低强度He-Ne激光照射对离体小鼠巨噬细胞Ca2+浓度的影响
作者：胡庆沈 刘炳荣 江兰英
单位：
关键词：He-Ne激光；Ca2+；巨噬细胞；荧光强度；Fluo-3乙酰甲脂
中国激光医学杂志/980204Effect of Low Power Helium-Neon Laser Irradiation in vitro on
Intracellular Calcium Concentration in Mouse Macrophages
Hu Qingshen, Liu Bingrong, Jiang Lanying
Department of Biophysics, Shanghai Second Medical University, Shanghai(200025)
, 百拇医药
摘要 为研究低强度He-Ne激光照射对离体小鼠巨噬细胞内Ca2+浓度的影响以及其与能量密度(剂量)的关系，用Fluo-3乙酰甲脂对巨噬细胞Ca2+作荧光标记，应用图象分析系统检测激光照射后细胞内Ca2+的荧光强度变化。结果：He-Ne激光照射引起细胞内Ca2+浓度改变。照射5 min，激光剂量为0.679 J/cm2，细胞荧光强度出现非常明显的增强；照射10 min，剂量为1.358 J/cm2，细胞荧光强度增强达到最大值；照射15 min，剂量为2.037 J/cm2，细胞荧光强度减弱；照射20 min，剂量为2.716 J/cm2，细胞荧光强度降低至对照组之下。低强度He-Ne激光照射巨噬细胞可引起细胞内Ca2+浓度上升，产生细胞内信号传递，进而控制细胞功能。这可作为临床上应用低强度激光照射治疗的参考。
ABSTRACT
, 百拇医药
The purpose of this study is to investigate the relation of He-Ne laser irradiation and its energy intensity and the intracellular calcium concentration in mouse macrophages. The intracellular calcium was labeled with Fluo-3 AM and the fluorescence intensity of the macrophages after laser irradiatiion in vitro was determined by a VIDAS image analysis system. Changes of the intracellular Ca2+ concentrations were revealed after He-Ne laser irradiation. The cellular fluorescence intensity increased obviously after 5 minutes irradiation with a light dose of 0.679 J/cm2. The maximum value of the cellular fluorescence intensity was observed after 10 minutes laser irradiation with a light dose of 1.358 J/cm2. A decreasement of the cellular fluorescence intensity occurred at 15 minutes irradiation with a light dose of 2.037 J/cm2, and the intracellular fluorescence in-tensity was lower than that of control group after 20 minutes laser irradiation with a light dose of 2.716
, http://www.100md.com
J/cm2. The rise of the intracellular Ca2+ concentration in macrophages induced by low power He-Ne laser irradiation may affect the intracellular signal transmission, controlling the cellular function. Our findings may provide certain evidence in explanation of the mechanisms of clinical He-Ne laser therapy.
Key words He-Ne laser, Ca2+, Macrophages, Fluorescence intensity, Fluo-3 AM
