人舌鳞癌裸鼠原位移植模型及其主要生物学特性的研究
作者：杨宏宇 李金荣 胡传真 李宏礼 陈新明
单位：430070 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：舌肿瘤；动物，实验；癌，鳞状细胞
中华口腔医学杂志980203 【摘要】 目的 建立一种与临床更相关的人舌鳞癌动物模型。方法 将人舌鳞癌Tca 8113细胞行裸鼠原位移植并连续传代。对每代移植瘤和裸鼠口底、颌下组织、肉眼可见的颈部淋巴结以及下颌骨进行病理学观察。对第5代移植瘤进行超微结构观察。第4代移植瘤及裸鼠骨髓细胞进行染色体检查。结果 移植成功率为90%，液氮冻存复苏移植成功率为100%。移植瘤符合鳞状细胞癌特征，染色体检查表明其属人类染色体。4只裸鼠发生了口底和颌下浸润。1只转移至颌下淋巴结。癌细胞浸润肌肉，神经和周围血管。结论 本模型较客观地反映了人舌鳞癌的生物学行为，为舌癌的生物学及实验治疗的研究提供了较理想的动物模型。
, http://www.100md.com
Human tongue carcinoma model established in nude mice by orthotopic transplantation and studies on its major biological properties Yang Hongyu, Li Jinrong, Hu Chuanzhen, et al. Hospital of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430070
【Abstract】 Objective To establish clinically relevant animal model of human tongue carcinoma.Methods Cell suspensions of human tongue squamous cell carcinoma cell line (Tca8113) were inoculated orthotopically into nude mice and the growing tumors were serially passaged by orthotopic transplantation. The oral cavity, mandible and neck of the nude mice were sectioned and examined histologically. The ultrastructure and chromosome of the tumors were also investigated. Results ①The success rate of transplant was 90%. ②The mouse-growing tumors exhibited the same identical properties as the donor tumor. ③Human tongue cancer cells could grow in the homologous oral cavity site of nude mice, extended and metastasized to adjacent tissues and lymph node of the neck. Conclusion The model can be useful for evaluating biological behavior and new therapeutics for tongue cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Tongue neoplasms Animals, laboratory Carcinoma, squamous cell
人舌癌裸鼠移植模型的报道仍限于皮下[1]。我们自1994年11月开始，将人舌鳞癌Tca8113细胞裸鼠舌原位移植和鼠间传代，旨在建立一种与临床更接近的人舌癌动物模型。
材料与方法
1.实验动物：BALB/c-nu/nu裸鼠，3～5周龄，雌雄兼用，体重15～20g(同济医科大学和湖北省医学科学院实验动物中心提供)。 全部裸鼠严格饲养在无特异性病原菌(specific pathogen free，SPF)、恒温(20～26℃)、恒湿(45%～50%)的空气洁净的层流架内；笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸汽灭菌。
