血啉甲醚与血浆蛋白的结合
作者：余建鑫 陈文晖 许德余
单位：上海市第二军医大学“五二三”药物研究所
关键词：血啉甲醚；血浆蛋白结合率；结合参数；平衡透析法
中国激光医学杂志980308The Binding of Hematoporphyrin Monomethyl
Ether to Plasma Proteins
Yu Jianxin, Chen Wenhui, Xu Deyu
“523” Institute of Medicinal Chemistry, The Second Military Medical University, Shanghai(200433)
, http://www.100md.com
摘要 为研究血啉甲醚(HMME)与小鼠血浆的蛋白结合率及HMME与血浆蛋白的结合参数，用平衡透析法测定蛋白结合率，HMME浓度用标准曲线法求出。HMME血浆浓度在19.4 μg/ml～297.6 μg/ml时血浆蛋白结合率为93.5%～76.3%，血浆蛋白结合参数：最大结合力(β)为8.7×10-6mol/g；解离常数(Kdp)为4.24×10-5mol/L；结合常数(K)为2.84×104 L/mol；结合部位数(N)为1.492。表明HMME与小鼠血浆蛋白具有单一类型的结合部位，药物血浆浓度升高结合率下降。
ABSTRACT
To elucidate the binding of hematoporphyrin monomethyl ether (HMME) to plasma protein of mice and evaluate the binding parameters, the binding rate of HMME to plasma protein was determined by equilibrium dialysis method. Concentration of HMME was assayed by standard curve method. The binding rate of HMME to plasma protein was found to be 93.5%-76.3% varying with the concentration of HMME in plasma from 19.4 μg/ml-297.6 μg/ml. The binding parameters were 8.7×10-6mol/g for β; 4.24×10-5mol/L for Kdp; 2.84×104 L/mol for K and 1.492 for N. There were single-typed binding sites for HMME to plasma protein of mice. Moreover plasma concentration of HMME was inversely proportional to the binding rate.
, 百拇医药
Key words Hematoporphyrin monomethyl ether, Plasma protein binding rate, Binding parameters, Equilibrium dialysis
血啉甲醚(Hematoporphyrin monome-thyl ether, HMME)是一种可能的理想光动力治癌新药。已知其为混合卟啉制剂癌光啉[1]治疗肿瘤的主要光生物活性成分，对体外培养HeLa细胞具有较高的光灭活作用，对动物移植瘤的光动力治疗作用亦不低于HpD[2]。与目前国内临床使用的卟啉类制剂相比，血啉甲醚具有结构明确、毒性低、对肿瘤有较好的光动力杀伤作用等优点。目前有关该药的临床前实验研究已接近完成。
药物血浆蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一，是新药临床评价不可缺少的指标[3]。本文报道血啉甲醚与血浆蛋白结合的实验研究结果。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、试剂与仪器
血啉甲醚注射液：本室研制提供，规格10 mg/ml，批号931035；XW-80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂生产)；半透膜(购自上海试剂商店)；MPF型荧光分光光度计(日本日立)。荧光测定条件：激发光波长395 nm，狭缝10 nm；发射光波长613 nm，狭缝5 nm，工作电压750V。