过热(45℃)作用引起细胞内自由钙[Ca2+]i的变化，显示热杀伤效应。Stevenson等[1]对CHO细胞加热至45℃，4 min，细胞内Ca2+上升，到30 min时，达到最大值。Mikkelsen[2]等对人肠癌HT-29细胞过热(44℃)处理，也发现细胞内Ca2+增加。Joseph等[3]对小鼠NIH3T3细胞过热(45.5℃)处理，在1 min内[Ca2+]i迅速增加。热作用是物理因素，同是物理因素的激光照射生物细胞引起细胞内Ca2+上升[4]，细胞内Ca2+的变化与激光照射功率密度和照射时间是否有直接关系，我们利用He-Ne激光照射离体鼠腹腔巨噬细胞，观察激光照射对巨噬细胞内Ca2+的影响。
, 百拇医药
一、材料与方法
(一)细胞培养：ICR种小白鼠(中国科学院动物研究所引种)24只，均系雄性，体重20 g～25 g。每次实验取8只，颈椎脱臼法处死小鼠。在无菌条件下，于腹腔内注射DMEM液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，美国GIBCO BRL公司产)5ml，轻轻震荡小鼠，吸取腹腔液，放在冰浴上保存。鼠腹腔液经离心(1 500 r/min, 5 min)，弃上清液。在净化室内操作，沉淀物用pH7.2的DMEM液(含血清10%)再悬浮，调整细胞浓度为(1～1.5)×106个/ml，放在带盖玻片的培养皿内，每皿2 ml细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱内培养26 h～28 h。
(二)细胞Ca2+荧光染色：Ca2+荧光探针为Fluo-3 AM(AM为乙酰甲脂，SIGMA公司生产)。先配制成贮备液：将0.225 98 mg的Fluo-3 AM溶于20 ml二甲基亚砜中。荧光染料工作液于使用当日现配制，用IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, SIGMA公司生产)配制成2 μmol/L工作液12 ml，加非离子低毒性去污剂pluronic F-127(20%, W/V, 溶于二甲基亚砜)1 μl～2 μl，充分混和。从培养箱内取出培养皿，去盖，用IMDM漂洗二次，以洗去细胞培养液DMEM，立刻在每个培养皿内加入2 ml
, 百拇医药
Fluo-3 AM工作液，在37℃水浴箱内作荧光染色30 min。
(三)激光照射：He-Ne激光器输出功率18.2 mW，波长632.8 nm，经光纤传输至照射部位，光斑直径32 mm。照射组分为5 min、10 min、15 min和20 min四组，激光照射剂量(能量密度)分别为0.679 J/cm2、1.358 J/cm2、2.037 J/cm2和2.716 J/cm2。对照组在相同环境下进行荧光染色，不照射激光。共用两个培养皿：一个在实验前，另一个在实验后。实施荧光染色和照射激光均在同一时间段，保证实验条件一致。照射激光后，用IMDM冲洗培养皿三次，洗去剩余的荧光染料，取出盖玻片，倒扣在载玻片上，立刻作荧光检测。
(四)Ca2+荧光强度测试：He-Ne激光照射后，即刻检测巨噬细胞荧光强度。本实验所用仪器设备为UMSP型显微分光光度计(Microspectrophotometer)、相差增强型摄象管(Analog contrast enhancement，ACE)和全自动图象分析系统(Video image digital analysis system，VIDAS)，均为德国ZEISS公司产品。经Fluo-3 AM标记的细胞样品，置于UMSP型显微分光光度计的扫描载物台上，在透射光照明条件下，根据样品的离散程度，随机选取10～15个视野，计算机存储各视野的坐标位置。随后在40倍物镜成象条件下，逐个搜索各个视野，并调焦清晰。用波长488 nm的激发光照射样品，观察不同剂量激光照射后巨噬细胞内Ca2+荧光图象。Ca2+荧光图象通过ACE输入到VIDAS。ACE的分辨率为930线，可通过控制面板设定亮度、对比度和伽玛系数等输入条件，确保各图象在同等条件下输入的一致性和可比性。VIDAS采集荧光图象后，进行阴影校正，改善由成象系统造成的照明误差。然后作Sigma滤波和直方图均衡处理，使原始图象得到增强。根据图象中荧光强度的阈值，对图象进行二值化分割，再对二值图作腐蚀、清除碎片等画面整理。经图象模式识别后，对选取的细胞进行细胞面积、平均荧光强度和Ca2+总荧光强度测试，每个测试样品不少于100只细胞。由于Ca2+荧光强度较弱，本底荧光强度对Ca2+荧光强度的测试有很大影响。在所测细胞样品周围选取四个空白区域，测定其相应灰度值，取平均值作为本底荧光值，对细胞Ca2+荧光强度进行校正，得到满意的结果。
, http://www.100md.com
二、结果
He-Ne激光照射小鼠巨噬细胞后，发现细胞内Ca2+浓度发生变化。当激光照射5 min，光剂量为0.679 J/cm2时，细胞荧光强度出现明显的增强，约相当于对照组的1.3倍。照射10 min，光剂量为1.358 J/cm2，细胞荧光强度出现更明显的增强，为对照组的2.6倍，而且标准差几乎是对照组的1倍(附表)。照射15 min，光剂量为2.037 J/cm2，细胞荧光强度开始减弱，为对照组的1.2倍，但仍有非常显著增加。照射20 min，光剂量为2.716 J/cm2时，细胞荧光强度与对照组比较，明显降低，约为0.9倍。将4个实验组结果连成曲线构成一个峰，其峰顶在激光剂量为1.358 J/cm2处(附图)。