2.人舌鳞癌Tca8113细胞(由上海第二医科大学赠送)。
, http://www.100md.com
3.原位移植：
(1)原位接种：对数增殖期贴壁生长的Tca8113细胞消化后，RPMI-1640培养液冲洗、吹打、离心。调整细胞浓度达4×1010个/L。按35mg/kg体重腹腔注射1.25%戊巴比妥钠麻醉，每只裸鼠舌缘中份粘膜下注入细胞悬液0.05ml。共接种5只。
(2)原位移植传代：细胞接种4周后，无菌切除移植瘤，并剪成1mm3～2mm3瘤块。待移植裸鼠麻醉后，剖开舌缘或舌腹粘膜，植入一瘤块。每代用鼠3～5只，移植瘤冻存与复苏、复苏后再移植[2]。
4.观察项目：
(1)移植成功率。(2)生长潜伏期。(3)每周2次测量移植瘤最长和最短半径A、B，按公式V=3/4πAB2计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。(4)解剖和组织病理学检查：全部处死或自然死亡荷瘤裸鼠均将移植瘤、口底、颌下组织、肉眼可见颈淋巴结、下颌骨(硝酸脱钙)、肝、肾、肺、脾等脏器解剖，经10%福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察。(5)电镜标本经常规戊二醛固定，超薄切片，日立H-600透射电镜观察。(6)染色体检查：取第4代移植瘤，采用短期培养法制备染色体标本。裸鼠骨髓细胞采用直接法制备染色体标本。均经Giemsa染色，光镜下观察。
, 百拇医药
结果
一、移植瘤生长特性
首代接种5只裸鼠均在7～10天成瘤。连续传代中，潜伏期渐缩短并稳定在10～15天，舌腹较舌缘移植瘤潜伏期短。第2、4、6代移植瘤生长曲线表明，生长高峰在15～30天，后期生长缓慢，符合Gompertz曲线的一般规律(图1)；肿瘤移植成功率为90%(27/30)，3例液氮冻存复苏全部成功。
图1 肿瘤生长曲线
二、组织病理学检查
1.解剖学观察：所有裸鼠的原位移植瘤超舌中线或占据舌前2/3，甚至充满口腔(图2)。移植瘤呈圆形或卵圆形，浸润性生长。瘤体表面光滑，质地硬，可见清晰的毛细血管，舌腹部移植瘤表面血管更为丰富。剖面呈均质状、乳白色，无包膜。部分瘤体中央液化。1～4代荷瘤裸鼠未见颌下、口底浸润。第5代1只带瘤生长74天，有口底浸润。第6代3只舌腹部移植的裸鼠，处死或死亡时有口底和颌下浸润，呈结节状、与周围组织粘连，约6mm×8mm。其中1只颌下淋巴结肿大。
, 百拇医药
图2 裸鼠舌原位移植瘤
2.光镜观察：1、3、5代移植瘤癌细胞排列紧密，呈巢状、片块或条索状，细胞呈多角形，异形性明显(图3)。核圆形、卵圆形、大小各异，核分裂象多见，并可见病理核分裂。染色质较粗、深染；核仁多个，核浆比例增大。有的区域可见瘤巨细胞，有的癌巢中央坏死；舌腹部移植瘤间质中可见丰富的新生血管，癌细胞浸润肌肉、神经和周围血管(图4)，并转移至颌下淋巴结。在移植传代中，分化程度未见明显变化。下颌骨未见侵袭破坏；肝、肾、肺等脏器未见转移。
3.电镜观察：细胞核大而不规则、核膜凹陷，核仁多个，核膜消失、核碎裂；细胞间有较多的桥粒，胞浆中可见张力原纤维(图5)。
三、染色体检查
对50个处于分裂中期的细胞进行分析。染色体数目：48～119，全部为非整倍体，多为亚三倍体。所有细胞染色体不同于小鼠的40条端着丝粒染色体，均属人种。移植瘤中65条占28.48%。
, http://www.100md.com
图3 癌巢中细胞呈多角形，异形性明显(HE×100) 图4 癌细胞浸润神经(HE×400) 图5 张力原纤维(TEM×17 000)
讨论
传统的移植途径是将肿瘤细胞或组织皮下移植，皮下移植瘤常被纤维结缔组织囊所包绕，限制了肿瘤局部扩散和自发转移[3]。肿瘤的生长对特定器官的特定部位有其特异性，即肿瘤细胞在特定部位与宿主相互作用的结果[4]。舌部血管及淋巴管丰富，加之舌运动，舌癌易发生转移。皮下移植瘤缺乏这一解剖上的微环境。我们在建立人舌癌裸鼠移植模型时首先考虑部位的相似性，采用舌原位移植和鼠间连续传代。移植瘤的组织病理和超微结构均提示为鳞状细胞癌，与原肿瘤形态基本一致[5 ]。以上可证实人舌鳞癌裸鼠原位移植模型的建立。