二、血浆
昆明株小鼠断头取血，肝素抗凝，即时离心，分离血浆。
三、血浆蛋白结合率的测定方法
采用平衡透析法测定[4]。在9.5 ml透析液(含0.15 mol/L氯化钠的0.2 mol/L磷酸缓冲液，pH7.4)中加入一定浓度的药液0.5 ml。半透膜袋内加入血浆2.0 ml。调整袋内、外液面在同一水平上，置冰箱内平衡透析90 h(温度约4℃)。透析后用磺酸水杨酸试剂检查袋外透析液有无蛋白质漏出，有漏出者作废。
, 百拇医药
分别吸取袋内血浆和袋外缓冲液各0.2 ml，加入1.8 ml的0.1 mol/L HCl—5%NaCl溶液，置旋涡混合器上振荡提取，离心10 min。吸取上清液适量，以0.1 mol/L NaOH溶液稀释至线性范围，荧光分光光度法测定其浓度。除实验样本外，另以2.0 ml透析液代替血浆，操作同上，作为时间对照样，以确定药物从袋内向袋外自由扩散达到平衡所需的时间。
四、线性关系及回收率测定
取小鼠血浆和缓冲液各8份，每份2 ml，分别加入不同量的血啉甲醚混匀，使成一系列浓度，置冰箱放置约90 h，按上述实验方法提取，稀释，测定荧光强度。平行重复5次。以荧光强度对药物浓度进行线性回归，同时测定与上述浓度相同的血啉甲醚的NaOH溶液的荧光强度，计算回收率。
五、数据计算
(一)蛋白结合率：待药物扩散达到平衡后，分别测得透析袋内血浆药物浓度(总浓度Dt)及袋外缓冲液药物浓度(游离浓度Df)。根据公式(1)求得药物的血浆蛋白结合率[4]。
, 百拇医药
(1)
(二)结合参数：将前述方法测得的Dt及Df，按公式(2)(3)分别求出药物—蛋白复合物的解离常数Kdp和蛋白对药物的最大结合能力β，药物与蛋白质的结合常数K和结合部位数N[5]。
(2)
(3)
式中P：蛋白浓度(g/L)，小鼠的P值取55 g/L[6]。Db=Dt-Df，系与蛋白结合的药物浓度。Pt：白蛋白摩尔浓度，小鼠血清白蛋白含量取20 g/L[7]。白蛋白分子量68 000。血啉甲醚分子量612。
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结 果
一、线性关系与回收率
药物—缓冲液和药物—血浆按上述测定方法处理后，其荧光光谱见图1。两者激发光谱和发射光谱完全一致。最大激发波长395 nm，最大发射波长613 nm。表明经蛋白结合后提取，HMME的结构没有改变。
将实验测得的荧光强度分别对缓冲液中的HMME浓度和血浆中HMME浓度进行线性回归。回归方程分别为：
缓冲液：y=0.724+200.93x(r=0.999 9)
线性范围：6.4×10-4 μg/ml
血浆：y=1.429+135.29x(r=0.999)
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线性范围：1.2×10-3 μg/ml
在线性测定范围内，HMME—缓冲液回收率100%，HMME—血浆回收率大于75%。日内测定的变异系数CV=0.80%。
图1 缓冲液中与血浆中HMME荧光光谱A 激发光谱 B发射光谱
———缓冲液中HMME ------血浆中HMME
Fig.1 Fluorescence spectrum of HMME in buffer and in plasmaA：Exitation spectrum，B：Emission spectrum，———HMME in buffer, ------HMME in plasma
, http://www.100md.com
二、HMME与血浆蛋白的结合率
(一)透析平衡时间的确定：在透析袋内以磷酸缓冲液代替血浆，按上述方法测得不同时间袋内、袋外的HMME浓度。以两者浓度比对时间的关系做图，得图2。可见HMME透析达到平衡约需90小时。
(二)蛋白结合率：透析平衡后测定袋内、外HMME浓度，分别测定4次，计算不同浓度下的蛋白结合率。见附表。有非常显著性差异(P<0.01)。
附表 血浆药物浓度和血浆蛋白结合率
Tab.1 HMME concentration of plasma and its plasma protein binding rate(
±s, μg/ml) 编号
, http://www.100md.com
No.
