胎儿神经移植修复感觉神经缺损
作者：田立杰1 战 杰1 王淑华2 梁晓旭1 安贵林2 田 耘3
单位：1 沈阳医学院附属中心医院手外科 沈阳市手外科研究所(辽宁沈阳，110024)；2 沈阳医学院组织胚胎学教研室；3 辽宁省开原市骨科医院
关键词：胎儿神经；异体移植；神经缺损
中国修复重建外科杂志980304 摘 要 为观察经深低温冷冻胎儿神经移植修复人体感觉神经缺损的效果，用胎龄为16周～24周的坐骨神经和正中神经，经-80℃冷冻后修复指总神经、指神经等神经缺损22例(36条)。移植胎儿神经最短2 cm，最长12 cm。本组患者均获得随访，随访时间为7个月～5年。结果表明，优S+38条，良S315条，占63.9%；可S+26条，S24条，占27.8%；差S03条，占8.3%。认为，胎儿神经抗原性弱，深低温冷冻可进一步降低其抗原性，对修复5 cm以内感觉神经缺损疗效较好，是较理想的异体神经移植材料；二甲亚砜可防止冷冻对神经组织的损害。
, 百拇医药
ALLOGRAFT OF FROZEN NERVE IN REPAIRING SENSORY NERVE DEFECT/Tian Lijie, Zhan Jie, Wang Shuhua et al. Department of Hand Surgery, Affilicated Centre Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang, P. R. China 110024
Abstract To observe the effect of allogenic transplantation of deep frozen nerve in repairing sensory nerve defect, 22 patients who had received this type of treatment were followed up for 0.5～5 years. There were 18 males and 4 females in this group, and the average age was 28 years old. Thirty-six nerve defects including the common volar digital nerve, proper volar digital nerve were repaired by allograft of nerves stored at deep frozen (-80℃). The storation period was ranged from 9 days to 1 years. The length of the nerves were 2 cm～12 cm. After follow-up for 3 years (ranged from 7 months～5 years), 23 cases of nerve allograft obtained excellent and good results (63.9%), 10 cases were fair (27.7%) and 3 cases were poor (8.3%). It was concluded that ① frozen nerve is one of nice materials for repairing the nerve defect (<5 cm); ②the immunity of allogenenic nerve is weak ; ③the deep frozen storation can reduce the immunity of nerve; ④the dimethyl sulfoxide can prevent the nerve tissue from injury by deep frozen; ⑤the best temperature and period for deep frozen storation should be studied further.
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Key words Frozen nerve Allograft Nerve defect
