周期性载荷对骨缺损修复中微血管重建的影响△
作者：张建国1 李华滢2 姜开厚3 夏家骝2
单位：
关键词：周期性载荷；骨愈合；微血管重建
中国修复重建外科杂志980316 摘 要 为了观察周期性载荷对骨缺损修复过程中微血管重建的影响，采用20只家兔，双侧胫骨中部用骨钻制作骨缺损模型。左侧施加周期性载荷为实验组，右侧不施加载荷为对照组。分别于骨折第5，10，20及30天处死动物，作组织学检查。结果表明，实验组血管重建过程较对照组提前7天左右。认为，骨折第5天周期性载荷对骨缺损的修复无作用，骨折10天～30天有明显促进微血管重建的作用。
EFFECT OF CYCLIC LOADS ON REVASCULARIZATION IN HEALING OF BONE DEFECT/Zhang Jianguo, Li Huaying, Jiang Kaihou et al. Department of Anatomy, Sanxia Medical College, Yichang, P. R. China 443003
, http://www.100md.com
Abstract In order to study the biomechanical effect of cyclic loads on revascularization in bone healing, 20 rabbits were chosen for following experiments. Two 2 mm in diameter holes were made at the middle segment of both right and left tibia. A 2 mm in diameter nail was put in 15 mm proximal to the upper hole, and another was put in 15 mm distal to the lower hole. The wound was covered by direct suture with the ends of the nails kept 15 mm out of skin. The medial ends of the two nails were fixed by an iron plate, while the lateral ends were left for cyclic loads. Three Hz cyclic loads, which was near to the cyclic forces when a rabbit runs, was added to the left tibia for experiment, and no loads was add to the right tibia for control. A group of five rabbits were sacrificed respectively in 5, 10, 20 and 30 days postoperatively. The solution of 2% India ink and gelatin was irrigated from aorta to the bone defects. Then the tibia was removed for histologic study. The changes of cells and microvessel were observed. It was shown that the revascularization in experiment group was about 7 days earlier than that of control. The effect was at its peak from 10 to 30 days. It was concluded that cyclic loads could promot revascularization in the healing process of bone defect.
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Key words Cyclic loads Bone healing Revascularixation
新近的实验和临床资料表明，应力刺激对骨折愈合起重要作用，并影响骨折愈合的模式、速度和质量[1～3]。在骨折愈合中，局部血液供应至关重要。但有关应力刺激对骨折愈合中微血管重建的影响报道较少。我们以兔制作骨缺损模型，施加载荷，观察周期性载荷对骨缺损修复过程中微血管重建的形态变化规律，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 骨折模型制备
家兔20只，体重2.5 kg～3 kg，雌雄不限。5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉内麻醉，无菌下操作。在双侧胫骨内侧作切口，逐层切开，直到骨膜。在胫骨干的中点，用电钻钻成上、下两孔，孔径2 mm，孔间距1 mm，深达对侧骨皮质。在孔的上、下两端各1.5 cm处，用电钻分别钻成直径为2 mm骨孔，各穿过一根钢针，在胫骨内侧和外侧各露出皮肤外约1.5 cm。缝合切口，制成骨缺损模型。胫骨内侧用不锈钢板固定钢针，钢针外侧端留待施加载荷。左侧施加载荷为实验组，右侧不施加载荷为对照组。
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1.2 加载仪器及方法