HMME
结合率
Protein
binding rate
(%)
透析袋内
Inside dialysis
bag
透析袋外
Outside dialysis
bag
, 百拇医药
1
19.40±1.81
1.26±0.18
93.5±0.4
2
43.90±8.00
4.26±2.63
90.3±7.4
3
109.90±16.82
15.97±3.91
85.5±3.3
, 百拇医药
4
194.15±47.80
34.98±1.92
82.1±5.2
5
297.60±8.49
70.40±17.35
76.4±3.2
图2 袋内与袋外HMME之比随时间的变化
, 百拇医药
Fig.2 Ratios of HMME inside and outside the dialysis bag versus time
(三)HMME与血浆蛋白结合参数
将上述五种不同浓度的HMME平衡透析后测得的Df和Db，根据公式(2)(3)进行直线回归。求得β值为8.7×10-6mol/g，Kdp值为4.24×10-5mol/L，K为2.84×104L/mol以及N为1.492。
讨 论
由公式(2)和(3)线性回归为一直线(P≤0.01，呈非常显著相关)，提示HMME与小鼠血浆蛋白具有单一类型的结合部位[8]。故可按公式(4)
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(4)
用β和Kdp两个参数求得任意浓度下血浆蛋白质游离率(fu)和结合率(fb)。实验结果表明，HMME与血浆蛋白的结合率与浓度有关。浓度高，结合率下降，结合部位趋于饱和，游离HMME浓度升高。故临床应用此药时，由于游离HMME浓度与给药剂量不成线性关系，当给予病人较大剂量时，游离HMME浓度提高很快，所以有可能引起光毒反应。我们实验室对病人进行静脉滴注，使其保持较低的HMME浓度，同时给予光照治疗，取得较好的效果。由于目前国内临床使用的肿瘤光动力药物均为复杂的混合卟啉制剂，无法准确测定其与血浆蛋白的结合率。HMME为我国独立研制的一种组成单一、结构明确的肿瘤光动力治疗新药。其与小鼠血浆蛋白结合的研究对临床给药有一定的参考意义。
参 考 文 献
1.许德余，殷祥生，陈文晖，等.肿瘤光化学诊治新药癌光啉(PsD-007)的研究.中国医药工业杂志，1989，20：440.
, 百拇医药
2.陈文晖，许德余.癌光啉成分的分离鉴定及主要成分肿瘤光生物活性的研究.第二军医大学学报，1991，12：208.
3.曾径泽，编著.生物药物分析.北京：中国医药科技出版社，1990.19～26.
4.曾衍霖.药物代谢动力学.见：徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982.441～445.
5.Meyer MC, Guttman DE. The binding of drugs by plasma protein. J Pharm Sci, 1968, 57：895.
6.施新猷，主编.医用动物实验方法.北京：人民卫生出版社，1989.18.
7.南开大学实验动物解剖学编写组.实验动物解剖学.北京：高等教育出版社，1974.59.
8.Rosenthal HE. A graphic method for the determination and presentation of binding parameters in a complex system. Anal Biochem, 1967, 20：525.
(1997年6月7日收稿 同年9月15日修回), 百拇医药
单位：上海市第二军医大学“五二三”药物研究所
关键词：血啉甲醚；血浆蛋白结合率；结合参数；平衡透析法
中国激光医学杂志980308The Binding of Hematoporphyrin Monomethyl
Ether to Plasma Proteins
Yu Jianxin, Chen Wenhui, Xu Deyu
“523” Institute of Medicinal Chemistry, The Second Military Medical University, Shanghai(200433)
, http://www.100md.com
摘要 为研究血啉甲醚(HMME)与小鼠血浆的蛋白结合率及HMME与血浆蛋白的结合参数，用平衡透析法测定蛋白结合率，HMME浓度用标准曲线法求出。HMME血浆浓度在19.4 μg/ml～297.6 μg/ml时血浆蛋白结合率为93.5%～76.3%，血浆蛋白结合参数：最大结合力(β)为8.7×10-6mol/g；解离常数(Kdp)为4.24×10-5mol/L；结合常数(K)为2.84×104 L/mol；结合部位数(N)为1.492。表明HMME与小鼠血浆蛋白具有单一类型的结合部位，药物血浆浓度升高结合率下降。
ABSTRACT
To elucidate the binding of hematoporphyrin monomethyl ether (HMME) to plasma protein of mice and evaluate the binding parameters, the binding rate of HMME to plasma protein was determined by equilibrium dialysis method. Concentration of HMME was assayed by standard curve method. The binding rate of HMME to plasma protein was found to be 93.5%-76.3% varying with the concentration of HMME in plasma from 19.4 μg/ml-297.6 μg/ml. The binding parameters were 8.7×10-6mol/g for β; 4.24×10-5mol/L for Kdp; 2.84×104 L/mol for K and 1.492 for N. There were single-typed binding sites for HMME to plasma protein of mice. Moreover plasma concentration of HMME was inversely proportional to the binding rate.
