准分子激光角膜切削术单纯治疗近视散光变化分析
作者：马彦 李志辉 陆文秀
单位：
关键词：
角膜溃疡胶原酶活化与活性氧的相关性研究 摘 要 从动物实验角度对细菌性角膜溃疡氧自由基与活性胶原酶生成关系进行了观察，结果表明：角膜溃疡后组织中氧自由基产生明显的升高，同时活性胶原酶也高。而经抗氧化治疗后，随氧自由基清除的程度，组织中活性胶原酶的生成也不同程度下降，表现氧自由基的产生与活性胶原酶生成呈正相关(r＝0.9956，p＝0.0044)；并通过潜酶活化比较，表明抗氧化治疗后组织中部分潜酶未能活化，说明在体内氧自由基确实参与胶原酶潜酶的活化。
分类号 R772.21
A correlative study of active oxygen and active collagenase in corneal ulceration/Wang Yi…//Ophthalmol CHN.-1998，7(2).-119～122(Department of Ophthalmology，Southwestern Hospital，3rd Military Medical University，Chongqing 400038)
, 百拇医药
This study is to explore the relation between oxygen free radicals and collagenase activation in corneal ulcer.The model of pseudomonas aeruginosa corneal ulcer in rabbits was adopted.The level of malondialdehyde(MDA) and the collagenolytic activity in the cornea were observed after treated with antioxidants.Results showed that both MDA level and collagenolytic activity in the cornea decreased signficantly after treated with antioxidants，and they showed parallel relation(r＝0.9956).The collagenolytic activity of the treated group with SOD+CAT，when APMA was added，was significantly higher than that of the group without APMA.However，the collagenolytic activity of the control with APMA or without APMA had no significant difference. The activation of latent collagenase is closely linked to oxygen free radicals by PMNs generated.
, 百拇医药
Subject terms Cornea ulcer；Collagenase Antioxidants
研究表明，无论是组织细胞或多核白细胞均以潜酶(latent collagenase)形式分泌或释放胶原酶[1，2]。因此，胶原酶被释放后必然有一活化过程，而这一活化机制仍不清楚，迄今对其活化的体外生化研究至少提出了4种可能的机制，即蛋白水解、构型变化、巯基转换以及氧化活化[3-9]，然而这些研究均在体外进行，动物实验研究仍未见报道，本研究从动物实验的角度，采用兔绿脓杆菌性角膜溃疡为模型，观察角膜溃疡活性氧的产生与胶原酶活化的相关性。
1 材料与方法
1.1 动物选择及模型制作
选用大白兔，体重2～2.5kg。全麻后，0.5%的卡因滴双眼三次，用5mm直径角膜环钻于角膜中央钻痕。固定眼球，4号皮试针自上方钻痕缘浅层潜行进入角膜中央，缓慢注射铜绿色假单孢菌悬液50μl(107个/ml)。
, 百拇医药
1.2 分组、治疗及取材
随机分组，每组7只兔。A组：对照组，以0.9%生理盐水滴眼；B组：SOD+CAT混合液滴眼(SOD 1500u/ml，CAT 2000u/ml)；C组：1%茶多酚液滴眼；D组：2.5%维生素C液滴眼，维生素E肌注50mg/只*日.均在模型制作后立即开始治疗，每日滴眼6次，治疗十天后处死动物，各组切取角膜组织。
1.3 组织处理及测定指标
1.3.1 组织处理 取全角膜，剪碎后加入冰冷的0.1MTris—HCl缓冲液(pH7.6，含0.4MNaCl，0.01MCaCl2)0.8ml中，组织匀浆机间断匀浆4次，每次20秒(冰水浴条件下)，4℃，10000rpm，10分钟，取上清液测定各指标及蛋白定量。
1.3.2 测定指标 ①丙二醛(MDA)测定，采用荧光光度法。具体步骤参见文献[10]。②胶原酶活性的测定：利用50%的二恶烷可沉淀未变性的胶原，而不能沉淀变性的胶原为原理，按照Terato K[11]的方法将酶-底物作用后的变性与未变性胶原分离，测定上清中羟脯氨酸的含量，反映上清中存在的被水解的胶原量，也代表了胶原酶的活性。③蛋白质浓度测定：采用Lowry法。
, 百拇医药
2 结果
2.1 抗氧化治疗对丙二醛(MDA)含量及胶原酶活性影响