三、讨论
附表 He-Ne激光照射离体小鼠巨噬细胞细胞内Ca2+水平的改变(±s)
, 百拇医药
Tab. Calcium levels in the mouse macrophages induced by He-Ne laser irradiation in vitro(±s)
对照组
Control
照射组 He-Ne laser irradiated
光剂量 Dose (J/cm2)
0.679
1.358
2.037
2.716
细胞数 Number of cells
, 百拇医药
105
102
108
102
102
面积 Area
100.42±21.12
107.41±14.19
108.93±25.53
119.61±24.29
111.62±14.19
灰度 Grey
, http://www.100md.com
5.33±1.44
6.89±0.98
13.38±1.38
5.78±2.89
4.40±1.60
荧光强度 Flu. density
55.894±20.107
74.535±16.760
146.416±39.782
68.292±36.063
49.475±20.612
, 百拇医药
t值 t value
—
7.254
21.044
3.043
2.267
P值 P value
—
<0.01
<0.01
<0.01
<0.05
, http://www.100md.com
附图 不同剂量He-Ne激光照射小鼠巨噬细胞Ca2+荧光强度变化 ———面积，……灰度，------荧光强度
Fig. The curve of mouse macroghage intracellular Ca2+ concentration induced by He-Ne laser irradiation in vitro occurred at various laser power intensity ———Area, ……Grey, ------Fluorescence density
荧光图象强度一般较弱，因此对荧光图象的输入有较高的要求。ACE具有高灵敏度和高分辨率，可以满足输图条件。计算机数字图象处理通常把图象亮度转换成256个灰度等级，但荧光强度和灰度间的转换并非恒定，不同的外界条件能得到不同的结果。ACE具有操作面板控制功能，可以根据外界照明和电网的条件变化锁定输入条件。另外，我们采用标准铀玻璃块作为荧光转换的参考标准，确保所有图象输入条件一致。由于Ca2+荧光强度较弱，样品本底荧光强度相对较强，这对Ca2+荧光强度的测试有很大的影响。选取样品周边四个空白区域，测定相应灰度，取平均值作为本底荧光值，对每个细胞荧光光强逐点进行校正，得到满意的结果。
, 百拇医药
关于高温作用对细胞内Ca2+的影响，有些学者曾经作了较详细的研究，而对激光在这方面的作用研究比较少。Karu等[4]用He-Ne激光(剂量56 J/m2)照射人淋巴细胞，发现照射后2 min，细胞内[Ca2+]i显著增加，为对照组的2～3倍，并与用植物凝集素(PHA)刺激引起的结果相似。本实验结果表明，He-Ne激光照射5 min(光剂量0.679
J/cm2)，细胞荧光强度明显增强，约为对照组的1.3倍；照射10 min(光剂量1.358
J/cm2)，细胞荧光强度出现更明显的变化，约为对照组的2.6倍，达到顶峰；以后细胞荧光强度开始下降，照射20 min，细胞荧光强度明显减弱。表明细胞内Ca2+水平先升高到达顶峰后，又出现降低的过程。本实验与前者的结果类似，只是Karu等用的激光光剂量比本实验小得多，产生细胞效应的时间也较短。
, http://www.100md.com
Joseph等[3]用高温引起鼠NIH3T3细胞内[Ca2+]i增加，显示细胞的高温杀伤效应。耐热和不耐热的细胞，当加热到45.5℃时，引起细胞内[Ca2+]i迅速(1 min)增加；继续加热，细胞内[Ca2+]i可相对地稳定维持达25 min之久。本实验以激光作用持续照射15 min，细胞荧光强度比对照组仍有明显增强，表明细胞内[Ca2+]i仍维持在高水平。激光也是物理因素，对细胞内[Ca2+]i浓度的影响，亦可持续一定时间。可能激光对个别细胞内[Ca2+]i浓度的影响是短暂的，但对细胞群体的作用会有先后差别，总体上表现为持续较长时间。