为修复周围神经缺损，异体神经移植一直是诸多学者关注的课题之一，并作了大量的探讨。存在的主要障碍是免疫排斥反应，讫今尚无突破性进展[1]。我院于1992年在动物实验取得初步成果后，应用经深低温冷冻的胎儿神经移植修复22例(36条)感觉神经缺损，取得了较满意的效果。报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料
本组22例，男18例，女4例。年龄13岁～39岁。病程1天～3年。移植胎儿神经36条，长2 cm～12 cm。神经冷存时间为9天～1年。采用胎儿坐骨神经17条，正中神经12条，胫神经7条。修复指固有神经19条，指总神经12条，腓肠神经2条，桡神经浅支1条，正中神经1条，尺神经1条。
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1.2 胎儿神经制备
选用健康母体水囊引产的胎龄为16周～24周胎儿，即刻用1‰洗必泰液清洗全身。在无菌条件下切取双侧坐骨神经(长8 cm～10 cm，直径1.5 mm～2 mm)，胫神经(长4 cm～6 cm，直径1 mm～1.5 mm)，正中神经(长3 cm～5 cm，直径1 mm)，也可将坐骨神经与胫神经、腓总神经一起切取，以增加神经长度。在室温下用生理盐水清洗二遍， 然后放入含15%二甲亚砜和15%新生小牛血清的1640营养液中浸泡，置4℃冰箱内平衡30分钟后，置入无菌容器内密闭封装，标签上注明神经名称、长度、外径、胎龄及取材时间。置-80℃深低温冰箱保存备用。手术中根据受体神经缺损长度、外径，从深低温冰箱中取出相应的胎儿神经，检查密闭容器有无破损、泄漏。用37℃温水快速复温，按无菌操作取出胎儿神经，置16℃～20℃10%葡萄糖液中浸泡30分钟，清除大部分二甲亚砜，然后用生理盐水(含庆大霉素100 U/ml)漂洗10分钟～15分钟，即可植入受体。
, 百拇医药 1.3 手术方法
先解剖分离出受体神经，切除远、近端神经瘤，至正常神经束为止，选用与缺损神经外径、长度相符的胎儿神经，一般指神经缺损选用胎儿正中神经或胫神经，指总神经、腓肠神经和桡神经浅支缺损选用胎儿坐骨神经。在显微镜下用9/0或11/0无损伤线行无张力外膜或束膜缝合。清洗创口，缝合皮肤，石膏托固定3周～4周。
1.4 结果
本组患者均获得随访，随访时间为7个月～5年。根据1954年英国医学研究会制定的0级～4级感觉分级法评定[2]，本组优S+38条，良S315条，优良率为63.9%；可S+26条，S24条，占27.8%；差S03条，占8.3%。1例腕部撕脱性完全离断患者，在断肢再植时行胎儿坐骨神经移植修复正中神经缺损8 cm，尺神经缺损10 cm。术后14个月手部感觉无恢复。二期手术时，见连接正中神经、尺神经近端的胎儿神经明显变细，再向远端3 cm～4 cm，则消失于瘢痕组织中，已被排斥。遂行自体神经移植。
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2 讨论
2.1 胎儿神经移植的抗原性问题
异体神经移植成功的关键是移植后排斥反应的强弱及其发生时间的早晚。Zalewski用大鼠作实验，切除一段腓总神经代替异体腓总神经，供体与受体属强不相容性或弱不相容性[3]。如移植神经长2 cm，则受体的神经轴索可顺利通过，长入远端的自体神经，重新支配瘫痪的肌肉，足下垂逐渐消失。其后受排斥破坏的雪旺鞘和髓鞘被受体置换。如移植神经超过2 cm，轴索不能完全穿过。移植4 cm长的异体神经均失败。本组移植胎儿神经2 cm～5 cm效果较好，9 cm以上者均未恢复。尤其是修复较粗的正中神经和尺神经缺损，再次手术时发现移植神经均被慢性排斥。说明经过深低温冷冻的胎儿神经虽然抗原性很弱，但仍有抗原性，也有可能发生排斥反应。由于移植神经过长，自体神经轴索通过异体神经段的时间超过了排斥反应发生的时间，使移植神经被排斥。这说明在异体神经移植后到出现排斥反应这一段时间越长，自体神经轴索长入异体神经的长度越长。也就是说，排斥反应发生的时间与异体神经的长度成正比。故选择抗原性弱的神经组织和降低神经组织的抗原性，以推迟排斥反应发生的时间，延长异体神经移植的长度仍有待于进一步研究。