经不同的抗氧化剂治疗后各组角膜组织中MDA的含量及胶原酶活性均显著低于未治疗组(p<0.05)；MDA含量与胶原酶活性呈正相关，相关系数r＝0.9956，p＝0.0044。各治疗组间，B组与C组间无显著性差异(p>0.05)，而D组的MDA含量及胶原酶活性则均显著高于B、C组(p<0.05)。对照组羟脯氨酸(Hydro-xyproline) 含量在加APMA与未加APMA比较，无明显差异(p>0.05)；而B组加入APMA(4-乙酸氨基苯汞，胶原酶潜酶活化)后羟脯氨酸含量显著高于未加APMA(p<0.05)，但仍显著低于对照组(p<0.05)。(见附表及图1，2)。
附表 抗氧化治疗对MDA含量及胶原酶活性影响
(A)
, 百拇医药
对照组
(B)
SOD+CAT
治疗组
(C)
1%茶多酚
治疗组
(D)
2.5%维C+E
治疗组
MDA(nmol/mg.pro)
羟脯氨酸(μg/mg.pro)
, http://www.100md.com 未加APMA
加APMA
1.285±0.277
23.658±3.818
24.114±3.184
0.696±0.110
11.181±4.145
17.605±2.772
0.763±0.122
12.007±4.670
*
0.938±0.110
, 百拇医药
17.068±3.149
*
*APMA：4-乙酸氨基苯汞，胶原酶潜酶活化
图1 抗氧化治疗对MDA含量及胶原酶活性影响
图2 胶原酶活性与MDA含量相关关系
3 讨论
自从组织胶原酶被发现，它对角膜溃疡性损害所起的重要作用很快就被人们所认识和重视，并发现无论是感染性，化学性，热烧伤性以及自身免疫性角膜溃疡均与胶原酶密切相关[12-15]。而研究表明，无论是组织细胞或多核白细胞均以潜酶(latent collagenase)形式分泌或释放胶原酶。对胶原酶潜酶活化的研究迄今至少提出了四种可能的活化途径，即蛋白水解活化、构型改变活化、巯基转换活化以及氧化活化。由于以往的研究主要在体外进行，因此胶原酶在体内的确切生物学活化过程仍需进一步证实。
, http://www.100md.com
早年对于角膜溃疡胶原酶的研究仅仅局限于能裂解Ⅰ型胶原的Ⅰ型胶原酶，而且在很长一段时期被认为该酶是唯一的一种胶原酶。90年代初，由Fini等[16，17]首先报道了角膜组织能产生明胶酶(gelatinase，即Ⅳ型胶原酶)，并证明，角膜成纤维细胞可产生和分泌四种不同的基质金属蛋白酶(MMPs)，即间质胶原酶(MMP-1)、基质溶素(Stromelyein，MMP-3)、92KD(MMP-9)和72KD(MMP-2)明胶酶。从而表明角膜胶原酶的产生的多样性。近来Brown和Opbroek等的研究[18，19]表明，角膜细胞也产生二种特异的基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)，其中一个为28KD(TIMP-1)，另一个为21KD(TIMP-2)，后者与72KD明胶酶以1∶1形成无活性复合酶。活性氧可以使复合酶骤解而使酶活化，TIMP在基质中起到调节MMP活性的作用。
炎症性疾病时最突出的特征之一是大量多核白细胞(PMN)浸润病区。研究表明，粒细胞吞噬细菌后一方面在膜上NADPH氧化酶的作用下产生O2，继后又生成H2O2和OH，这三种氧的衍生物都有强烈的氧化作用，既有杀菌作用，同时OH又是脂质过氧化的强烈引发剂。另一方面粒细胞还大量释放蛋白水解酶，包括胶原酶。本研究结果表明，通过不同的抗氧化剂治疗细菌性角膜溃疡，角膜组织中MDA含量显著低于对照组，同时胶原酶活性也显著下降。而且各治疗组对MDA的降低程度与对胶原酶活性的抑制作用成平行相关(r＝0.9956，p<0.0044)。并通过加入APMA(胶原酶潜酶活化剂)与未加APMA比较。结果表明，在对照组胶原酶活性无明显变化，说明角膜组织中没有明显的潜酶存在。而在SOD+CAT治疗组则加入APMA后胶原酶活性显著提高，说明经清除氧自由基以后确使部分潜酶未能活化而存在于组织中，表明在体内氧自由基参与了胶原酶潜酶的活化过程。
, http://www.100md.com
本研究从动物实验角度观察了不同抗氧化剂治疗角膜溃疡后MDA的含量(间接反应组织中活性氧的产生)与胶原酶活性的相关性，从而证明了氧化活化确是胶原酶潜酶在体内的一条活化途径。
4 参考文献
1 Gillian M，Peppin G，Ortiz X，et al.Collagenase is a component of the specific granules of human neutriphil leucocytes.Biochem J，1977；162：195
2 Henning BH，Charles MC，Robert ET，et al.Trypsin activation of latent collagenase from several mammalian sources.Scand J Dent Res，1975；83：302
, 百拇医药
3 Berman M，Leary R，Gage J.Evidence for a role of the plasminogen activator-plasmin system in corneal ulceration.Invest Ophthalmol Vis Sci，1980；20：1204
4 Werb Z，Mainardi CL，Vater CA，et al.Endogenous activation of latent collagenase by rheumatoid synovial cells：Evidence for a role of plasminogen activator.New Engl J Med，1977；296：1017
