变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ提取方法的改良
作者：杜民权 樊明文 边专 张平 汪喻忠
单位：430070 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：
中华口腔医学杂志980227 变形链球菌具有多种表面蛋白质抗原，其中分子量为185 000的表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ在细菌粘附过程中起着重要作用。它存在于细胞壁的表面，在细菌生长过程中分泌到上清液中。我们用改良方法从细胞中提取抗原Ⅰ/Ⅱ，旨在寻找一种快速且产量高的方法。
1.材料和方法：将变形链球菌lngbritt株涂布于脑心浸液固体培养基上，95%N2，5%CO2，37℃生长48小时；挑取单个典型菌落于3 ml BHI液体培养基中，活化18小时；进一步活化后，按1%接种量接种于1 000 ml液蛋白胨—酵母液体培养基中，置于37℃，60小时。离心，上清液用65%饱和硫酸铵沉淀，离心后透析，冷冻干燥即为上清液中提取的粗抗原Ⅰ/Ⅱ。沉淀细胞分别用8 mol/L尿素、6 mol/L盐酸胍和机械吸打处理，剧烈震荡后离心，上清液透析，冷冻干燥即为从细胞中提取的粗抗原Ⅰ/Ⅱ。采用免疫电镜、点免疫印迹、双波长薄层扫描和火箭电泳法进行检测。
2.结果：免疫电镜观察到8 mol/L尿素提取前细胞壁上存在相当数量的胶体金颗粒，但提取后细胞壁上几乎没有胶体金颗粒；点免疫印迹表明，不论从上清液中还是从细胞中提取的粗抗原，均含有抗原Ⅰ/Ⅱ存在，但膜上斑点颜色深浅不一，说明它们含抗原Ⅰ/Ⅱ的量有差别。进一步用双波长薄层扫描分析表明，8 mol/L尿素提取抗原Ⅰ/Ⅱ的量最多，是从上清液中提取量的6倍。火箭免疫电泳表明尿素提取的抗原火箭峰最高，盐酸胍次之。
3.讨论：变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ受到广泛的研究。根据变链菌表面蛋白质抗原在细胞生长过程中能分泌至上清液中的特性，学者们早期均从上清液中用饱和硫酸铵沉淀的方法提取该抗原。但上清液中抗原Ⅰ/Ⅱ含量极少，每次提取需大量培养细菌且硫酸铵沉淀的蛋白质透析时间长，操作繁锁。最近，我们通过免疫电镜观察到抗原Ⅰ/Ⅱ主要位于变形链球菌细胞壁表面，因此设想用阴离子去垢剂尿素或盐酸胍裂解变形链球菌疏水性C末端，以释放表面蛋白质。实验证明，经过8 mol/L尿素抽提后，细胞壁表面只有极少数或没有胶体金颗粒，表明此时抗原Ⅰ/Ⅱ已从细胞壁表面脱落。点免疫印迹是一种灵敏度非常高的免疫学检测方法。硝酸纤维素膜能吸附微量的蛋白质抗原，通过加未标记的特异性第一抗原和酶标记的第二抗原与印迹在膜上的蛋白质结合，最后通过底物显色。结果表明，不同方法提取的抗原均在膜上显紫黑色，但斑点颜色深浅不一。为了进一步明确提取方法的有效性，将膜上的斑点进行双波长薄层扫描分析。结果表明，8 mol/L尿素提取抗原Ⅰ/Ⅱ的量是上清液中的6倍；6 mol/L盐酸胍提取抗原的量是上清液中的3.6倍；机械吸打法提取的量与上清液中的量相当。我们的研究结果表明，以8 mol/L尿素从细胞中提取抗原Ⅰ/Ⅱ，不需硫酸铵沉淀，简化了操作步骤，提高了效率。
(收稿：1996-05-10 修回：1997-05-30), http://www.100md.com
单位：430070 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：
中华口腔医学杂志980227 变形链球菌具有多种表面蛋白质抗原，其中分子量为185 000的表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ在细菌粘附过程中起着重要作用。它存在于细胞壁的表面，在细菌生长过程中分泌到上清液中。我们用改良方法从细胞中提取抗原Ⅰ/Ⅱ，旨在寻找一种快速且产量高的方法。
1.材料和方法：将变形链球菌lngbritt株涂布于脑心浸液固体培养基上，95%N2，5%CO2，37℃生长48小时；挑取单个典型菌落于3 ml BHI液体培养基中，活化18小时；进一步活化后，按1%接种量接种于1 000 ml液蛋白胨—酵母液体培养基中，置于37℃，60小时。离心，上清液用65%饱和硫酸铵沉淀，离心后透析，冷冻干燥即为上清液中提取的粗抗原Ⅰ/Ⅱ。沉淀细胞分别用8 mol/L尿素、6 mol/L盐酸胍和机械吸打处理，剧烈震荡后离心，上清液透析，冷冻干燥即为从细胞中提取的粗抗原Ⅰ/Ⅱ。采用免疫电镜、点免疫印迹、双波长薄层扫描和火箭电泳法进行检测。
2.结果：免疫电镜观察到8 mol/L尿素提取前细胞壁上存在相当数量的胶体金颗粒，但提取后细胞壁上几乎没有胶体金颗粒；点免疫印迹表明，不论从上清液中还是从细胞中提取的粗抗原，均含有抗原Ⅰ/Ⅱ存在，但膜上斑点颜色深浅不一，说明它们含抗原Ⅰ/Ⅱ的量有差别。进一步用双波长薄层扫描分析表明，8 mol/L尿素提取抗原Ⅰ/Ⅱ的量最多，是从上清液中提取量的6倍。火箭免疫电泳表明尿素提取的抗原火箭峰最高，盐酸胍次之。
3.讨论：变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ受到广泛的研究。根据变链菌表面蛋白质抗原在细胞生长过程中能分泌至上清液中的特性，学者们早期均从上清液中用饱和硫酸铵沉淀的方法提取该抗原。但上清液中抗原Ⅰ/Ⅱ含量极少，每次提取需大量培养细菌且硫酸铵沉淀的蛋白质透析时间长，操作繁锁。最近，我们通过免疫电镜观察到抗原Ⅰ/Ⅱ主要位于变形链球菌细胞壁表面，因此设想用阴离子去垢剂尿素或盐酸胍裂解变形链球菌疏水性C末端，以释放表面蛋白质。实验证明，经过8 mol/L尿素抽提后，细胞壁表面只有极少数或没有胶体金颗粒，表明此时抗原Ⅰ/Ⅱ已从细胞壁表面脱落。点免疫印迹是一种灵敏度非常高的免疫学检测方法。硝酸纤维素膜能吸附微量的蛋白质抗原，通过加未标记的特异性第一抗原和酶标记的第二抗原与印迹在膜上的蛋白质结合，最后通过底物显色。结果表明，不同方法提取的抗原均在膜上显紫黑色，但斑点颜色深浅不一。为了进一步明确提取方法的有效性，将膜上的斑点进行双波长薄层扫描分析。结果表明，8 mol/L尿素提取抗原Ⅰ/Ⅱ的量是上清液中的6倍；6 mol/L盐酸胍提取抗原的量是上清液中的3.6倍；机械吸打法提取的量与上清液中的量相当。我们的研究结果表明，以8 mol/L尿素从细胞中提取抗原Ⅰ/Ⅱ，不需硫酸铵沉淀，简化了操作步骤，提高了效率。
(收稿：1996-05-10 修回：1997-05-30), http://www.100md.com