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由于胎儿组织尚未具备明显的生物学特性，免疫系统处于不成熟状态，对寄生环境有较强的依赖性，排斥反应发生不明显，容易导致“免疫宽容”。所以，临床上应用胎儿的肾脏、胰腺、甲状旁腺、骨髓等器官或组织移植，并已取得了一定的成功。周围神经组织是人体组织相容性抗原含量较低、抗原作用较弱的一种组织，较上述器官或组织移植容易成功。我们于1990年进行的冷冻狗胎仔神经异体移植的动物实验，修复成年狗正中神经缺损3 cm，术后60，90及180天分别取材制成光镜和电镜标本。结果表明，孕50天的狗胎组有较多的再生神经纤维通过异体神经而到达靶器官，明显优于生后10天的狗仔组。
2.2 深低温冷冻降低神经组织抗原性的机理
神经组织抗原集中在细胞表面，深低温冷冻可破坏细胞表面的抗原，杀死雪旺细胞，使其不能继续分泌抗原物质，明显降低了免疫排斥反应，同时又保护了完整的神经膜管结构。完整的神经膜管一方面可起到机械引导作用，另一方面神经膜管的基底膜成分对神经生长有诱导作用。本组结果表明，经过深低温保存的异体神经并不能完全消除抗原性，这是今后需要进一步研究的问题。
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2.3 深低温冷冻对神经组织细胞的损害
低温生物学认为，生物细胞随环境温度降低，细胞内酶活性相应减低，细胞代谢减慢，甚至细胞活动被完全抑制。许多学者认为，细胞处于0℃以下时，细胞膜周围有冰晶形成，使细胞受机械性挤压，甚至刺破细胞膜；低温使细胞膜上钠泵ATP酶活性降低，钠泵功能受限制，细胞膜对阳离子的通透性增加，细胞外钠离子和氯离子进入细胞，细胞内镁和钾外溢。细胞内失钾，使钙离子转运、线粒体呼吸及其氧化磷酸化过程均受抑制，蛋白质合成亦受影响。随着细胞外冰晶形成，导致细胞脱水，细胞内溶质浓缩，渗透压增高，严重时可致渗透性休克。冰晶形成对蛋白质和磷质亦有毒害作用，严重时可使细胞遭受不可逆性损害。低温引起上述一系列细胞活动的变化，也受降温速度的影响。
此外，细胞在复温融解时，可能产生稀释性损伤，以及水重结晶所致的机械性损伤与渗透压变化。有学者认为，复温的速度取决于冷却速度。降温快，复温也快；降温慢，复温也慢。一般对完整器官如肾脏等低温保存，只能采用非常缓慢的速度进行冷却和融化，才能避免细胞内冰晶形成和器官表面部分的机械性损伤。对组织碎片或细胞，则多主张缓慢降温，快速融化，这样对细胞损伤较小，成活率较高[4]。
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2.4 预防冷冻对神经组织细胞损害的方法
对冷冻时细胞损伤的防止，除了掌握降温和复温速度外，File等认为冷冻保护剂的正确选用亦是关键[4]。冷冻保护剂能均匀分布至整个器官，以避免不可逆性细胞损害与渗透性休克发生。冷冻保护剂具有与水结合力较强的特性，此类物质通过与细胞内水分结合，可减低结冰程度和速度，减轻细胞脱水和细胞的渗透性应激损伤。最常用的保护剂为甘油和二甲亚砜。有学者认为二甲亚砜的毒性比甘油小一半，且透入细胞快，可置换或固定细胞内游离水，细胞解冻后用轻度高渗葡萄糖液即可清除大部分二甲亚砜。
2.5 供体胎儿的最佳胎龄
胎龄为17周～20周的胎儿四肢活动加剧，说明此期的周围神经系统已趋完善。18周时免疫系统已趋发育完成，细胞免疫和体液免疫功能均已建立，胎儿已能对外来抗原组织排斥，随着时间的延长，这种功能越来越健全。我们的前期动物实验证明，胎龄小于16周时胎儿神经较细，大于24周时胎儿神经抗原性较强。所以我们采用16周～24周的胎儿神经作为供体。
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2.6 尚存在的问题
目前，胎儿神经取材及冷存简便。虽然胎儿神经在修复较短的单纯感觉神经方面取得了一定的进展，但尚不宜修复较粗的混合神经的长段缺损。同时对胎儿神经冷存的最适宜温度和最佳时间尚需进一步探讨。
3 参考文献
1 蒋立新，钟世镇.周围神经损伤修复机理的研究进展.中华手外科杂志，1997；13(1)：55
2 陆裕朴，褚晓朝.手部神经功能检查.手外科杂志，1990；6(2)：8
3 汪良能，高学书.整形外科学.北京：人民卫生出版社，1989：78～79
4 张洪德，钟胜荣，胡远峰.新生大鼠胰岛冷冻保存方法研究.中华器官移植杂志，1991；12(2)：72
(收稿：1997-07-04), http://www.100md.com
