了HBV的表达效率，使这一技术渐趋成熟。
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肝叶部分切除后，残存肝细胞将代偿增生，加速肝细胞对DNA的摄入，肝细胞代谢更为活跃，促进HBV DNA的大量表达。同时部分肝叶切除将导致部分动物死亡，本研究过程中，5只动物非宰杀性死亡，全部集中在术后24小时内(未转染之前，未列入统计范围)，其主要原因是手术中失血过多，肝叶切除过大，术后未能补充足量的液体。为了降低动物死亡率，应尽可能缩短手术时间，术后及时补充足量液体。尾静脉穿刺较困难，加强预实验，提高操作技能，必要时，可经腹腔补充生理盐水。原位杂交、免疫组织化学及血清学反应均显示HBV DNA在肝脏中得到转录和翻译，但持续时间短暂，提示HBV DNA进入肝细胞后，能在其中复制增殖，随着肝细胞的分裂，肝细胞中的HBV DNA逐渐减少，病毒及其抗原表达逐渐消失。本研究大多数实验动物在转染后第20天产生了典型病毒性肝炎病理变化，与免疫应答反应有关，对照组2只动物也产生了轻度炎症反应，可能与实验本身无关。
HBV基因导入大鼠肝脏获得表达，说明大鼠肝细胞具有HBV复制、增殖条件，在自然感染条件下，HBV仅感染人和灵长类动物肝细胞，强烈提示在人类肝细胞表面有对HBV专一亲嗜性的特异受体，虽然近10余年来，大量学者进行了不懈努力，仍未克隆出相应的特异性结构，但人类肝细胞表面必然存在能与HBV特异结合的物质。
, 百拇医药
肝脏内直接注射HBV DNA建立HBV感染动物模型为HBV致病机制提供了广阔的前景，但本技术仍存在着操作复杂，动物死亡率较高的缺点；病毒及其抗原表达时间短暂等有待进一步完善。
参考文献
1 Sells MA, Chen ML, George. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Pro Natl Acad Sci USA,1987,84:1005-1008.
2 Muller C. Production of hepatitis B virus by stably transfected monocytic cell line U-937:A model for extrahepatic hepatitis B virus regulation. J Infect Dis,1992,165:929-934.
, http://www.100md.com
3 Chisari FV. A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state. Science,1985,230:1157-1158.
4 徐东槐.鸭乙型肝炎病毒模型的建立和DHBV在肝脏中的定位研究.中国人兽共患病杂志,1994，10：95-97.
5 胡以平，雷章恒，傅继梁，等.乙型肝炎病毒基因组在转基因小鼠体内的表达和复制.生物技术通讯，1997，8：125
6 Takahashi H, Fuimoto J, Hanada S, et al. Acute hepatitis in rats expressing human hepatitis B virus transgenes. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1470., http://www.100md.com
单位：200003 上海 ，第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心
关键词：乙型肝炎病毒DNA转染；肝炎，乙型；大鼠
中华传染病杂980204 【摘要】 目的 建立HBV感染的急性乙型肝炎大鼠模型。方法 将经磷酸钙沉淀的含3.2kb全序列HBV DNA的HBV-PCNCX质粒直接导入大鼠肝脏。结果 10只实验动物中，8只大鼠血清HBsAg和HBeAg阳性，肝细胞中HBV mRNA及HBsAg得到表达，肝脏出现局灶性炎性细胞浸润，肝细胞坏死、浊肿等典型的病毒性肝炎病理变化。结论 将磷酸钙沉淀后的HBV DNA导入大鼠肝脏细胞，可产生病毒抗原血症和典型的急性病毒性肝炎病理变化。
Expression of hepatitis B virus antigens in SD rat after HBV DNA transfection Tan Longyi, Ye Tingjun, Wang Hao, et al. Department of Clinical Immunology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective The objective of the study was to estabolish an appropriate animal model of infection of hepatitis B virus. Methods HBV-PCNCX plasmid with 3.2kb HBV DNA were introduced into rat livers after calcification with calcium phosphate. Results HBsAg and HBeAg were positive, as well as the serum glutamic-pyruvic transaminase were elevated in 8 of 10 rats. The mRNA of HBV were detected by the technology of in situ hybridization. Focal infiltration of lymphocytes was observed in the livers. Conclusion Transfection of HBV DNA into rats liver resulted in hepatic histological and serological changes comparable to those of HBV-induced acute hepatitis in human.