周期性载荷所用电磁振动仪由北京航空航天大学生物力学研究室设计。频率为3 Hz，约等于动物跑动的频率。振幅按正弦上半波变化， 表明应力载荷向一个方向作用， 即将载荷施加在骨缺损处，而不是牵拉远离骨缺损处。应力载荷在3 kg以内。于骨折第2天开始给予载荷，每天1次，每次15分钟，按骨折第5，10，20及30天处死动物，每组5只。
1.3 血管墨汁切片法
处死的动物，经腹主动脉插管，温生理盐水冲洗，灌注2%墨汁明胶液，甲醛固定。取胫骨入8%盐水脱钙，软石蜡包埋，进行组织切片，切片厚度为10，50及200 μm，观察骨痂内微血管重建变化。
2 结果
2.1 微血管观察
, 百拇医药
骨折第5天，对照组骨缺损区周围的骨膜呈增生性反应，骨外膜增厚，其内的血管弯曲，扩张，缺损区内血肿形成，镜下可见墨汁分布，说明新生血管已长入血肿内，但部分区域无墨汁分布，为无血管区。实验组的微血管形态变化与对照组基本一致，未见明显差异(图1a，b)。
骨折第10天，对照组骨膜增厚明显，血管扩张，弯曲，互相吻合，大量新生血管进入缺损区内，并与髓内的血管吻合，表明通过骨外膜与髓内的血管侧支循环已建立。实验组骨外膜增厚较对照组明显，血管增生丰富，大量新生血管弥漫长入骨缺损区内，微血管普遍较粗，互相吻合成网，分别与骨外膜和髓内血管吻合，形成一个从骨外膜到髓内的横形血管网，说明施加载荷后血管重建速度加快(图2a，b)。
骨折第20天，对照组骨外膜内血管极为丰富，骨缺损区内出现粗大血管网，分别与骨外膜和髓内血管吻合。但实验组骨外膜开始变薄，血管开始变细，变稀疏，并由以前横形为主的血管分布，变为纵形为主的分布，其微血管形态向正常形态转变，说明骨痂的改建正向正常骨皮质转变(图3a，b)。
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骨折第30天，对照组血管开始变细，变稀疏，血管形态也由横形为主转为纵形为主，说明骨痂改建已开始。实验组的骨痂改建较成熟，可见皮质内主要为纵形血管分布，且与正常骨皮质血管形态难以区别。但骨外膜仍然较厚，其间的血管较粗，与对照组比较，明显稀疏，变细。骨折第30天对照组血管演化介于实验组20天～30天之间，说明施加载荷后，血管演化速度至少提前7天左右(图4a，b)。
2.2 组织学观察
骨折第5天，可见骨外膜下有较多成骨细胞，形态较大，胞浆丰富，核浓染，在光镜下，两组间没有明
图1 骨折第5天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组 C 骨痂 CB 骨皮质
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图2 骨折第10天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组 P 骨膜
图3 骨折第20天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组
显形态学差异。骨折第10天，对照组出现骨性骨痂；实验组骨性骨痂形成丰富，骨痂内成骨细胞数目较多。骨折第20天，对照组骨痂丰富，成骨细胞数量亦较多；而实验组已开始出现条索状的哈佛氏系统，成骨细胞的数量开始减少，但形态仍较大，胞浆丰富。骨折第30天，对照组可见哈佛氏系统；实验组骨改建已较成熟，其哈佛氏系统与周围骨皮质构成整体，成骨细胞位于哈佛氏系统内，数量减少，体积变小，染色变淡，表明已转化为骨细胞。
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图4 骨折第30天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b对照组
3 讨论
我们采用手术方法制作骨缺损模型，施加载荷，过程较复杂，需严格控制实验动物的条件和方法。使用自身对照，是为了防止个体差异而出现较大的误差。用钻孔的方法造成骨缺损，使实验组与对照组的缺损均一致，便于精确比较。同时，保证了胫骨的完整性，减少了骨折固定方面的影响。家兔较温顺，施加载荷时，一般不挣扎，但手法应轻柔，防止家兔挣扎弹腿，造成胫骨骨折。
3.1 加载后微血管变化规律
有关周期性载荷对骨缺损修复过程中血管变化影响的资料很少。张建国等[1]证实了周期性载荷可促进骨折部位的新生血管增生、扩张，加速侧支循环的建立。但是并未阐明其随时间变化的规律。我们的研究表明：骨折第5天，载荷对血管生长影响较小，但在第10天，则有明显的影响，使血管增生，管径变粗，并使微血管重建到达高峰。第20天时，血管开始变细，变稀疏。第30天时，骨缺损处的骨痂改建较成熟，其微血管形态接近正常血管的形态分布。而对照组的血管形态，相当于实验组第20天～30天之间的过渡形态，表明微血管演化过程提前了7天左右。
, 百拇医药
3.2 加载后侧支循环与成骨活动的关系
Brighton等[4]指出骨细胞受加载后，细胞内DNA含量增加，活性增强。我们认为，在骨缺损修复中，周期性载荷作为一种节律性的应力，刺激了骨缺损处的骨细胞，使之加速转化为成骨细胞，骨痂形成增多，矿化加速，并刺激了局部血液循环，使微血管增生加快，血管扩张，促进侧支循环的建立。同时，血管内皮细胞直接转化为成骨细胞[5]，促进成骨活动，如此相互作用，既保证了骨折愈合所需营养物质，又促进了血管直接成骨活动，加快了骨缺损的修复。
4 参考文献
1 张建国，夏家骝，李华滢等.周期性载荷对实验性骨折愈合影响的图像分析.中华骨科杂志，1995；15(4)：220