5 Macartney HW，Tschesche H.Latent collagenase from human polymorphonuclear leucocytes and activation to collagenase by removal of an inhibitor.FEBS Lett，1980；119：327
, 百拇医药
6 Herkko S.Kimmo S.Otso L，et al.Activation of latent human neutrophil collagenase by reactive oxygen species and serine proteases.Biochem Biophy Res Commu，1990；173：979
7 Weiss SJ，Peppin G.Ortiz X，et al.Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils.Science，1985；227：747
8 Burkhardt H，Hartmann F，Schwingel ML.Activation of latent collagenase from polymorphonuclear leukocytes by oxygen radicals.Enzyme，1986；36：221
, http://www.100md.com
9 Saari H，Suomalainen K，Lindy O，et al.Activation of latent human neutrophil collagenase by reactive oxygen species and serine proteases.Biochem Biophy Res Commun，1990；171(3)：979
10 Ohkawa H，Ohishi N，Yagi K，et al.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid.Anal Biochem，1979；95：351
11 Terato K，Nagai Y，Kawanishi K，et al.A rapid assay method of collagenase activity using 14C-labeled soluble collagen as substrate.Biochin Biophy Acta，1976；445：753
, 百拇医药
12 Brown SI，Hook CW.Isolation of stromal collagenase in corneal inflamation.Am J Ophthalmol.1971；72：1139
13 Mclulley J，Slansky H，Pavan LD，et al.Collagenolytic activity in experimental herpes simplex keratitis .Arch Ophthalmol，1970：84：516
14 Brom SI，Weller C，Akiya S.Pathogenesis of ulcers of the alkali-burned cornea.Arch Ophthalmol，1970；83：205
15 Berman M.Regulation of collagenase：therapeutic considerations.Trans Ophthalmol Soc UK，1978；98：397
, http://www.100md.com
16 Fini ME，Girard MT.Expression of collagenolytic/gelatinolytic metalloproteinases by normal cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990；31：1779
17 Fini ME.Girard MT.The pattern of metalloproteinase expression by corneal fibroblasts is altered by passage in cell culture.J Cell Sci，1990；97：373
18 Brown D，Chwa M，Escobar M，et al.Characterization of the major matrix degrading metalloproteinase of human corneal stroma.Evidence for an enzyme/inhibitor complex.Exp Eye Res，1991；52：5
19 Opbrock A，Kenney MC，Brown D.Charcaterization of a human corneal metalloproteinase inhibitor(TIMP-1).Curr Eye Res，1993；12：877
(1996-11-18收稿，1997-11-04修回), http://www.100md.com
单位：
关键词：