单位：1 沈阳医学院附属中心医院手外科 沈阳市手外科研究所(辽宁沈阳，110024)；2 沈阳医学院组织胚胎学教研室；3 辽宁省开原市骨科医院
关键词：胎儿神经；异体移植；神经缺损
中国修复重建外科杂志980304 摘 要 为观察经深低温冷冻胎儿神经移植修复人体感觉神经缺损的效果，用胎龄为16周～24周的坐骨神经和正中神经，经-80℃冷冻后修复指总神经、指神经等神经缺损22例(36条)。移植胎儿神经最短2 cm，最长12 cm。本组患者均获得随访，随访时间为7个月～5年。结果表明，优S+38条，良S315条，占63.9%；可S+26条，S24条，占27.8%；差S03条，占8.3%。认为，胎儿神经抗原性弱，深低温冷冻可进一步降低其抗原性，对修复5 cm以内感觉神经缺损疗效较好，是较理想的异体神经移植材料；二甲亚砜可防止冷冻对神经组织的损害。
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ALLOGRAFT OF FROZEN NERVE IN REPAIRING SENSORY NERVE DEFECT/Tian Lijie, Zhan Jie, Wang Shuhua et al. Department of Hand Surgery, Affilicated Centre Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang, P. R. China 110024
Abstract To observe the effect of allogenic transplantation of deep frozen nerve in repairing sensory nerve defect, 22 patients who had received this type of treatment were followed up for 0.5～5 years. There were 18 males and 4 females in this group, and the average age was 28 years old. Thirty-six nerve defects including the common volar digital nerve, proper volar digital nerve were repaired by allograft of nerves stored at deep frozen (-80℃). The storation period was ranged from 9 days to 1 years. The length of the nerves were 2 cm～12 cm. After follow-up for 3 years (ranged from 7 months～5 years), 23 cases of nerve allograft obtained excellent and good results (63.9%), 10 cases were fair (27.7%) and 3 cases were poor (8.3%). It was concluded that ① frozen nerve is one of nice materials for repairing the nerve defect (<5 cm); ②the immunity of allogenenic nerve is weak ; ③the deep frozen storation can reduce the immunity of nerve; ④the dimethyl sulfoxide can prevent the nerve tissue from injury by deep frozen; ⑤the best temperature and period for deep frozen storation should be studied further.
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Key words Frozen nerve Allograft Nerve defect