许多研究表明，不同的肿瘤移植于相同的器官或相同的肿瘤移植于不同的器官，其侵袭力差异很大[6]。本实验中，同一肿瘤移植于同一器官的不同部位，侵袭力表现也不同。移植于舌腹较舌缘的移植瘤，不仅生长潜伏期短，且均发生了口底和颌下组织浸润，1只转移至颌下淋巴结。舌腹移植瘤表面可见更为丰富的毛细血管包绕，肿瘤间质中也可见大量的新生血管。这可能因该部位距自然血管较舌缘更近。与皮下移植相比，舌原位移植瘤具有丰富的自然血管，可保证瘤体获得充分的营养，并提供了促肿瘤生长因子，且瘤细胞具有亲器官性，易在与母体肿瘤相同的器官上滞留、浸润和扩散，更能模拟人舌癌的侵袭，转移过程。
, http://www.100md.com
本模型生长稳定，潜伏期短，易于复制；移植瘤在舌内生长并向周周侵袭，扩散；较客观地反映了人舌癌的生物学行为，更接近舌癌的临床特征，为舌癌的生物学行为及实验治疗研究提供了理想的模型。
本课题为湖北省自然科学基金资助
参考文献
1 王峥，张锡泽，邱蔚六，等.人舌鳞癌裸小鼠体内模型的建立.中华口腔医学杂志，1988，23：17-19.
2 刘秋珍，脱朝伟，张龙石，等.人胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植模型的建立及其生物学特性的研究.中华肿瘤杂志，1992，11：403-406.
3 Wennerberg J. Changes in growth pattern of human squamous-cell carcinomas of the head and neck during serial passages in nude mice. Int J Cancer, 1984, 33:245-250.
, http://www.100md.com
4 Fu X, Hoffman RM. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res, 1993, 13:283-286.
5 何荣根，许秀祺，周晓健，等.人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性.肿瘤，1983，3：97-100.
6 杨宏宇，李金荣，胡传真.人肿瘤裸鼠转移模型的研究进展.口腔医学纵横，1997，13：184-186.
(收稿：1996-05-22 修回：1997-11-07), http://www.100md.com
单位：430070 武汉，湖北医科大学口腔医学院
关键词：舌肿瘤；动物，实验；癌，鳞状细胞
中华口腔医学杂志980203 【摘要】 目的 建立一种与临床更相关的人舌鳞癌动物模型。方法 将人舌鳞癌Tca 8113细胞行裸鼠原位移植并连续传代。对每代移植瘤和裸鼠口底、颌下组织、肉眼可见的颈部淋巴结以及下颌骨进行病理学观察。对第5代移植瘤进行超微结构观察。第4代移植瘤及裸鼠骨髓细胞进行染色体检查。结果 移植成功率为90%，液氮冻存复苏移植成功率为100%。移植瘤符合鳞状细胞癌特征，染色体检查表明其属人类染色体。4只裸鼠发生了口底和颌下浸润。1只转移至颌下淋巴结。癌细胞浸润肌肉，神经和周围血管。结论 本模型较客观地反映了人舌鳞癌的生物学行为，为舌癌的生物学及实验治疗的研究提供了较理想的动物模型。
, http://www.100md.com
Human tongue carcinoma model established in nude mice by orthotopic transplantation and studies on its major biological properties Yang Hongyu, Li Jinrong, Hu Chuanzhen, et al. Hospital of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430070
【Abstract】 Objective To establish clinically relevant animal model of human tongue carcinoma.Methods Cell suspensions of human tongue squamous cell carcinoma cell line (Tca8113) were inoculated orthotopically into nude mice and the growing tumors were serially passaged by orthotopic transplantation. The