角膜溃疡胶原酶活化与活性氧的相关性研究 摘 要 从动物实验角度对细菌性角膜溃疡氧自由基与活性胶原酶生成关系进行了观察，结果表明：角膜溃疡后组织中氧自由基产生明显的升高，同时活性胶原酶也高。而经抗氧化治疗后，随氧自由基清除的程度，组织中活性胶原酶的生成也不同程度下降，表现氧自由基的产生与活性胶原酶生成呈正相关(r＝0.9956，p＝0.0044)；并通过潜酶活化比较，表明抗氧化治疗后组织中部分潜酶未能活化，说明在体内氧自由基确实参与胶原酶潜酶的活化。
分类号 R772.21
A correlative study of active oxygen and active collagenase in corneal ulceration/Wang Yi…//Ophthalmol CHN.-1998，7(2).-119～122(Department of Ophthalmology，Southwestern Hospital，3rd Military Medical University，Chongqing 400038)
, 百拇医药
This study is to explore the relation between oxygen free radicals and collagenase activation in corneal ulcer.The model of pseudomonas aeruginosa corneal ulcer in rabbits was adopted.The level of malondialdehyde(MDA) and the collagenolytic activity in the cornea were observed after treated with antioxidants.Results showed that both MDA level and collagenolytic activity in the cornea decreased signficantly after treated with antioxidants，and they showed parallel relation(r＝0.9956).The collagenolytic activity of the treated group with SOD+CAT，when APMA was added，was significantly higher than that of the group without APMA.However，the collagenolytic activity of the control with APMA or without APMA had no significant difference. The activation of latent collagenase is closely linked to oxygen free radicals by PMNs generated.
, 百拇医药
Subject terms Cornea ulcer；Collagenase Antioxidants
研究表明，无论是组织细胞或多核白细胞均以潜酶(latent collagenase)形式分泌或释放胶原酶[1，2]。因此，胶原酶被释放后必然有一活化过程，而这一活化机制仍不清楚，迄今对其活化的体外生化研究至少提出了4种可能的机制，即蛋白水解、构型变化、巯基转换以及氧化活化[3-9]，然而这些研究均在体外进行，动物实验研究仍未见报道，本研究从动物实验的角度，采用兔绿脓杆菌性角膜溃疡为模型，观察角膜溃疡活性氧的产生与胶原酶活化的相关性。
1 材料与方法
1.1 动物选择及模型制作
选用大白兔，体重2～2.5kg。全麻后，0.5%的卡因滴双眼三次，用5mm直径角膜环钻于角膜中央钻痕。固定眼球，4号皮试针自上方钻痕缘浅层潜行进入角膜中央，缓慢注射铜绿色假单孢菌悬液50μl(107个/ml)。
, 百拇医药
1.2 分组、治疗及取材
随机分组，每组7只兔。A组：对照组，以0.9%生理盐水滴眼；B组：SOD+CAT混合液滴眼(SOD 1500u/ml，CAT 2000u/ml)；C组：1%茶多酚液滴眼；D组：2.5%维生素C液滴眼，维生素E肌注50mg/只*日.均在模型制作后立即开始治疗，每日滴眼6次，治疗十天后处死动物，各组切取角膜组织。
1.3 组织处理及测定指标
1.3.1 组织处理 取全角膜，剪碎后加入冰冷的0.1MTris—HCl缓冲液(pH7.6，含0.4MNaCl，0.01MCaCl2)0.8ml中，组织匀浆机间断匀浆4次，每次20秒(冰水浴条件下)，4℃，10000rpm，10分钟，取上清液测定各指标及蛋白定量。
1.3.2 测定指标 ①丙二醛(MDA)测定，采用荧光光度法。具体步骤参见文献[10]。②胶原酶活性的测定：利用50%的二恶烷可沉淀未变性的胶原，而不能沉淀变性的胶原为原理，按照Terato K[11]的方法将酶-底物作用后的变性与未变性胶原分离，测定上清中羟脯氨酸的含量，反映上清中存在的被水解的胶原量，也代表了胶原酶的活性。③蛋白质浓度测定：采用Lowry法。
, 百拇医药
2 结果
2.1 抗氧化治疗对丙二醛(MDA)含量及胶原酶活性影响
经不同的抗氧化剂治疗后各组角膜组织中MDA的含量及胶原酶活性均显著低于未治疗组(p<0.05)；MDA含量与胶原酶活性呈正相关，相关系数r＝0.9956，p＝0.0044。各治疗组间，B组与C组间无显著性差异(p>0.05)，而D组的MDA含量及胶原酶活性则均显著高于B、C组(p<0.05)。对照组羟脯氨酸(Hydro-xyproline) 含量在加APMA与未加APMA比较，无明显差异(p>0.05)；而B组加入APMA(4-乙酸氨基苯汞，胶原酶潜酶活化)后羟脯氨酸含量显著高于未加APMA(p<0.05)，但仍显著低于对照组(p<0.05)。(见附表及图1，2)。
