电磁脉冲辐照后大鼠小脑、海马中一氧化氮合酶的变化
作者：丁桂荣 谢学军 张李燕 郑振兴 周晏 郭鹞
单位：710032 第四军医大学防原医学教研室(丁桂荣、谢学军、张李燕、郭鹞)；西北核技术研究所(郑振光、周晏)
关键词：电磁学；海马/放射效应；小脑/放射效应；一氧化氮/代谢；免疫酶技术
中华物理医学杂志980206 摘 要 目的 拟从观察电磁脉冲(EMP)辐照后大鼠小脑、海马中一氧化氮合酶(NOS)的表达情况，探讨EMP所致大鼠学习、记忆能力改变的可能机制。方法 采用SP免疫组织化学染色检测EMP辐照后大鼠小脑、海马组织中NOS阳性神经元的变化。结果 EMP辐照后1.5、24 h海马中NOS阳性神经元数目较对照组显著下降，且着色变浅，照后48 h NOS阳性神经元数目恢复至对照水平，但着色仍浅。小脑中NOS阳性细胞在照后无明显变化。结论 NOS在EMP所致大鼠学习、记忆功能障碍过程中起一定作用。
, 百拇医药
中图号 R318.03
Changes of Nitric Oxide Synthase in Hippocampus and Cerebellum of the Rat Following Exposure to Electromagnetic Pulse Ding Guirong, Xie Xuejun, Zhang Liyan,et al.Department of Radiation Medicine, Fourth Military Medical University, 710032
Abstract Objective In order to explore the role of nitric oxide in the obstruction of learning and memory of the rat caused by exposing to electromagnetic pulse(EMP),the distribution of nitric oxide synthase(NOS) expression was studied in hippocampus and cerebellum of the rat following exposure to EMP. Methods SP immunohistochemical staining was employed to detect the distribution of NOS expression. Results The number of NOS positive neurons and the intensity of positive staining in hippocampus were decreased at 1.5 and 24h after exposure to EMP. At 48h,the number of NOS positive neurons reversed to control level but the intensity of positive staining was still lower.The expression of NOS in cerebellum had no obvious changes.Conclusion Decrease of NOS expression in hippocampus relates to the obstruction of learning and memory of the rat after exposure to EMP.
, http://www.100md.com
Key words electromagnetics;hippocampus/rad eff;cerebellum/rad eff; nitric oxide/metab; immunoenzyme technics
自1988年Garthwaite等〔1〕提出一氧化氮(NO)可能作为一种信息传递物质在中枢神经系统起作用以来，NO的生理作用引起了神经科学工作者的高度重视。目前发现它可能作为一种逆行信息递质参与海马的长时程突触传递增强(LTP)以及小脑的长时程突触传递抑制(LTD)过程。它还可能参与动物的学习、记忆过程〔2〕。在以往的实验中我们发现，经EMP照射后小鼠的学习、记忆能力发生了改变，为探讨这种改变的可能机制，我们观察了EMP照射后大鼠海马、小脑中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的分布及变化。
材料和方法
一、动物分组及照射
, 百拇医药
雄性Wistar 大鼠20只，由校实验动物中心提供，体重180～200 g,随机分为4组，即对照组和照后1.5，24，48 h组，每组5只动物。EMP全身一次性照射，电场强度40 kV/m ，前沿(Tr )24 ns ，半宽(Th )340 ns 。分别在照射后1.5、 24、 48 h ，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(10 ml/kg)，4%多聚甲醛灌注固定1 h ,取全脑于上述固定液后固定3～4 h，分离出海马及小脑,入15%蔗糖PB(0.1 mol/L,pH7.4 ，4℃)过夜,恒冷切片机切片，片厚32 μm, PBS接片。
二、免疫组织化学染色
参照SP试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)说明进行， nNOS兔抗鼠多克隆抗体为美国Santa Cruze 公司产品，抗体工作浓度为1：50，以PBS代替第一抗体作为阴性对照。DAB呈色，Olympus显微镜下观察。
三、图像分析
, 百拇医药