2 Wolf JW, White AA, Panjabi MM et al. Comparison of cyclic loading versus constant compression in the treatment of lone bone fracture in rabbits. J Bone Joint Surg(Am), 1981;63(5):805
, http://www.100md.com
3 Kenwright J, Goodship AE. Controlled mechanical stimulation in the treatment of tibial fracture. Clin Orthop, 1989;241(4):36
4 Brighton CT, Strafford B, Gross SB et al. The proliferative and synthetic response of isolated calverial bone cell of rate to cyclic biaxial mechanical strain. J Bone Joint Surg(Am), 1991;73(3):320
5 北京市积水潭医院放射科.骨折愈合过程中血管和成骨的关系.中华医学杂志，1973；53(3)：168
△ 国家自然科学基金资助项目
1 湖北三峡学院医学院解剖学教研室(湖北宜昌，443003)
2 北京医科大学解剖学系
3 北京航空航天大学生物力学研究室
(收稿：1997-03-06修复：1997-11-06), 百拇医药
单位：
关键词：周期性载荷；骨愈合；微血管重建
中国修复重建外科杂志980316 摘 要 为了观察周期性载荷对骨缺损修复过程中微血管重建的影响，采用20只家兔，双侧胫骨中部用骨钻制作骨缺损模型。左侧施加周期性载荷为实验组，右侧不施加载荷为对照组。分别于骨折第5，10，20及30天处死动物，作组织学检查。结果表明，实验组血管重建过程较对照组提前7天左右。认为，骨折第5天周期性载荷对骨缺损的修复无作用，骨折10天～30天有明显促进微血管重建的作用。
EFFECT OF CYCLIC LOADS ON REVASCULARIZATION IN HEALING OF BONE DEFECT/Zhang Jianguo, Li Huaying, Jiang Kaihou et al. Department of Anatomy, Sanxia Medical College, Yichang, P. R. China 443003
, http://www.100md.com
Abstract In order to study the biomechanical effect of cyclic loads on revascularization in bone healing, 20 rabbits were chosen for following experiments. Two 2 mm in diameter holes were made at the middle segment of both right and left tibia. A 2 mm in diameter nail was put in 15 mm proximal to the upper hole, and another was put in 15 mm distal to the lower hole. The wound was covered by direct suture with the ends of the nails kept 15 mm out of skin. The medial ends of the two nails were fixed by an iron plate, while the lateral ends were left for cyclic loads. Three Hz cyclic loads, which was near to the cyclic forces when a rabbit runs, was added to the left tibia for experiment, and no loads was add to the right tibia for control. A group of five rabbits were sacrificed respectively in 5, 10, 20 and 30 days postoperatively. The solution of 2% India ink and gelatin was irrigated from aorta to the bone defects. Then the tibia was removed for histologic study. The changes of cells and microvessel were observed. It was shown that the revascularization in experiment group was about 7 days earlier than that of control. The effect was at its peak from 10 to 30 days. It was concluded that cyclic loads could promot revascularization in the healing process of bone defect.