附表 抗氧化治疗对MDA含量及胶原酶活性影响
(A)
, 百拇医药
对照组
(B)
SOD+CAT
治疗组
(C)
1%茶多酚
治疗组
(D)
2.5%维C+E
治疗组
MDA(nmol/mg.pro)
羟脯氨酸(μg/mg.pro)
, http://www.100md.com 未加APMA
加APMA
1.285±0.277
23.658±3.818
24.114±3.184
0.696±0.110
11.181±4.145
17.605±2.772
0.763±0.122
12.007±4.670
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0.938±0.110
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17.068±3.149
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*APMA：4-乙酸氨基苯汞，胶原酶潜酶活化
图1 抗氧化治疗对MDA含量及胶原酶活性影响
图2 胶原酶活性与MDA含量相关关系
3 讨论
自从组织胶原酶被发现，它对角膜溃疡性损害所起的重要作用很快就被人们所认识和重视，并发现无论是感染性，化学性，热烧伤性以及自身免疫性角膜溃疡均与胶原酶密切相关[12-15]。而研究表明，无论是组织细胞或多核白细胞均以潜酶(latent collagenase)形式分泌或释放胶原酶。对胶原酶潜酶活化的研究迄今至少提出了四种可能的活化途径，即蛋白水解活化、构型改变活化、巯基转换活化以及氧化活化。由于以往的研究主要在体外进行，因此胶原酶在体内的确切生物学活化过程仍需进一步证实。
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早年对于角膜溃疡胶原酶的研究仅仅局限于能裂解Ⅰ型胶原的Ⅰ型胶原酶，而且在很长一段时期被认为该酶是唯一的一种胶原酶。90年代初，由Fini等[16，17]首先报道了角膜组织能产生明胶酶(gelatinase，即Ⅳ型胶原酶)，并证明，角膜成纤维细胞可产生和分泌四种不同的基质金属蛋白酶(MMPs)，即间质胶原酶(MMP-1)、基质溶素(Stromelyein，MMP-3)、92KD(MMP-9)和72KD(MMP-2)明胶酶。从而表明角膜胶原酶的产生的多样性。近来Brown和Opbroek等的研究[18，19]表明，角膜细胞也产生二种特异的基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)，其中一个为28KD(TIMP-1)，另一个为21KD(TIMP-2)，后者与72KD明胶酶以1∶1形成无活性复合酶。活性氧可以使复合酶骤解而使酶活化，TIMP在基质中起到调节MMP活性的作用。
炎症性疾病时最突出的特征之一是大量多核白细胞(PMN)浸润病区。研究表明，粒细胞吞噬细菌后一方面在膜上NADPH氧化酶的作用下产生O2，继后又生成H2O2和OH，这三种氧的衍生物都有强烈的氧化作用，既有杀菌作用，同时OH又是脂质过氧化的强烈引发剂。另一方面粒细胞还大量释放蛋白水解酶，包括胶原酶。本研究结果表明，通过不同的抗氧化剂治疗细菌性角膜溃疡，角膜组织中MDA含量显著低于对照组，同时胶原酶活性也显著下降。而且各治疗组对MDA的降低程度与对胶原酶活性的抑制作用成平行相关(r＝0.9956，p<0.0044)。并通过加入APMA(胶原酶潜酶活化剂)与未加APMA比较。结果表明，在对照组胶原酶活性无明显变化，说明角膜组织中没有明显的潜酶存在。而在SOD+CAT治疗组则加入APMA后胶原酶活性显著提高，说明经清除氧自由基以后确使部分潜酶未能活化而存在于组织中，表明在体内氧自由基参与了胶原酶潜酶的活化过程。
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本研究从动物实验角度观察了不同抗氧化剂治疗角膜溃疡后MDA的含量(间接反应组织中活性氧的产生)与胶原酶活性的相关性，从而证明了氧化活化确是胶原酶潜酶在体内的一条活化途径。
4 参考文献
1 Gillian M，Peppin G，Ortiz X，et al.Collagenase is a component of the specific granules of human neutriphil leucocytes.Biochem J，1977；162：195
2 Henning BH，Charles MC，Robert ET，et al.Trypsin activation of latent collagenase from several mammalian sources.Scand J Dent Res，1975；83：302
, 百拇医药
3 Berman M，Leary R，Gage J.Evidence for a role of the plasminogen activator-plasmin system in corneal ulceration.Invest Ophthalmol Vis Sci，1980；20：1204