oral cavity, mandible and neck of the nude mice were sectioned and examined histologically. The ultrastructure and chromosome of the tumors were also investigated. Results ①The success rate of transplant was 90%. ②The mouse-growing tumors exhibited the same identical properties as the donor tumor. ③Human tongue cancer cells could grow in the homologous oral cavity site of nude mice, extended and metastasized to adjacent tissues and lymph node of the neck. Conclusion The model can be useful for evaluating biological behavior and new therapeutics for tongue cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Tongue neoplasms Animals, laboratory Carcinoma, squamous cell
人舌癌裸鼠移植模型的报道仍限于皮下[1]。我们自1994年11月开始，将人舌鳞癌Tca8113细胞裸鼠舌原位移植和鼠间传代，旨在建立一种与临床更接近的人舌癌动物模型。
材料与方法
1.实验动物：BALB/c-nu/nu裸鼠，3～5周龄，雌雄兼用，体重15～20g(同济医科大学和湖北省医学科学院实验动物中心提供)。 全部裸鼠严格饲养在无特异性病原菌(specific pathogen free，SPF)、恒温(20～26℃)、恒湿(45%～50%)的空气洁净的层流架内；笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸汽灭菌。
2.人舌鳞癌Tca8113细胞(由上海第二医科大学赠送)。
, http://www.100md.com
3.原位移植：
(1)原位接种：对数增殖期贴壁生长的Tca8113细胞消化后，RPMI-1640培养液冲洗、吹打、离心。调整细胞浓度达4×1010个/L。按35mg/kg体重腹腔注射1.25%戊巴比妥钠麻醉，每只裸鼠舌缘中份粘膜下注入细胞悬液0.05ml。共接种5只。
(2)原位移植传代：细胞接种4周后，无菌切除移植瘤，并剪成1mm3～2mm3瘤块。待移植裸鼠麻醉后，剖开舌缘或舌腹粘膜，植入一瘤块。每代用鼠3～5只，移植瘤冻存与复苏、复苏后再移植[2]。
4.观察项目：
(1)移植成功率。(2)生长潜伏期。(3)每周2次测量移植瘤最长和最短半径A、B，按公式V=3/4πAB2计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线。(4)解剖和组织病理学检查：全部处死或自然死亡荷瘤裸鼠均将移植瘤、口底、颌下组织、肉眼可见颈淋巴结、下颌骨(硝酸脱钙)、肝、肾、肺、脾等脏器解剖，经10%福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，光镜观察。(5)电镜标本经常规戊二醛固定，超薄切片，日立H-600透射电镜观察。(6)染色体检查：取第4代移植瘤，采用短期培养法制备染色体标本。裸鼠骨髓细胞采用直接法制备染色体标本。均经Giemsa染色，光镜下观察。
, 百拇医药
结果
一、移植瘤生长特性
首代接种5只裸鼠均在7～10天成瘤。连续传代中，潜伏期渐缩短并稳定在10～15天，舌腹较舌缘移植瘤潜伏期短。第2、4、6代移植瘤生长曲线表明，生长高峰在15～30天，后期生长缓慢，符合Gompertz曲线的一般规律(图1)；肿瘤移植成功率为90%(27/30)，3例液氮冻存复苏全部成功。
图1 肿瘤生长曲线
二、组织病理学检查