将各时间点的组织切片任选3张，用图像分析仪(空军总医院生物医学工程所)对海马锥体层和小脑颗粒层细胞进行阳性细胞计数和灰度扫描，统计处理用样本均数t检验，P<0.05表示差异显著。
结 果
一、EMP辐照后海马NOS阳性神经元的变化
NOS样免疫反应产物为棕色，定位于胞浆，胞核周围着色较深，核不着色，光镜下可见NOS阳性神经元主要集中锥体细胞层和齿状回的颗粒层、多形细胞层。经EMP辐照后，NOS阳性神经元明显减少，且着色变浅(图1～3)。计算机图象分析结果为：EMP照后1.5、 24 h大鼠海马NOS阳性神经元较对照组显著减少，灰度值增加，至照后48 h, NOS阳性细胞数恢复至对照水平，但灰度值仍较高(表1、2)。
二、EMP辐照后小脑NOS阳性细胞的变化
, 百拇医药
NOS阳性细胞在小脑分子层、颗粒层、蒲肯野氏细胞层都有分布，但主要集中于颗粒细胞层，为中等程度着色(图4)。经EMP辐照后NOS阳性神经元数目及着色深度无明显变化。图像分析结果亦显示NOS阳性细胞数目及灰度值与对照组无显著差异(表1、2)。
表1 EMP辐照后大鼠海马、小脑NOS阳性神经元数目变化(个/μm2,
±s,n=5) 部位
对照组
照后1.5 h
照后24 h
照后48h
海马
, 百拇医药 34±10
19±3*
16±5*
21±8
小脑
86±15
74±19
67±13
注 与相应对照组相比 *P<0.05表2 EMP辐照后大鼠海马、小脑NOS免疫组织化学染色灰度扫描(±s, n=5) 部位
对照组
, 百拇医药
照后1.5 h
照后24 h
照后48 h
海马
117.1± 2.9
124.6±4.7*
128.7 ±4.5*
128.4 ± 4.8*
小脑
122.6±1.5
119.9±3.7
, 百拇医药
122.8±2.0
注 与相应对照组相比 *P<0.05讨 论
电磁脉冲是一种高能非电离辐射，它的脉冲场频谱很宽，几乎覆盖了电磁波谱的所有频段。生物体在瞬态电磁脉冲作用下，可在细胞膜原有静息电位基础上，产生一个跨膜电压，跨膜电压的大小、持续时间及产生方式会直接影响细胞的各种生物学特性〔3〕。NOS是合成NO的限速酶，NOS有三种 同工酶，它们分别是神经元型NOS(nNOS)、诱生型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)，在神经元存在的主要是nNOS。由于目前尚缺乏直接检测NO含量的方法，故人们通常观察NOS的分布及变化来间接反映NO的生成量。
本实验观察到，经EMP辐照后，大鼠海马NOS阳性神经元数目明显减少，着色变浅，其原因可能是电磁脉冲所致细胞膜跨膜电压的改变影响了NOS的活性，使其弱表达或不表达，从而导致神经元合成NO能力降低。许多研究表明NO与神经元的突触可塑性有关，参与海马的长时程突触传递增强(LTP)，在学习、记忆过程中起逆行信使的作用。将大鼠隔-海马通路损伤或海马插管微量注射NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine, NNLA)，海马中NO含量均下降，并出现学习功能障碍〔4〕。Ingram等〔5〕用NARG阻断NOS的活性，证明NO合成减少可影响大鼠在Stone迷宫中的学习成绩。我们在以往的实验中发现EMP可使动物学习、记忆能力降低，结合本实验结果，我们推测，EMP辐照后动物海马NO合成抑制是导致动物学习、记忆功能改变的原因之一。
, 百拇医药
本研究发现EMP辐照对小脑神经元NOS活性无明显影响，表明小脑内NOS阳性神经元对本实验条件下EMP辐射敏感性较低。Miurau等〔6〕报道，弱的射频电磁场可增加大鼠小脑胞浆提取物中NO的水平。由此可见，不同物理特性的电磁场所引起的生物学效应是不同的。
图1 正常对照组大鼠海马锥体层NOS阳性神经元分布
图2 EMP辐照后1.5h大鼠海马锥体层NOS阳性神经元数目减少，着色变浅
图3 EMP辐照后48h大鼠海马锥体层NOS阳性神经元数目恢复至对照水平，但着色仍浅
图4 正常对照组大鼠小脑NOS阳性神经元分布
参考文献
, http://www.100md.com
1 Garthwaite J ,Charles SL, Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intracellular messenger in the brain. Nature, 1988,336:385-388.
2 钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海医科大学出版社,1996. 60-63.
3 王保义，杨杰斌，郭庆功,等.毫微秒电磁脉冲的生物学效应实验研究和机理分析.中国科学(C辑),1997,27(1)：35-39.
4 王景华，杨贵贞.一氧化氮对大鼠学习功能的影响.中国神经免疫学和神经病学杂志 ,1997, 4(1)：11-15.
, 百拇医药
5 Ingram DK ,Spangler EL, Iijima S, et al. New pharmacological strategies for cognitive enhancement using a rat model of age-related memory impairment. Ann NY Acad Sci, 1994,717:16-32.
6 Miura M,Takayama K, Okada J. Increase in nitric oxide and cyclic GMP of rat cerebellum radio frequency burst-type electromagnetic radiation. J Physiol, 1993,461:513-524.