, 百拇医药
Key words Hematoporphyrin monomethyl ether, Plasma protein binding rate, Binding parameters, Equilibrium dialysis
血啉甲醚(Hematoporphyrin monome-thyl ether, HMME)是一种可能的理想光动力治癌新药。已知其为混合卟啉制剂癌光啉[1]治疗肿瘤的主要光生物活性成分，对体外培养HeLa细胞具有较高的光灭活作用，对动物移植瘤的光动力治疗作用亦不低于HpD[2]。与目前国内临床使用的卟啉类制剂相比，血啉甲醚具有结构明确、毒性低、对肿瘤有较好的光动力杀伤作用等优点。目前有关该药的临床前实验研究已接近完成。
药物血浆蛋白结合率是药物动力学的重要参数之一，是新药临床评价不可缺少的指标[3]。本文报道血啉甲醚与血浆蛋白结合的实验研究结果。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、试剂与仪器
血啉甲醚注射液：本室研制提供，规格10 mg/ml，批号931035；XW-80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂生产)；半透膜(购自上海试剂商店)；MPF型荧光分光光度计(日本日立)。荧光测定条件：激发光波长395 nm，狭缝10 nm；发射光波长613 nm，狭缝5 nm，工作电压750V。
二、血浆
昆明株小鼠断头取血，肝素抗凝，即时离心，分离血浆。
三、血浆蛋白结合率的测定方法
采用平衡透析法测定[4]。在9.5 ml透析液(含0.15 mol/L氯化钠的0.2 mol/L磷酸缓冲液，pH7.4)中加入一定浓度的药液0.5 ml。半透膜袋内加入血浆2.0 ml。调整袋内、外液面在同一水平上，置冰箱内平衡透析90 h(温度约4℃)。透析后用磺酸水杨酸试剂检查袋外透析液有无蛋白质漏出，有漏出者作废。
, 百拇医药
分别吸取袋内血浆和袋外缓冲液各0.2 ml，加入1.8 ml的0.1 mol/L HCl—5%NaCl溶液，置旋涡混合器上振荡提取，离心10 min。吸取上清液适量，以0.1 mol/L NaOH溶液稀释至线性范围，荧光分光光度法测定其浓度。除实验样本外，另以2.0 ml透析液代替血浆，操作同上，作为时间对照样，以确定药物从袋内向袋外自由扩散达到平衡所需的时间。
四、线性关系及回收率测定
取小鼠血浆和缓冲液各8份，每份2 ml，分别加入不同量的血啉甲醚混匀，使成一系列浓度，置冰箱放置约90 h，按上述实验方法提取，稀释，测定荧光强度。平行重复5次。以荧光强度对药物浓度进行线性回归，同时测定与上述浓度相同的血啉甲醚的NaOH溶液的荧光强度，计算回收率。
五、数据计算
(一)蛋白结合率：待药物扩散达到平衡后，分别测得透析袋内血浆药物浓度(总浓度Dt)及袋外缓冲液药物浓度(游离浓度Df)。根据公式(1)求得药物的血浆蛋白结合率[4]。
, 百拇医药
(1)
(二)结合参数：将前述方法测得的Dt及Df，按公式(2)(3)分别求出药物—蛋白复合物的解离常数Kdp和蛋白对药物的最大结合能力β，药物与蛋白质的结合常数K和结合部位数N[5]。
(2)
(3)
式中P：蛋白浓度(g/L)，小鼠的P值取55 g/L[6]。Db=Dt-Df，系与蛋白结合的药物浓度。Pt：白蛋白摩尔浓度，小鼠血清白蛋白含量取20 g/L[7]。白蛋白分子量68 000。血啉甲醚分子量612。
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结 果
一、线性关系与回收率
药物—缓冲液和药物—血浆按上述测定方法处理后，其荧光光谱见图1。两者激发光谱和发射光谱完全一致。最大激发波长395 nm，最大发射波长613 nm。表明经蛋白结合后提取，HMME的结构没有改变。
将实验测得的荧光强度分别对缓冲液中的HMME浓度和血浆中HMME浓度进行线性回归。回归方程分别为：
缓冲液：y=0.724+200.93x(r=0.999 9)
线性范围：6.4×10-4 μg/ml
血浆：y=1.429+135.29x(r=0.999)
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线性范围：1.2×10-3 μg/ml
在线性测定范围内，HMME—缓冲液回收率100%，HMME—血浆回收率大于75%。日内测定的变异系数CV=0.80%。
图1 缓冲液中与血浆中HMME荧光光谱A 激发光谱 B发射光谱
———缓冲液中HMME ------血浆中HMME
Fig.1 Fluorescence spectrum of HMME in buffer and in plasmaA：Exitation spectrum，B：Emission spectrum，———HMME in buffer, ------HMME in plasma
, http://www.100md.com
二、HMME与血浆蛋白的结合率
(一)透析平衡时间的确定：在透析袋内以磷酸缓冲液代替血浆，按上述方法测得不同时间袋内、袋外的HMME浓度。以两者浓度比对时间的关系做图，得图2。可见HMME透析达到平衡约需90小时。
(二)蛋白结合率：透析平衡后测定袋内、外HMME浓度，分别测定4次，计算不同浓度下的蛋白结合率。见附表。有非常显著性差异(P<0.01)。
附表 血浆药物浓度和血浆蛋白结合率
Tab.1 HMME concentration of plasma and its plasma protein binding rate(
±s, μg/ml) 编号, http://www.100md.com
No.