, 百拇医药
【Key words】 HBV DNA transfection Hepatitis B Rat
乙型肝炎病毒(HBV)具有严格的宿主特异性，缺乏适当的研究模型，表达HBV的肝内外细胞缺乏机体内部微环境[1，2]，种系转基因动物对HBV主要基因产物处于免疫耐受状态[3]，鸭肝病毒与HBV的生物学特性相差很大[4]，虽然这些模型曾经推动了对HBV分子生物学及致病机制的研究，但它们具有不可克服的缺点。本研究利用磷酸钙沉淀技术，将HBV3.2kb基因组DNA导入大鼠肝脏，建立了短暂的HBV抗原血症和酷似HBV自然感染的急性肝炎病理变化，现将结果报道如下。
材料和方法
一、实验材料
(一) pBluescript质粒(携带双拷贝全序列HBV DNA) 雷章恒博士提供。
, http://www.100md.com
(二) 动物SD大鼠 雄性，8周龄20只，第二军医大学动物饲养中心提供。
(三) 地高辛标记的HBV DNA探针 本中心制备；磷酸钙转染试剂盒 Promega公司生产；地高辛标记及检测试剂盒 Boeheringer Mannherin公司生产；HBsAg和HBeAg检测试剂盒 华美生物试剂公司生产。
二、实验方法
(一) 质粒pBluescript导入SD大鼠肝脏 SD大鼠10只，乙醚麻醉，在无菌条件下切除大鼠肝左叶及1/3右叶，关闭腹腔，经尾静脉缓慢推注生理盐水10ml，24小时后，将pCNCX-HBV 200μl， 2mol/L CaCl2 240μl，2×HBS 1 000μl混匀，静置30分钟，待DNA-磷酸钙沉淀形成，再次打开腹腔，用止血钳轻轻夹住门静脉以暂时阻断血流，缓慢地将含HBV DNA的混合液注入残存肝脏，关闭腹腔，持续观察。对照组仅注射pCNCX载体而无HBV DNA。
, 百拇医药
(二) 血清HBV基因表达产物的测定 心脏采血，分离血清，应用ELISA方法分别测定血清HBsAg和HBeAg，在450nm处测定A值，样本A值/阴性对照A值>2.1者为阳性，反之阴性。
(三) 组织病理学变化 取动物肝组织，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察。
(四) 血清丙氨酸转氨酶(ALT)测定 采用速率法，SYNCHRONCX4全自动生化分析仪测定。
(五) 肝细胞内HBV RNA的测定 (原位杂交) 在无RNA酶污染条件下，取新鲜大鼠肝组织，立即置于液氮保存或石蜡包埋，切片，多聚甲醛固定，地高辛标记的特异性HBV DNA探针杂交，显色，显微镜观察，照相，计算机灰度扫描，计算每个视野染色颗粒所占百分比。
(六) 肝脏免疫组织化学染色 肝组织切片，辣根过氧化物酶标记的抗-HBs染色，显微镜观察。
, http://www.100md.com
结果
一、抗原变化
转染后第3天，10只实验组大鼠中，8只血清HBsAg和HBeAg阳性，第20天，血清HBsAg和HBeAg均转为阴性。而对照组血清HBsAg和HBeAg始终阴性。
二、血清转氨酶变化
转染后第20天，实验组中所有10只大鼠ALT均有升高，最高432U/L，平均124U/L，而对照仅2例升高，分别为60U/L和82U/L。
三、地高辛标记的HBV DNA探针原位杂交
转染后第3天，肝组织地高辛标记的HBV DNA探针原位杂交结果如图1所示，可见大量棕褐色颗粒存在于肝细胞浆中，提示大量HBV DNA正在转录成相应的mRNA。
, http://www.100md.com
四、肝脏组织病理学变化
转染后第20天，其中7只实验组大鼠肝脏呈现局部淋巴细胞浸润。肝细胞灶性浊肿及坏死，对照组仅有2例显示局部性肝细胞浊肿，未发现肝细胞坏死。
五、肝脏免疫组织变化
图1 HBV转基因大鼠肝脏HBV DNA探针原位杂交(400)
图2 HBV转基因大鼠肝脏抗-HBs免疫组织化学染色(100)
转染后第3天，肝脏HBsAb染色结果如图2，提示：HBV抗原在肝组织获得表达。
, http://www.100md.com 讨论