(收稿 1998-02-03 修回 1998-04-20), 百拇医药
单位：710032 第四军医大学防原医学教研室(丁桂荣、谢学军、张李燕、郭鹞)；西北核技术研究所(郑振光、周晏)
关键词：电磁学；海马/放射效应；小脑/放射效应；一氧化氮/代谢；免疫酶技术
中华物理医学杂志980206 摘 要 目的 拟从观察电磁脉冲(EMP)辐照后大鼠小脑、海马中一氧化氮合酶(NOS)的表达情况，探讨EMP所致大鼠学习、记忆能力改变的可能机制。方法 采用SP免疫组织化学染色检测EMP辐照后大鼠小脑、海马组织中NOS阳性神经元的变化。结果 EMP辐照后1.5、24 h海马中NOS阳性神经元数目较对照组显著下降，且着色变浅，照后48 h NOS阳性神经元数目恢复至对照水平，但着色仍浅。小脑中NOS阳性细胞在照后无明显变化。结论 NOS在EMP所致大鼠学习、记忆功能障碍过程中起一定作用。
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中图号 R318.03
Changes of Nitric Oxide Synthase in Hippocampus and Cerebellum of the Rat Following Exposure to Electromagnetic Pulse Ding Guirong, Xie Xuejun, Zhang Liyan,et al.Department of Radiation Medicine, Fourth Military Medical University, 710032
Abstract Objective In order to explore the role of nitric oxide in the obstruction of learning and memory of the rat caused by exposing to electromagnetic pulse(EMP),the distribution of nitric oxide synthase(NOS) expression was studied in hippocampus and cerebellum of the rat following exposure to EMP. Methods SP immunohistochemical staining was employed to detect the distribution of NOS expression. Results The number of NOS positive neurons and the intensity of positive staining in hippocampus were decreased at 1.5 and 24h after exposure to EMP. At 48h,the number of NOS positive neurons reversed to control level but the intensity of positive staining was still lower.The expression of NOS in cerebellum had no obvious changes.Conclusion Decrease of NOS expression in hippocampus relates to the obstruction of learning and memory of the rat after exposure to EMP.
, http://www.100md.com
Key words electromagnetics;hippocampus/rad eff;cerebellum/rad eff; nitric oxide/metab; immunoenzyme technics
自1988年Garthwaite等〔1〕提出一氧化氮(NO)可能作为一种信息传递物质在中枢神经系统起作用以来，NO的生理作用引起了神经科学工作者的高度重视。目前发现它可能作为一种逆行信息递质参与海马的长时程突触传递增强(LTP)以及小脑的长时程突触传递抑制(LTD)过程。它还可能参与动物的学习、记忆过程〔2〕。在以往的实验中我们发现，经EMP照射后小鼠的学习、记忆能力发生了改变，为探讨这种改变的可能机制，我们观察了EMP照射后大鼠海马、小脑中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的分布及变化。
材料和方法
一、动物分组及照射
, 百拇医药
雄性Wistar 大鼠20只，由校实验动物中心提供，体重180～200 g,随机分为4组，即对照组和照后1.5，24，48 h组，每组5只动物。EMP全身一次性照射，电场强度40 kV/m ，前沿(Tr )24 ns ，半宽(Th )340 ns 。分别在照射后1.5、 24、 48 h ，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(10 ml/kg)，4%多聚甲醛灌注固定1 h ,取全脑于上述固定液后固定3～4 h，分离出海马及小脑,入15%蔗糖PB(0.1 mol/L,pH7.4 ，4℃)过夜,恒冷切片机切片，片厚32 μm, PBS接片。
二、免疫组织化学染色
参照SP试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)说明进行， nNOS兔抗鼠多克隆抗体为美国Santa Cruze 公司产品，抗体工作浓度为1：50，以PBS代替第一抗体作为阴性对照。DAB呈色，Olympus显微镜下观察。
三、图像分析
, 百拇医药