为修复周围神经缺损，异体神经移植一直是诸多学者关注的课题之一，并作了大量的探讨。存在的主要障碍是免疫排斥反应，讫今尚无突破性进展[1]。我院于1992年在动物实验取得初步成果后，应用经深低温冷冻的胎儿神经移植修复22例(36条)感觉神经缺损，取得了较满意的效果。报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料
本组22例，男18例，女4例。年龄13岁～39岁。病程1天～3年。移植胎儿神经36条，长2 cm～12 cm。神经冷存时间为9天～1年。采用胎儿坐骨神经17条，正中神经12条，胫神经7条。修复指固有神经19条，指总神经12条，腓肠神经2条，桡神经浅支1条，正中神经1条，尺神经1条。
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1.2 胎儿神经制备
选用健康母体水囊引产的胎龄为16周～24周胎儿，即刻用1‰洗必泰液清洗全身。在无菌条件下切取双侧坐骨神经(长8 cm～10 cm，直径1.5 mm～2 mm)，胫神经(长4 cm～6 cm，直径1 mm～1.5 mm)，正中神经(长3 cm～5 cm，直径1 mm)，也可将坐骨神经与胫神经、腓总神经一起切取，以增加神经长度。在室温下用生理盐水清洗二遍， 然后放入含15%二甲亚砜和15%新生小牛血清的1640营养液中浸泡，置4℃冰箱内平衡30分钟后，置入无菌容器内密闭封装，标签上注明神经名称、长度、外径、胎龄及取材时间。置-80℃深低温冰箱保存备用。手术中根据受体神经缺损长度、外径，从深低温冰箱中取出相应的胎儿神经，检查密闭容器有无破损、泄漏。用37℃温水快速复温，按无菌操作取出胎儿神经，置16℃～20℃10%葡萄糖液中浸泡30分钟，清除大部分二甲亚砜，然后用生理盐水(含庆大霉素100 U/ml)漂洗10分钟～15分钟，即可植入受体。
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先解剖分离出受体神经，切除远、近端神经瘤，至正常神经束为止，选用与缺损神经外径、长度相符的胎儿神经，一般指神经缺损选用胎儿正中神经或胫神经，指总神经、腓肠神经和桡神经浅支缺损选用胎儿坐骨神经。在显微镜下用9/0或11/0无损伤线行无张力外膜或束膜缝合。清洗创口，缝合皮肤，石膏托固定3周～4周。
1.4 结果
本组患者均获得随访，随访时间为7个月～5年。根据1954年英国医学研究会制定的0级～4级感觉分级法评定[2]，本组优S+38条，良S315条，优良率为63.9%；可S+26条，S24条，占27.8%；差S03条，占8.3%。1例腕部撕脱性完全离断患者，在断肢再植时行胎儿坐骨神经移植修复正中神经缺损8 cm，尺神经缺损10 cm。术后14个月手部感觉无恢复。二期手术时，见连接正中神经、尺神经近端的胎儿神经明显变细，再向远端3 cm～4 cm，则消失于瘢痕组织中，已被排斥。遂行自体神经移植。
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2 讨论
2.1 胎儿神经移植的抗原性问题
异体神经移植成功的关键是移植后排斥反应的强弱及其发生时间的早晚。Zalewski用大鼠作实验，切除一段腓总神经代替异体腓总神经，供体与受体属强不相容性或弱不相容性[3]。如移植神经长2 cm，则受体的神经轴索可顺利通过，长入远端的自体神经，重新支配瘫痪的肌肉，足下垂逐渐消失。其后受排斥破坏的雪旺鞘和髓鞘被受体置换。如移植神经超过2 cm，轴索不能完全穿过。移植4 cm长的异体神经均失败。本组移植胎儿神经2 cm～5 cm效果较好，9 cm以上者均未恢复。尤其是修复较粗的正中神经和尺神经缺损，再次手术时发现移植神经均被慢性排斥。说明经过深低温冷冻的胎儿神经虽然抗原性很弱，但仍有抗原性，也有可能发生排斥反应。由于移植神经过长，自体神经轴索通过异体神经段的时间超过了排斥反应发生的时间，使移植神经被排斥。这说明在异体神经移植后到出现排斥反应这一段时间越长，自体神经轴索长入异体神经的长度越长。也就是说，排斥反应发生的时间与异体神经的长度成正比。故选择抗原性弱的神经组织和降低神经组织的抗原性，以推迟排斥反应发生的时间，延长异体神经移植的长度仍有待于进一步研究。