1.解剖学观察：所有裸鼠的原位移植瘤超舌中线或占据舌前2/3，甚至充满口腔(图2)。移植瘤呈圆形或卵圆形，浸润性生长。瘤体表面光滑，质地硬，可见清晰的毛细血管，舌腹部移植瘤表面血管更为丰富。剖面呈均质状、乳白色，无包膜。部分瘤体中央液化。1～4代荷瘤裸鼠未见颌下、口底浸润。第5代1只带瘤生长74天，有口底浸润。第6代3只舌腹部移植的裸鼠，处死或死亡时有口底和颌下浸润，呈结节状、与周围组织粘连，约6mm×8mm。其中1只颌下淋巴结肿大。
, 百拇医药
图2 裸鼠舌原位移植瘤
2.光镜观察：1、3、5代移植瘤癌细胞排列紧密，呈巢状、片块或条索状，细胞呈多角形，异形性明显(图3)。核圆形、卵圆形、大小各异，核分裂象多见，并可见病理核分裂。染色质较粗、深染；核仁多个，核浆比例增大。有的区域可见瘤巨细胞，有的癌巢中央坏死；舌腹部移植瘤间质中可见丰富的新生血管，癌细胞浸润肌肉、神经和周围血管(图4)，并转移至颌下淋巴结。在移植传代中，分化程度未见明显变化。下颌骨未见侵袭破坏；肝、肾、肺等脏器未见转移。
3.电镜观察：细胞核大而不规则、核膜凹陷，核仁多个，核膜消失、核碎裂；细胞间有较多的桥粒，胞浆中可见张力原纤维(图5)。
三、染色体检查
对50个处于分裂中期的细胞进行分析。染色体数目：48～119，全部为非整倍体，多为亚三倍体。所有细胞染色体不同于小鼠的40条端着丝粒染色体，均属人种。移植瘤中65条占28.48%。
, http://www.100md.com
图3 癌巢中细胞呈多角形，异形性明显(HE×100) 图4 癌细胞浸润神经(HE×400) 图5 张力原纤维(TEM×17 000)
讨论
传统的移植途径是将肿瘤细胞或组织皮下移植，皮下移植瘤常被纤维结缔组织囊所包绕，限制了肿瘤局部扩散和自发转移[3]。肿瘤的生长对特定器官的特定部位有其特异性，即肿瘤细胞在特定部位与宿主相互作用的结果[4]。舌部血管及淋巴管丰富，加之舌运动，舌癌易发生转移。皮下移植瘤缺乏这一解剖上的微环境。我们在建立人舌癌裸鼠移植模型时首先考虑部位的相似性，采用舌原位移植和鼠间连续传代。移植瘤的组织病理和超微结构均提示为鳞状细胞癌，与原肿瘤形态基本一致[5 ]。以上可证实人舌鳞癌裸鼠原位移植模型的建立。
许多研究表明，不同的肿瘤移植于相同的器官或相同的肿瘤移植于不同的器官，其侵袭力差异很大[6]。本实验中，同一肿瘤移植于同一器官的不同部位，侵袭力表现也不同。移植于舌腹较舌缘的移植瘤，不仅生长潜伏期短，且均发生了口底和颌下组织浸润，1只转移至颌下淋巴结。舌腹移植瘤表面可见更为丰富的毛细血管包绕，肿瘤间质中也可见大量的新生血管。这可能因该部位距自然血管较舌缘更近。与皮下移植相比，舌原位移植瘤具有丰富的自然血管，可保证瘤体获得充分的营养，并提供了促肿瘤生长因子，且瘤细胞具有亲器官性，易在与母体肿瘤相同的器官上滞留、浸润和扩散，更能模拟人舌癌的侵袭，转移过程。
, http://www.100md.com
本模型生长稳定，潜伏期短，易于复制；移植瘤在舌内生长并向周周侵袭，扩散；较客观地反映了人舌癌的生物学行为，更接近舌癌的临床特征，为舌癌的生物学行为及实验治疗研究提供了理想的模型。
本课题为湖北省自然科学基金资助
参考文献
1 王峥，张锡泽，邱蔚六，等.人舌鳞癌裸小鼠体内模型的建立.中华口腔医学杂志，1988，23：17-19.
2 刘秋珍，脱朝伟，张龙石，等.人胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植模型的建立及其生物学特性的研究.中华肿瘤杂志，1992，11：403-406.
3 Wennerberg J. Changes in growth pattern of human squamous-cell carcinomas of the head and neck during serial passages in nude mice. Int J Cancer, 1984, 33:245-250.
, http://www.100md.com
4 Fu X, Hoffman RM. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res, 1993, 13:283-286.
5 何荣根，许秀祺，周晓健，等.人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性.肿瘤，1983，3：97-100.
6 杨宏宇，李金荣，胡传真.人肿瘤裸鼠转移模型的研究进展.口腔医学纵横，1997，13：184-186.
(收稿：1996-05-22 修回：1997-11-07), http://www.100md.com