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Key words Cyclic loads Bone healing Revascularixation
新近的实验和临床资料表明，应力刺激对骨折愈合起重要作用，并影响骨折愈合的模式、速度和质量[1～3]。在骨折愈合中，局部血液供应至关重要。但有关应力刺激对骨折愈合中微血管重建的影响报道较少。我们以兔制作骨缺损模型，施加载荷，观察周期性载荷对骨缺损修复过程中微血管重建的形态变化规律，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 骨折模型制备
家兔20只，体重2.5 kg～3 kg，雌雄不限。5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉内麻醉，无菌下操作。在双侧胫骨内侧作切口，逐层切开，直到骨膜。在胫骨干的中点，用电钻钻成上、下两孔，孔径2 mm，孔间距1 mm，深达对侧骨皮质。在孔的上、下两端各1.5 cm处，用电钻分别钻成直径为2 mm骨孔，各穿过一根钢针，在胫骨内侧和外侧各露出皮肤外约1.5 cm。缝合切口，制成骨缺损模型。胫骨内侧用不锈钢板固定钢针，钢针外侧端留待施加载荷。左侧施加载荷为实验组，右侧不施加载荷为对照组。
, http://www.100md.com
1.2 加载仪器及方法
周期性载荷所用电磁振动仪由北京航空航天大学生物力学研究室设计。频率为3 Hz，约等于动物跑动的频率。振幅按正弦上半波变化， 表明应力载荷向一个方向作用， 即将载荷施加在骨缺损处，而不是牵拉远离骨缺损处。应力载荷在3 kg以内。于骨折第2天开始给予载荷，每天1次，每次15分钟，按骨折第5，10，20及30天处死动物，每组5只。
1.3 血管墨汁切片法
处死的动物，经腹主动脉插管，温生理盐水冲洗，灌注2%墨汁明胶液，甲醛固定。取胫骨入8%盐水脱钙，软石蜡包埋，进行组织切片，切片厚度为10，50及200 μm，观察骨痂内微血管重建变化。
2 结果
2.1 微血管观察
, 百拇医药
骨折第5天，对照组骨缺损区周围的骨膜呈增生性反应，骨外膜增厚，其内的血管弯曲，扩张，缺损区内血肿形成，镜下可见墨汁分布，说明新生血管已长入血肿内，但部分区域无墨汁分布，为无血管区。实验组的微血管形态变化与对照组基本一致，未见明显差异(图1a，b)。
骨折第10天，对照组骨膜增厚明显，血管扩张，弯曲，互相吻合，大量新生血管进入缺损区内，并与髓内的血管吻合，表明通过骨外膜与髓内的血管侧支循环已建立。实验组骨外膜增厚较对照组明显，血管增生丰富，大量新生血管弥漫长入骨缺损区内，微血管普遍较粗，互相吻合成网，分别与骨外膜和髓内血管吻合，形成一个从骨外膜到髓内的横形血管网，说明施加载荷后血管重建速度加快(图2a，b)。
骨折第20天，对照组骨外膜内血管极为丰富，骨缺损区内出现粗大血管网，分别与骨外膜和髓内血管吻合。但实验组骨外膜开始变薄，血管开始变细，变稀疏，并由以前横形为主的血管分布，变为纵形为主的分布，其微血管形态向正常形态转变，说明骨痂的改建正向正常骨皮质转变(图3a，b)。
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骨折第30天，对照组血管开始变细，变稀疏，血管形态也由横形为主转为纵形为主，说明骨痂改建已开始。实验组的骨痂改建较成熟，可见皮质内主要为纵形血管分布，且与正常骨皮质血管形态难以区别。但骨外膜仍然较厚，其间的血管较粗，与对照组比较，明显稀疏，变细。骨折第30天对照组血管演化介于实验组20天～30天之间，说明施加载荷后，血管演化速度至少提前7天左右(图4a，b)。
2.2 组织学观察
骨折第5天，可见骨外膜下有较多成骨细胞，形态较大，胞浆丰富，核浓染，在光镜下，两组间没有明
图1 骨折第5天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组 C 骨痂 CB 骨皮质
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图2 骨折第10天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组 P 骨膜