外界刺激对细胞功能的影响，细胞内[Ca2+]i浓度瞬时的空间分布增加对其内信号传导是重要因素，而1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)对细胞内Ca2+库释放起着关键作用[5]，IP3引起Ca2+释放的固有特性，预期细胞内Ca2+释放是突然的局限性的上升[6]。Breugel等[7]用波长为830 nm的激光照射Schwann细胞，激光照射调控细胞效应，细胞外Ca2+不是必需的，但是引起光生物调控作用，出现细胞内Ca2+的重新分布。细胞内Ca2+的信使作用途径非常复杂，它处于细胞信使传递途径的中心位置，直接和间接调控许多细胞效应。激光照射引起细胞内Ca2+浓度短暂升高，可能使细胞产生一系列的酶促反应，从而引起相关生理反应，这可能是以低强度激光特别是波长为632.8 nm的He-Ne激光作照射治疗取得理想疗效的原因。
, 百拇医药
参考文献
1.Stevenson MA, Calderwood SK, Hahn GM, et al. Effect of hyperthermia(45 degrees C) on calcium flux in Chinese hamster ovary HA-1 fibroblasts and its potential role in cytotoxicity and heat resistance. Cancer Res, 1987, 47：3712.
2.Mikkelsen RB, Reinlib L, Donowitz M, et al. Hyperthermia effects on cytosolic [Ca2+]i analysis at the single cell level by digitized imaging microscopy and cell survival. Cancer Res, 1991, 51：359.
, http://www.100md.com
3.Joseph RD, William CH, William CD. Changes in intracellular free calcium during hyperthermia: effects of local anesthetics and induction of thermotolerance. Cytometry, 1993, 14：223.
4.Karu T, Smolyanninova N, Zelenin A. Long-term and short-term responses of human lymphocytes to He-Ne laser radiation. Lasers Life Sci, 1991, 4：167.
5.Berridge MJ, Irvine RF. Inositol phosphates and cell signalling. Nature, 1989, 341:197.
, 百拇医药
6.Masamitsu Lino, Makoto Endo. Calcium-dependent immediate feedback control of inositol 1, 4, 5-trisphosphate induced Ca2+ release. Nature, 1992, 360：76.
7.Breugel van HHFI, Engels C, Bar PR. Laser induced photobiomodulation of rat Schwann cells in vitro is not dependent on extracellular calcium. American Society for Laser Medicine and Surgery Abstracts, in Lasers Surg Med, 1993, 5：9., http://www.100md.com
单位：
关键词：He-Ne激光；Ca2+；巨噬细胞；荧光强度；Fluo-3乙酰甲脂
中国激光医学杂志/980204Effect of Low Power Helium-Neon Laser Irradiation in vitro on
Intracellular Calcium Concentration in Mouse Macrophages
Hu Qingshen, Liu Bingrong, Jiang Lanying
Department of Biophysics, Shanghai Second Medical University, Shanghai(200025)
, 百拇医药
摘要 为研究低强度He-Ne激光照射对离体小鼠巨噬细胞内Ca2+浓度的影响以及其与能量密度(剂量)的关系，用Fluo-3乙酰甲脂对巨噬细胞Ca2+作荧光标记，应用图象分析系统检测激光照射后细胞内Ca2+的荧光强度变化。结果：He-Ne激光照射引起细胞内Ca2+浓度改变。照射5 min，激光剂量为0.679 J/cm2，细胞荧光强度出现非常明显的增强；照射10 min，剂量为1.358 J/cm2，细胞荧光强度增强达到最大值；照射15 min，剂量为2.037 J/cm2，细胞荧光强度减弱；照射20 min，剂量为2.716 J/cm2，细胞荧光强度降低至对照组之下。低强度He-Ne激光照射巨噬细胞可引起细胞内Ca2+浓度上升，产生细胞内信号传递，进而控制细胞功能。这可作为临床上应用低强度激光照射治疗的参考。