HMME
结合率
Protein
binding rate
(%)
透析袋内
Inside dialysis
bag
透析袋外
Outside dialysis
bag
, 百拇医药
1
19.40±1.81
1.26±0.18
93.5±0.4
2
43.90±8.00
4.26±2.63
90.3±7.4
3
109.90±16.82
15.97±3.91
85.5±3.3
, 百拇医药
4
194.15±47.80
34.98±1.92
82.1±5.2
5
297.60±8.49
70.40±17.35
76.4±3.2
图2 袋内与袋外HMME之比随时间的变化
, 百拇医药
Fig.2 Ratios of HMME inside and outside the dialysis bag versus time
(三)HMME与血浆蛋白结合参数
将上述五种不同浓度的HMME平衡透析后测得的Df和Db，根据公式(2)(3)进行直线回归。求得β值为8.7×10-6mol/g，Kdp值为4.24×10-5mol/L，K为2.84×104L/mol以及N为1.492。
讨 论
由公式(2)和(3)线性回归为一直线(P≤0.01，呈非常显著相关)，提示HMME与小鼠血浆蛋白具有单一类型的结合部位[8]。故可按公式(4)
, http://www.100md.com
(4)
用β和Kdp两个参数求得任意浓度下血浆蛋白质游离率(fu)和结合率(fb)。实验结果表明，HMME与血浆蛋白的结合率与浓度有关。浓度高，结合率下降，结合部位趋于饱和，游离HMME浓度升高。故临床应用此药时，由于游离HMME浓度与给药剂量不成线性关系，当给予病人较大剂量时，游离HMME浓度提高很快，所以有可能引起光毒反应。我们实验室对病人进行静脉滴注，使其保持较低的HMME浓度，同时给予光照治疗，取得较好的效果。由于目前国内临床使用的肿瘤光动力药物均为复杂的混合卟啉制剂，无法准确测定其与血浆蛋白的结合率。HMME为我国独立研制的一种组成单一、结构明确的肿瘤光动力治疗新药。其与小鼠血浆蛋白结合的研究对临床给药有一定的参考意义。
参 考 文 献
1.许德余，殷祥生，陈文晖，等.肿瘤光化学诊治新药癌光啉(PsD-007)的研究.中国医药工业杂志，1989，20：440.
, 百拇医药
2.陈文晖，许德余.癌光啉成分的分离鉴定及主要成分肿瘤光生物活性的研究.第二军医大学学报，1991，12：208.
3.曾径泽，编著.生物药物分析.北京：中国医药科技出版社，1990.19～26.
4.曾衍霖.药物代谢动力学.见：徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982.441～445.
5.Meyer MC, Guttman DE. The binding of drugs by plasma protein. J Pharm Sci, 1968, 57：895.
6.施新猷，主编.医用动物实验方法.北京：人民卫生出版社，1989.18.
7.南开大学实验动物解剖学编写组.实验动物解剖学.北京：高等教育出版社，1974.59.
8.Rosenthal HE. A graphic method for the determination and presentation of binding parameters in a complex system. Anal Biochem, 1967, 20：525.
(1997年6月7日收稿 同年9月15日修回), 百拇医药