图3 骨折第20天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b 对照组
显形态学差异。骨折第10天，对照组出现骨性骨痂；实验组骨性骨痂形成丰富，骨痂内成骨细胞数目较多。骨折第20天，对照组骨痂丰富，成骨细胞数量亦较多；而实验组已开始出现条索状的哈佛氏系统，成骨细胞的数量开始减少，但形态仍较大，胞浆丰富。骨折第30天，对照组可见哈佛氏系统；实验组骨改建已较成熟，其哈佛氏系统与周围骨皮质构成整体，成骨细胞位于哈佛氏系统内，数量减少，体积变小，染色变淡，表明已转化为骨细胞。
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图4 骨折第30天骨愈合微血管(切片厚200 μm ×20)
a 实验组 b对照组
3 讨论
我们采用手术方法制作骨缺损模型，施加载荷，过程较复杂，需严格控制实验动物的条件和方法。使用自身对照，是为了防止个体差异而出现较大的误差。用钻孔的方法造成骨缺损，使实验组与对照组的缺损均一致，便于精确比较。同时，保证了胫骨的完整性，减少了骨折固定方面的影响。家兔较温顺，施加载荷时，一般不挣扎，但手法应轻柔，防止家兔挣扎弹腿，造成胫骨骨折。
3.1 加载后微血管变化规律
有关周期性载荷对骨缺损修复过程中血管变化影响的资料很少。张建国等[1]证实了周期性载荷可促进骨折部位的新生血管增生、扩张，加速侧支循环的建立。但是并未阐明其随时间变化的规律。我们的研究表明：骨折第5天，载荷对血管生长影响较小，但在第10天，则有明显的影响，使血管增生，管径变粗，并使微血管重建到达高峰。第20天时，血管开始变细，变稀疏。第30天时，骨缺损处的骨痂改建较成熟，其微血管形态接近正常血管的形态分布。而对照组的血管形态，相当于实验组第20天～30天之间的过渡形态，表明微血管演化过程提前了7天左右。
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3.2 加载后侧支循环与成骨活动的关系
Brighton等[4]指出骨细胞受加载后，细胞内DNA含量增加，活性增强。我们认为，在骨缺损修复中，周期性载荷作为一种节律性的应力，刺激了骨缺损处的骨细胞，使之加速转化为成骨细胞，骨痂形成增多，矿化加速，并刺激了局部血液循环，使微血管增生加快，血管扩张，促进侧支循环的建立。同时，血管内皮细胞直接转化为成骨细胞[5]，促进成骨活动，如此相互作用，既保证了骨折愈合所需营养物质，又促进了血管直接成骨活动，加快了骨缺损的修复。
4 参考文献
1 张建国，夏家骝，李华滢等.周期性载荷对实验性骨折愈合影响的图像分析.中华骨科杂志，1995；15(4)：220
2 Wolf JW, White AA, Panjabi MM et al. Comparison of cyclic loading versus constant compression in the treatment of lone bone fracture in rabbits. J Bone Joint Surg(Am), 1981;63(5):805
, http://www.100md.com
3 Kenwright J, Goodship AE. Controlled mechanical stimulation in the treatment of tibial fracture. Clin Orthop, 1989;241(4):36
4 Brighton CT, Strafford B, Gross SB et al. The proliferative and synthetic response of isolated calverial bone cell of rate to cyclic biaxial mechanical strain. J Bone Joint Surg(Am), 1991;73(3):320
5 北京市积水潭医院放射科.骨折愈合过程中血管和成骨的关系.中华医学杂志，1973；53(3)：168
△ 国家自然科学基金资助项目
1 湖北三峡学院医学院解剖学教研室(湖北宜昌，443003)
2 北京医科大学解剖学系
3 北京航空航天大学生物力学研究室
(收稿：1997-03-06修复：1997-11-06), 百拇医药