ABSTRACT
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The purpose of this study is to investigate the relation of He-Ne laser irradiation and its energy intensity and the intracellular calcium concentration in mouse macrophages. The intracellular calcium was labeled with Fluo-3 AM and the fluorescence intensity of the macrophages after laser irradiatiion in vitro was determined by a VIDAS image analysis system. Changes of the intracellular Ca2+ concentrations were revealed after He-Ne laser irradiation. The cellular fluorescence intensity increased obviously after 5 minutes irradiation with a light dose of 0.679 J/cm2. The maximum value of the cellular fluorescence intensity was observed after 10 minutes laser irradiation with a light dose of 1.358 J/cm2. A decreasement of the cellular fluorescence intensity occurred at 15 minutes irradiation with a light dose of 2.037 J/cm2, and the intracellular fluorescence in-tensity was lower than that of control group after 20 minutes laser irradiation with a light dose of 2.716
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J/cm2. The rise of the intracellular Ca2+ concentration in macrophages induced by low power He-Ne laser irradiation may affect the intracellular signal transmission, controlling the cellular function. Our findings may provide certain evidence in explanation of the mechanisms of clinical He-Ne laser therapy.
Key words He-Ne laser, Ca2+, Macrophages, Fluorescence intensity, Fluo-3 AM
过热(45℃)作用引起细胞内自由钙[Ca2+]i的变化，显示热杀伤效应。Stevenson等[1]对CHO细胞加热至45℃，4 min，细胞内Ca2+上升，到30 min时，达到最大值。Mikkelsen[2]等对人肠癌HT-29细胞过热(44℃)处理，也发现细胞内Ca2+增加。Joseph等[3]对小鼠NIH3T3细胞过热(45.5℃)处理，在1 min内[Ca2+]i迅速增加。热作用是物理因素，同是物理因素的激光照射生物细胞引起细胞内Ca2+上升[4]，细胞内Ca2+的变化与激光照射功率密度和照射时间是否有直接关系，我们利用He-Ne激光照射离体鼠腹腔巨噬细胞，观察激光照射对巨噬细胞内Ca2+的影响。
, 百拇医药
一、材料与方法
(一)细胞培养：ICR种小白鼠(中国科学院动物研究所引种)24只，均系雄性，体重20 g～25 g。每次实验取8只，颈椎脱臼法处死小鼠。在无菌条件下，于腹腔内注射DMEM液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，美国GIBCO BRL公司产)5ml，轻轻震荡小鼠，吸取腹腔液，放在冰浴上保存。鼠腹腔液经离心(1 500 r/min, 5 min)，弃上清液。在净化室内操作，沉淀物用pH7.2的DMEM液(含血清10%)再悬浮，调整细胞浓度为(1～1.5)×106个/ml，放在带盖玻片的培养皿内，每皿2 ml细胞悬液，置于37℃、5%CO2培养箱内培养26 h～28 h。