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由于胎儿组织尚未具备明显的生物学特性，免疫系统处于不成熟状态，对寄生环境有较强的依赖性，排斥反应发生不明显，容易导致“免疫宽容”。所以，临床上应用胎儿的肾脏、胰腺、甲状旁腺、骨髓等器官或组织移植，并已取得了一定的成功。周围神经组织是人体组织相容性抗原含量较低、抗原作用较弱的一种组织，较上述器官或组织移植容易成功。我们于1990年进行的冷冻狗胎仔神经异体移植的动物实验，修复成年狗正中神经缺损3 cm，术后60，90及180天分别取材制成光镜和电镜标本。结果表明，孕50天的狗胎组有较多的再生神经纤维通过异体神经而到达靶器官，明显优于生后10天的狗仔组。
2.2 深低温冷冻降低神经组织抗原性的机理
神经组织抗原集中在细胞表面，深低温冷冻可破坏细胞表面的抗原，杀死雪旺细胞，使其不能继续分泌抗原物质，明显降低了免疫排斥反应，同时又保护了完整的神经膜管结构。完整的神经膜管一方面可起到机械引导作用，另一方面神经膜管的基底膜成分对神经生长有诱导作用。本组结果表明，经过深低温保存的异体神经并不能完全消除抗原性，这是今后需要进一步研究的问题。
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2.3 深低温冷冻对神经组织细胞的损害
低温生物学认为，生物细胞随环境温度降低，细胞内酶活性相应减低，细胞代谢减慢，甚至细胞活动被完全抑制。许多学者认为，细胞处于0℃以下时，细胞膜周围有冰晶形成，使细胞受机械性挤压，甚至刺破细胞膜；低温使细胞膜上钠泵ATP酶活性降低，钠泵功能受限制，细胞膜对阳离子的通透性增加，细胞外钠离子和氯离子进入细胞，细胞内镁和钾外溢。细胞内失钾，使钙离子转运、线粒体呼吸及其氧化磷酸化过程均受抑制，蛋白质合成亦受影响。随着细胞外冰晶形成，导致细胞脱水，细胞内溶质浓缩，渗透压增高，严重时可致渗透性休克。冰晶形成对蛋白质和磷质亦有毒害作用，严重时可使细胞遭受不可逆性损害。低温引起上述一系列细胞活动的变化，也受降温速度的影响。
此外，细胞在复温融解时，可能产生稀释性损伤，以及水重结晶所致的机械性损伤与渗透压变化。有学者认为，复温的速度取决于冷却速度。降温快，复温也快；降温慢，复温也慢。一般对完整器官如肾脏等低温保存，只能采用非常缓慢的速度进行冷却和融化，才能避免细胞内冰晶形成和器官表面部分的机械性损伤。对组织碎片或细胞，则多主张缓慢降温，快速融化，这样对细胞损伤较小，成活率较高[4]。
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2.4 预防冷冻对神经组织细胞损害的方法
对冷冻时细胞损伤的防止，除了掌握降温和复温速度外，File等认为冷冻保护剂的正确选用亦是关键[4]。冷冻保护剂能均匀分布至整个器官，以避免不可逆性细胞损害与渗透性休克发生。冷冻保护剂具有与水结合力较强的特性，此类物质通过与细胞内水分结合，可减低结冰程度和速度，减轻细胞脱水和细胞的渗透性应激损伤。最常用的保护剂为甘油和二甲亚砜。有学者认为二甲亚砜的毒性比甘油小一半，且透入细胞快，可置换或固定细胞内游离水，细胞解冻后用轻度高渗葡萄糖液即可清除大部分二甲亚砜。
2.5 供体胎儿的最佳胎龄
胎龄为17周～20周的胎儿四肢活动加剧，说明此期的周围神经系统已趋完善。18周时免疫系统已趋发育完成，细胞免疫和体液免疫功能均已建立，胎儿已能对外来抗原组织排斥，随着时间的延长，这种功能越来越健全。我们的前期动物实验证明，胎龄小于16周时胎儿神经较细，大于24周时胎儿神经抗原性较强。所以我们采用16周～24周的胎儿神经作为供体。
, 百拇医药
2.6 尚存在的问题
目前，胎儿神经取材及冷存简便。虽然胎儿神经在修复较短的单纯感觉神经方面取得了一定的进展，但尚不宜修复较粗的混合神经的长段缺损。同时对胎儿神经冷存的最适宜温度和最佳时间尚需进一步探讨。
3 参考文献
1 蒋立新，钟世镇.周围神经损伤修复机理的研究进展.中华手外科杂志，1997；13(1)：55
2 陆裕朴，褚晓朝.手部神经功能检查.手外科杂志，1990；6(2)：8
3 汪良能，高学书.整形外科学.北京：人民卫生出版社，1989：78～79
4 张洪德，钟胜荣，胡远峰.新生大鼠胰岛冷冻保存方法研究.中华器官移植杂志，1991；12(2)：72
(收稿：1997-07-04), http://www.100md.com