将各时间点的组织切片任选3张，用图像分析仪(空军总医院生物医学工程所)对海马锥体层和小脑颗粒层细胞进行阳性细胞计数和灰度扫描，统计处理用样本均数t检验，P<0.05表示差异显著。
结 果
一、EMP辐照后海马NOS阳性神经元的变化
NOS样免疫反应产物为棕色，定位于胞浆，胞核周围着色较深，核不着色，光镜下可见NOS阳性神经元主要集中锥体细胞层和齿状回的颗粒层、多形细胞层。经EMP辐照后，NOS阳性神经元明显减少，且着色变浅(图1～3)。计算机图象分析结果为：EMP照后1.5、 24 h大鼠海马NOS阳性神经元较对照组显著减少，灰度值增加，至照后48 h, NOS阳性细胞数恢复至对照水平，但灰度值仍较高(表1、2)。
二、EMP辐照后小脑NOS阳性细胞的变化
, 百拇医药
NOS阳性细胞在小脑分子层、颗粒层、蒲肯野氏细胞层都有分布，但主要集中于颗粒细胞层，为中等程度着色(图4)。经EMP辐照后NOS阳性神经元数目及着色深度无明显变化。图像分析结果亦显示NOS阳性细胞数目及灰度值与对照组无显著差异(表1、2)。
表1 EMP辐照后大鼠海马、小脑NOS阳性神经元数目变化(个/μm2,
±s,n=5) 部位对照组
照后1.5 h
照后24 h
照后48h
海马
, 百拇医药 34±10
19±3*
16±5*
21±8
小脑
86±15
74±19
67±13
注 与相应对照组相比 *P<0.05表2 EMP辐照后大鼠海马、小脑NOS免疫组织化学染色灰度扫描(
±s, n=5) 部位对照组
, 百拇医药
照后1.5 h
照后24 h
照后48 h
海马
117.1± 2.9
124.6±4.7*
128.7 ±4.5*
128.4 ± 4.8*
小脑
122.6±1.5
119.9±3.7
, 百拇医药
122.8±2.0
注 与相应对照组相比 *P<0.05讨 论
电磁脉冲是一种高能非电离辐射，它的脉冲场频谱很宽，几乎覆盖了电磁波谱的所有频段。生物体在瞬态电磁脉冲作用下，可在细胞膜原有静息电位基础上，产生一个跨膜电压，跨膜电压的大小、持续时间及产生方式会直接影响细胞的各种生物学特性〔3〕。NOS是合成NO的限速酶，NOS有三种 同工酶，它们分别是神经元型NOS(nNOS)、诱生型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)，在神经元存在的主要是nNOS。由于目前尚缺乏直接检测NO含量的方法，故人们通常观察NOS的分布及变化来间接反映NO的生成量。
本实验观察到，经EMP辐照后，大鼠海马NOS阳性神经元数目明显减少，着色变浅，其原因可能是电磁脉冲所致细胞膜跨膜电压的改变影响了NOS的活性，使其弱表达或不表达，从而导致神经元合成NO能力降低。许多研究表明NO与神经元的突触可塑性有关，参与海马的长时程突触传递增强(LTP)，在学习、记忆过程中起逆行信使的作用。将大鼠隔-海马通路损伤或海马插管微量注射NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine, NNLA)，海马中NO含量均下降，并出现学习功能障碍〔4〕。Ingram等〔5〕用NARG阻断NOS的活性，证明NO合成减少可影响大鼠在Stone迷宫中的学习成绩。我们在以往的实验中发现EMP可使动物学习、记忆能力降低，结合本实验结果，我们推测，EMP辐照后动物海马NO合成抑制是导致动物学习、记忆功能改变的原因之一。
, 百拇医药
本研究发现EMP辐照对小脑神经元NOS活性无明显影响，表明小脑内NOS阳性神经元对本实验条件下EMP辐射敏感性较低。Miurau等〔6〕报道，弱的射频电磁场可增加大鼠小脑胞浆提取物中NO的水平。由此可见，不同物理特性的电磁场所引起的生物学效应是不同的。
图1 正常对照组大鼠海马锥体层NOS阳性神经元分布
图2 EMP辐照后1.5h大鼠海马锥体层NOS阳性神经元数目减少，着色变浅
图3 EMP辐照后48h大鼠海马锥体层NOS阳性神经元数目恢复至对照水平，但着色仍浅
图4 正常对照组大鼠小脑NOS阳性神经元分布
参考文献
, http://www.100md.com
1 Garthwaite J ,Charles SL, Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intracellular messenger in the brain. Nature, 1988,336:385-388.
2 钟慈声，孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海医科大学出版社,1996. 60-63.
3 王保义，杨杰斌，郭庆功,等.毫微秒电磁脉冲的生物学效应实验研究和机理分析.中国科学(C辑),1997,27(1)：35-39.
4 王景华，杨贵贞.一氧化氮对大鼠学习功能的影响.中国神经免疫学和神经病学杂志 ,1997, 4(1)：11-15.
, 百拇医药
5 Ingram DK ,Spangler EL, Iijima S, et al. New pharmacological strategies for cognitive enhancement using a rat model of age-related memory impairment. Ann NY Acad Sci, 1994,717:16-32.
6 Miura M,Takayama K, Okada J. Increase in nitric oxide and cyclic GMP of rat cerebellum radio frequency burst-type electromagnetic radiation. J Physiol, 1993,461:513-524.
(收稿 1998-02-03 修回 1998-04-20), 百拇医药