(二)细胞Ca2+荧光染色：Ca2+荧光探针为Fluo-3 AM(AM为乙酰甲脂，SIGMA公司生产)。先配制成贮备液：将0.225 98 mg的Fluo-3 AM溶于20 ml二甲基亚砜中。荧光染料工作液于使用当日现配制，用IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, SIGMA公司生产)配制成2 μmol/L工作液12 ml，加非离子低毒性去污剂pluronic F-127(20%, W/V, 溶于二甲基亚砜)1 μl～2 μl，充分混和。从培养箱内取出培养皿，去盖，用IMDM漂洗二次，以洗去细胞培养液DMEM，立刻在每个培养皿内加入2 ml
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Fluo-3 AM工作液，在37℃水浴箱内作荧光染色30 min。
(三)激光照射：He-Ne激光器输出功率18.2 mW，波长632.8 nm，经光纤传输至照射部位，光斑直径32 mm。照射组分为5 min、10 min、15 min和20 min四组，激光照射剂量(能量密度)分别为0.679 J/cm2、1.358 J/cm2、2.037 J/cm2和2.716 J/cm2。对照组在相同环境下进行荧光染色，不照射激光。共用两个培养皿：一个在实验前，另一个在实验后。实施荧光染色和照射激光均在同一时间段，保证实验条件一致。照射激光后，用IMDM冲洗培养皿三次，洗去剩余的荧光染料，取出盖玻片，倒扣在载玻片上，立刻作荧光检测。
(四)Ca2+荧光强度测试：He-Ne激光照射后，即刻检测巨噬细胞荧光强度。本实验所用仪器设备为UMSP型显微分光光度计(Microspectrophotometer)、相差增强型摄象管(Analog contrast enhancement，ACE)和全自动图象分析系统(Video image digital analysis system，VIDAS)，均为德国ZEISS公司产品。经Fluo-3 AM标记的细胞样品，置于UMSP型显微分光光度计的扫描载物台上，在透射光照明条件下，根据样品的离散程度，随机选取10～15个视野，计算机存储各视野的坐标位置。随后在40倍物镜成象条件下，逐个搜索各个视野，并调焦清晰。用波长488 nm的激发光照射样品，观察不同剂量激光照射后巨噬细胞内Ca2+荧光图象。Ca2+荧光图象通过ACE输入到VIDAS。ACE的分辨率为930线，可通过控制面板设定亮度、对比度和伽玛系数等输入条件，确保各图象在同等条件下输入的一致性和可比性。VIDAS采集荧光图象后，进行阴影校正，改善由成象系统造成的照明误差。然后作Sigma滤波和直方图均衡处理，使原始图象得到增强。根据图象中荧光强度的阈值，对图象进行二值化分割，再对二值图作腐蚀、清除碎片等画面整理。经图象模式识别后，对选取的细胞进行细胞面积、平均荧光强度和Ca2+总荧光强度测试，每个测试样品不少于100只细胞。由于Ca2+荧光强度较弱，本底荧光强度对Ca2+荧光强度的测试有很大影响。在所测细胞样品周围选取四个空白区域，测定其相应灰度值，取平均值作为本底荧光值，对细胞Ca2+荧光强度进行校正，得到满意的结果。
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二、结果
He-Ne激光照射小鼠巨噬细胞后，发现细胞内Ca2+浓度发生变化。当激光照射5 min，光剂量为0.679 J/cm2时，细胞荧光强度出现明显的增强，约相当于对照组的1.3倍。照射10 min，光剂量为1.358 J/cm2，细胞荧光强度出现更明显的增强，为对照组的2.6倍，而且标准差几乎是对照组的1倍(附表)。照射15 min，光剂量为2.037 J/cm2，细胞荧光强度开始减弱，为对照组的1.2倍，但仍有非常显著增加。照射20 min，光剂量为2.716 J/cm2时，细胞荧光强度与对照组比较，明显降低，约为0.9倍。将4个实验组结果连成曲线构成一个峰，其峰顶在激光剂量为1.358 J/cm2处(附图)。
三、讨论
附表 He-Ne激光照射离体小鼠巨噬细胞细胞内Ca2+水平的改变(±s)
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Tab. Calcium levels in the mouse macrophages induced by He-Ne laser irradiation in vitro(±s)
对照组
Control
照射组 He-Ne laser irradiated
光剂量 Dose (J/cm2)
0.679
1.358
2.037
2.716
细胞数 Number of cells
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105
102
108
102
102
面积 Area
100.42±21.12
107.41±14.19
108.93±25.53
119.61±24.29
111.62±14.19
灰度 Grey