为了建立有效的HBV感染研究的模型，国内外学者将HBV全基因组或某些基因片段转导至肝内外细胞系，建立了HBV表达克隆，我国学者胡以平等[5]将乙型肝炎病毒全基因组注入小鼠授精卵，获得了表达HBV的转基因小鼠，为研究HBV的生物学特性和致病机制提供了可靠的实验模型，但转基因小鼠对HBV的主要基因产物处于免疫无应答反应状态，不能全面反映HBV的致病机制。近年来，人们将HBV DNA直接导入动物肝脏，建立了与HBV自然感染相似的急性乙型肝炎动物模型[6]，这必将推动对HBV的致病机制的研究。体内转基因方法很多，最初人们将裸露的HBV DNA直接注入动物肝脏，肝脏摄取DNA后，能表达HBV产物，也能产生肝脏炎症反应，但由于DNA直接暴露在外容易被机体所清除，随后利用脂质体将HBV DNA包裹在其中，延缓机体对HBV DNA的消化，提高了HBV转染成功率。本研究利用磷酸钙沉淀技术，使DNA形成颗粒，增加了肝脏的摄入，大大促进了HBV的表达效率，使这一技术渐趋成熟。
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肝叶部分切除后，残存肝细胞将代偿增生，加速肝细胞对DNA的摄入，肝细胞代谢更为活跃，促进HBV DNA的大量表达。同时部分肝叶切除将导致部分动物死亡，本研究过程中，5只动物非宰杀性死亡，全部集中在术后24小时内(未转染之前，未列入统计范围)，其主要原因是手术中失血过多，肝叶切除过大，术后未能补充足量的液体。为了降低动物死亡率，应尽可能缩短手术时间，术后及时补充足量液体。尾静脉穿刺较困难，加强预实验，提高操作技能，必要时，可经腹腔补充生理盐水。原位杂交、免疫组织化学及血清学反应均显示HBV DNA在肝脏中得到转录和翻译，但持续时间短暂，提示HBV DNA进入肝细胞后，能在其中复制增殖，随着肝细胞的分裂，肝细胞中的HBV DNA逐渐减少，病毒及其抗原表达逐渐消失。本研究大多数实验动物在转染后第20天产生了典型病毒性肝炎病理变化，与免疫应答反应有关，对照组2只动物也产生了轻度炎症反应，可能与实验本身无关。
HBV基因导入大鼠肝脏获得表达，说明大鼠肝细胞具有HBV复制、增殖条件，在自然感染条件下，HBV仅感染人和灵长类动物肝细胞，强烈提示在人类肝细胞表面有对HBV专一亲嗜性的特异受体，虽然近10余年来，大量学者进行了不懈努力，仍未克隆出相应的特异性结构，但人类肝细胞表面必然存在能与HBV特异结合的物质。
, 百拇医药
肝脏内直接注射HBV DNA建立HBV感染动物模型为HBV致病机制提供了广阔的前景，但本技术仍存在着操作复杂，动物死亡率较高的缺点；病毒及其抗原表达时间短暂等有待进一步完善。
参考文献
1 Sells MA, Chen ML, George. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Pro Natl Acad Sci USA,1987,84:1005-1008.
2 Muller C. Production of hepatitis B virus by stably transfected monocytic cell line U-937:A model for extrahepatic hepatitis B virus regulation. J Infect Dis,1992,165:929-934.
, http://www.100md.com
3 Chisari FV. A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state. Science,1985,230:1157-1158.
4 徐东槐.鸭乙型肝炎病毒模型的建立和DHBV在肝脏中的定位研究.中国人兽共患病杂志,1994，10：95-97.
5 胡以平，雷章恒，傅继梁，等.乙型肝炎病毒基因组在转基因小鼠体内的表达和复制.生物技术通讯，1997，8：125
6 Takahashi H, Fuimoto J, Hanada S, et al. Acute hepatitis in rats expressing human hepatitis B virus transgenes. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1470., http://www.100md.com