4 Werb Z，Mainardi CL，Vater CA，et al.Endogenous activation of latent collagenase by rheumatoid synovial cells：Evidence for a role of plasminogen activator.New Engl J Med，1977；296：1017
5 Macartney HW，Tschesche H.Latent collagenase from human polymorphonuclear leucocytes and activation to collagenase by removal of an inhibitor.FEBS Lett，1980；119：327
, 百拇医药
6 Herkko S.Kimmo S.Otso L，et al.Activation of latent human neutrophil collagenase by reactive oxygen species and serine proteases.Biochem Biophy Res Commu，1990；173：979
7 Weiss SJ，Peppin G.Ortiz X，et al.Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils.Science，1985；227：747
8 Burkhardt H，Hartmann F，Schwingel ML.Activation of latent collagenase from polymorphonuclear leukocytes by oxygen radicals.Enzyme，1986；36：221
, http://www.100md.com
9 Saari H，Suomalainen K，Lindy O，et al.Activation of latent human neutrophil collagenase by reactive oxygen species and serine proteases.Biochem Biophy Res Commun，1990；171(3)：979
10 Ohkawa H，Ohishi N，Yagi K，et al.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid.Anal Biochem，1979；95：351
11 Terato K，Nagai Y，Kawanishi K，et al.A rapid assay method of collagenase activity using 14C-labeled soluble collagen as substrate.Biochin Biophy Acta，1976；445：753
, 百拇医药
12 Brown SI，Hook CW.Isolation of stromal collagenase in corneal inflamation.Am J Ophthalmol.1971；72：1139
13 Mclulley J，Slansky H，Pavan LD，et al.Collagenolytic activity in experimental herpes simplex keratitis .Arch Ophthalmol，1970：84：516
14 Brom SI，Weller C，Akiya S.Pathogenesis of ulcers of the alkali-burned cornea.Arch Ophthalmol，1970；83：205
15 Berman M.Regulation of collagenase：therapeutic considerations.Trans Ophthalmol Soc UK，1978；98：397
, http://www.100md.com
16 Fini ME，Girard MT.Expression of collagenolytic/gelatinolytic metalloproteinases by normal cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990；31：1779
17 Fini ME.Girard MT.The pattern of metalloproteinase expression by corneal fibroblasts is altered by passage in cell culture.J Cell Sci，1990；97：373
18 Brown D，Chwa M，Escobar M，et al.Characterization of the major matrix degrading metalloproteinase of human corneal stroma.Evidence for an enzyme/inhibitor complex.Exp Eye Res，1991；52：5
19 Opbrock A，Kenney MC，Brown D.Charcaterization of a human corneal metalloproteinase inhibitor(TIMP-1).Curr Eye Res，1993；12：877
(1996-11-18收稿，1997-11-04修回), http://www.100md.com