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5.33±1.44
6.89±0.98
13.38±1.38
5.78±2.89
4.40±1.60
荧光强度 Flu. density
55.894±20.107
74.535±16.760
146.416±39.782
68.292±36.063
49.475±20.612
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t值 t value
—
7.254
21.044
3.043
2.267
P值 P value
—
<0.01
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<0.01
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附图 不同剂量He-Ne激光照射小鼠巨噬细胞Ca2+荧光强度变化 ———面积，……灰度，------荧光强度
Fig. The curve of mouse macroghage intracellular Ca2+ concentration induced by He-Ne laser irradiation in vitro occurred at various laser power intensity ———Area, ……Grey, ------Fluorescence density
荧光图象强度一般较弱，因此对荧光图象的输入有较高的要求。ACE具有高灵敏度和高分辨率，可以满足输图条件。计算机数字图象处理通常把图象亮度转换成256个灰度等级，但荧光强度和灰度间的转换并非恒定，不同的外界条件能得到不同的结果。ACE具有操作面板控制功能，可以根据外界照明和电网的条件变化锁定输入条件。另外，我们采用标准铀玻璃块作为荧光转换的参考标准，确保所有图象输入条件一致。由于Ca2+荧光强度较弱，样品本底荧光强度相对较强，这对Ca2+荧光强度的测试有很大的影响。选取样品周边四个空白区域，测定相应灰度，取平均值作为本底荧光值，对每个细胞荧光光强逐点进行校正，得到满意的结果。
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关于高温作用对细胞内Ca2+的影响，有些学者曾经作了较详细的研究，而对激光在这方面的作用研究比较少。Karu等[4]用He-Ne激光(剂量56 J/m2)照射人淋巴细胞，发现照射后2 min，细胞内[Ca2+]i显著增加，为对照组的2～3倍，并与用植物凝集素(PHA)刺激引起的结果相似。本实验结果表明，He-Ne激光照射5 min(光剂量0.679
J/cm2)，细胞荧光强度明显增强，约为对照组的1.3倍；照射10 min(光剂量1.358
J/cm2)，细胞荧光强度出现更明显的变化，约为对照组的2.6倍，达到顶峰；以后细胞荧光强度开始下降，照射20 min，细胞荧光强度明显减弱。表明细胞内Ca2+水平先升高到达顶峰后，又出现降低的过程。本实验与前者的结果类似，只是Karu等用的激光光剂量比本实验小得多，产生细胞效应的时间也较短。
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Joseph等[3]用高温引起鼠NIH3T3细胞内[Ca2+]i增加，显示细胞的高温杀伤效应。耐热和不耐热的细胞，当加热到45.5℃时，引起细胞内[Ca2+]i迅速(1 min)增加；继续加热，细胞内[Ca2+]i可相对地稳定维持达25 min之久。本实验以激光作用持续照射15 min，细胞荧光强度比对照组仍有明显增强，表明细胞内[Ca2+]i仍维持在高水平。激光也是物理因素，对细胞内[Ca2+]i浓度的影响，亦可持续一定时间。可能激光对个别细胞内[Ca2+]i浓度的影响是短暂的，但对细胞群体的作用会有先后差别，总体上表现为持续较长时间。
外界刺激对细胞功能的影响，细胞内[Ca2+]i浓度瞬时的空间分布增加对其内信号传导是重要因素，而1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)对细胞内Ca2+库释放起着关键作用[5]，IP3引起Ca2+释放的固有特性，预期细胞内Ca2+释放是突然的局限性的上升[6]。Breugel等[7]用波长为830 nm的激光照射Schwann细胞，激光照射调控细胞效应，细胞外Ca2+不是必需的，但是引起光生物调控作用，出现细胞内Ca2+的重新分布。细胞内Ca2+的信使作用途径非常复杂，它处于细胞信使传递途径的中心位置，直接和间接调控许多细胞效应。激光照射引起细胞内Ca2+浓度短暂升高，可能使细胞产生一系列的酶促反应，从而引起相关生理反应，这可能是以低强度激光特别是波长为632.8 nm的He-Ne激光作照射治疗取得理想疗效的原因。
, 百拇医药
参考文献
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