原位杂交技术定量检测腮腺沃辛瘤内EB病毒DNA
作者：湛凤凰 沈子华 刘蜀凡
单位：410078 长沙，湖南医科大学湘雅医院口腔科；湛凤凰(现在湖南医科大学肿瘤研究所)
关键词：
中华口腔医学杂志980221 腮腺沃辛瘤是涎腺肿瘤中最多发的肿瘤。本实验采用原位杂交结合体视学研究，对单发及腮腺多发沃辛瘤中EB病毒的分布特点，病毒拷贝数的变化规律进行了研究。
1.材料与方法：标本选择32例腮腺沃辛瘤术后标本，21例为单发肿瘤，11例为多发肿瘤，对照组为8例正常腮腺组织。原位杂交：探针采用碱变性法抽提EB病毒BamH I W重组pBR322质粒(上海中科院细胞生物所引进，插入片段3.04 kb)，经酶切低熔点凝胶电泳分离回收片断，以Dig-11-dUTP及随机引物法标记。杂交方法按常规脱蜡、入水、风干；将杂交液(含10% Dextran Sulphate，50%去离子甲酰胺，5 x Denhard′s液，6 xSSC，100 ng鲑鱼精子DNA，10 ng/片探
针)滴片(12～15 μl/片)，以硅化玻片盖片及橡胶水封片，变性后，置42℃湿盒内12h。取出后行免疫组化检测，核固红衬染，中性树脂封片。
EB病毒拷贝数的原位定量分析：图像分析仪构成为AST 386 125计算机，Olympus Vanox显微镜及Mias 300-PC Vision 85 Plus软盘。每视野随机选择5个EB病毒阳性细胞，由图像分析仪及体视学参数算出细胞内阳性颗粒总体积，与作为阳性对照的Raji细胞(50拷贝/细胞)相比，最后推算出沃辛瘤细胞内EB病毒拷贝数。
2.结果：原位杂交显示腮腺沃辛瘤内EB病毒感染率较正常腮腺内明显增高(P<0.05)，其中以导管上皮的检出率最高。多发性沃辛瘤内EB病毒的感染率及其内EB病毒的拷贝数较单发沃辛瘤内显著增高。
3.讨论：原位定量技术通过原位杂交，将杂交信号的二维图像转化为三维推断，可以弥补Southern杂交定量不足。但该方法仅检测细胞核内的EB病毒拷贝数，不能全面描述整个细胞的感染状况。本研究表明，正常腮腺组织中即存在EB病毒，EB病毒的大量复制与沃辛瘤，特别是多发性沃辛瘤关系密切；其检出部位主要是小导管上皮细胞的胞核和胞浆，说明EB病毒最初感染导管上皮细胞。另外导管内皮细胞及脱落腺泡细胞上均发现有EB病毒的存在，这说明EB病毒可随唾液传播。
在腮腺导管上皮存在EB病毒受体(CR2，CD21)，EB病毒与导管上皮结合后，暴露于内外界多种因素，由于机体免疫力低下，上皮细胞的有丝分裂激活，同时B淋巴细胞也大量增生，从而形成沃辛瘤。
(收稿：1997-03-16 修回：1997-08-15), 百拇医药
单位：410078 长沙，湖南医科大学湘雅医院口腔科；湛凤凰(现在湖南医科大学肿瘤研究所)
关键词：
中华口腔医学杂志980221 腮腺沃辛瘤是涎腺肿瘤中最多发的肿瘤。本实验采用原位杂交结合体视学研究，对单发及腮腺多发沃辛瘤中EB病毒的分布特点，病毒拷贝数的变化规律进行了研究。
1.材料与方法：标本选择32例腮腺沃辛瘤术后标本，21例为单发肿瘤，11例为多发肿瘤，对照组为8例正常腮腺组织。原位杂交：探针采用碱变性法抽提EB病毒BamH I W重组pBR322质粒(上海中科院细胞生物所引进，插入片段3.04 kb)，经酶切低熔点凝胶电泳分离回收片断，以Dig-11-dUTP及随机引物法标记。杂交方法按常规脱蜡、入水、风干；将杂交液(含10% Dextran Sulphate，50%去离子甲酰胺，5 x Denhard′s液，6 xSSC，100 ng鲑鱼精子DNA，10 ng/片探
针)滴片(12～15 μl/片)，以硅化玻片盖片及橡胶水封片，变性后，置42℃湿盒内12h。取出后行免疫组化检测，核固红衬染，中性树脂封片。
EB病毒拷贝数的原位定量分析：图像分析仪构成为AST 386 125计算机，Olympus Vanox显微镜及Mias 300-PC Vision 85 Plus软盘。每视野随机选择5个EB病毒阳性细胞，由图像分析仪及体视学参数算出细胞内阳性颗粒总体积，与作为阳性对照的Raji细胞(50拷贝/细胞)相比，最后推算出沃辛瘤细胞内EB病毒拷贝数。
2.结果：原位杂交显示腮腺沃辛瘤内EB病毒感染率较正常腮腺内明显增高(P<0.05)，其中以导管上皮的检出率最高。多发性沃辛瘤内EB病毒的感染率及其内EB病毒的拷贝数较单发沃辛瘤内显著增高。
3.讨论：原位定量技术通过原位杂交，将杂交信号的二维图像转化为三维推断，可以弥补Southern杂交定量不足。但该方法仅检测细胞核内的EB病毒拷贝数，不能全面描述整个细胞的感染状况。本研究表明，正常腮腺组织中即存在EB病毒，EB病毒的大量复制与沃辛瘤，特别是多发性沃辛瘤关系密切；其检出部位主要是小导管上皮细胞的胞核和胞浆，说明EB病毒最初感染导管上皮细胞。另外导管内皮细胞及脱落腺泡细胞上均发现有EB病毒的存在，这说明EB病毒可随唾液传播。
在腮腺导管上皮存在EB病毒受体(CR2，CD21)，EB病毒与导管上皮结合后，暴露于内外界多种因素，由于机体免疫力低下，上皮细胞的有丝分裂激活，同时B淋巴细胞也大量增生，从而形成沃辛瘤。
(收稿：1997-03-16 修回：1997-08-15), 百拇医药