体外伤口收缩模型收缩机理的研究
作者：时安平 罗力生 张立宪
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院整形外科
关键词：成纤维细胞；胶原网架；伤口收缩；体外模型
980306.htm 【摘要】 目的 探讨体外伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架(FPCL)收缩的可能机理。方法 利用光镜及扫描电镜对FPCL的收缩进行动态观察。结果 FPCL的收缩是由成纤维细胞产生的一种牵拉力而引起，该力是一种复合式动力，由细胞突起的延伸运动与细胞浆内的收缩结构共同产生。结论 FPCL收缩的机理支持了有关伤口收缩机理的“牵拉”理论。
Research on the contraction mechanism of an in vitro wound contraction model Shi Anping,Luo Lisheng,Zhang Lixian.Department of Plastic Surgery ,Nanfang Hospital, First Military Medical University. Guangzhou 510515
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To approach the mechanism of contraction of an in vitro wound contraction model-fibroblast populated collagen lattice (FPCL).Methods The authors observed the process of FPCL dynamic contraction with both light microscopy and scanning electron microscopy. Results FPCL contraction is due to the traction force generated by fibroblasts. The traction force is a compound force exerted by extension of cellular pseudopod and contractile structure in cytoplasm.Conclusion The mechanism of FPCL contraction proves the theory of “traction”.
, 百拇医药
【key words】 Fibroblast populated Collagen lattice Wound contraction In vitro model
伤口收缩是开放性伤口愈合的典型特征。许多学者为探明伤口收缩的机理进行了大量的研究，并形成了众多的理论。1979年，Bell[1]提出一种具有结缔组织样结构的“含成纤维细胞的胶原网架(Fibroblast Populated Collagen Lattice,FPCL)”系统，其本质是将成纤维细胞培养在胶原纤维构成的基质网架中。由于这一系统含有成纤维细胞与胶原基质，并能产生一种类似人体伤口收缩的过程，因此，该系统可以用作研究伤口收缩的体外模型。但关于FPCL收缩的机理论述不多，目前各家意见也不统一。本实验用光镜和电镜对FPCL收缩中的成纤维细胞与胶原基质的相互作用进行动态观察，探讨其收缩机理，为临床利用该模型进行伤口收缩研究提供参考。
材料与方法
, 百拇医药
一、细胞培养
应用组织块法进行成纤维细胞的原代培养，取新鲜成人皮肤组织，在少量小牛血清中剪碎，组织块(0.5～1 mm3)接种于培养瓶，5 %二氧化碳，37℃，饱和湿度条件下培养8～10小时，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，然后加入适量含30 %小牛血清的DMEM(Dulbeco's modified minimal essential medium)，继续培养，每3天换液1次。3～4周后，原代培养细胞生成细胞单层。用0.25 %胰蛋白酶消化后，再传代培养，实验用第6～10代细胞。
二、胶原的提取[2]
取成人皮肤组织200 g，剪成小块，浸泡于0.5 M/L 乙酸中，加入胃蛋白酶，溶液中酶浓度为2 mg/ml。持续搅拌24小时。离心45分钟。于上清液中加入胃蛋白酶抑制剂对NaH2PO充分透析至有沉淀形成，然后再离心，弃去上清，所得沉淀为Ⅰ、Ⅲ型胶原混合物。将沉淀冻干，称重，溶于1m M/L HCL溶液中，配成5 mg/ml 的胶原溶液，4 ℃冰箱中储存备用。
, 百拇医药
三、FPCL的制备
将第6～10代指数生长期细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞悬液浓度为2.5×105个细胞/ml。按照细胞0.5 ml∶CMEM液0.8 ml∶小牛血清0.2 ml∶胶原0.5 ml的比例将细胞等4种成份快速均匀混合，形成成纤维细胞胶原混悬液，并立即将该混悬液移入直径为35 mm培养皿中，置37℃培养箱内10分钟后混悬液形成凝胶，每皿加入0.5 ml含10 %小牛血清的DMEM液，使凝胶与培养皿表面分离。
四、观察指标
1.相差显微镜观察：定期在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞与胶原纤维在FPCL收缩过程中的动态变化情况。
2.扫描电镜观察：在FPCL形成1、6、24小时及6天后，分别取凝胶块1块，用0.001M/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，然后置于2.5 %戊二醛中固定24小时，脱水漂洗，树脂固定，喷银，于S450扫描电镜下观察在胶原基质中的细胞形态变化及胶原纤维重组与排列情况。
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结 果
一、相差显微镜下观察所见
在凝胶块中，成纤维细胞不像在二维培养中那样迅速沉淀，其位置相对固定，并很快粘附在胶原网架中。刚开始时，经酶消化的细胞呈圆形，凝胶块不收缩。4小时后，圆形的细胞逐渐伸展延长成较多胞质突起，外观似星芒状(图1a)。继而突起减少，在两极形成较长且大的突起，细胞变为长梭形，在胶原基质中，细胞散乱地分布在不同层次，无明显极性排列，并可观察到细胞周围胶原呈放射状分布(图1b)。从细胞发出突起后的24小时之内，凝胶块发生快速收缩，面积缩小50 %以上，这一段时间为FPCL的快速收缩时相。随着凝胶块的进一步收缩，细胞变得致密，形态难以分辩，细胞及胶原纤维呈明显的平行极性排列趋势(图1c)，这一段时间为FPCL的慢速收缩时相。
图1a FPCL形成后4小时，成纤维细胞出现较多胞质突起，外观似星芒状 LM 10×1
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图1b 细胞变为长梭形，周围胶原纤维呈放射状分布 LM 20×1.5
图1c 收缩后期细胞与胶原纤维呈明显极性排列 LM 10×1.5
二、扫描电镜下观察所见
不同时间的FPCL扫描电镜下的形态学特点与相差显微镜下所见略同，当圆形的细胞刚置入胶原网架上，胶原纤维呈松散无序的结构(图2a)；随后细胞逐渐向两侧伸出突起，表面有胶原粘附斑出现，周围可见胶原纤维粘附(图2b)；细胞继续延长为双极的长梭形，将周围的胶原纤维牵拉成放射状排列(图2c)；最后细胞完全包埋在胶原基质中，胶原纤维更加致密，呈现与细胞长轴平行的有序排列(图2d)。
, http://www.100md.com 图2a 圆形的细胞刚置入胶原网架上 SEM×4 000
图2b 细胞表面出现胶原粘附斑，可见胶原纤维粘附 SEM×4 000
讨 论
伤口收缩机理的理论，目前主要有两种[3]：“相框”理论，认为伤口收缩是由于伤口边缘的细胞向伤口内迁移时，将伤口边缘的皮肤向中央拉拢；“牵拉”理论，认为伤口内的细胞在基质中运动时产生一种牵拉力，从而使伤口缘向中央收缩。这两种理论都把细胞作为伤口收缩的原动力。
图2c 细胞周围胶原纤维呈放射状排列 SEM×4 000
, 百拇医药
图2d 细胞被胶原纤维包埋，胶原纤维与细胞长轴平行排列 SEM×4 000
FPCL系统的组成与结构和伤口中的结缔组织十分相似，且能逼真地再现伤口收缩与组织重塑的过程。因此，探讨FPCL收缩的机理，能在一定程度上反映伤收缩的机理。
我们在实验中观察到FPCL中胶原块收缩的动力是来自成纤维细胞。当球形的成纤维细胞在胶原基质中开始发出星芒状突起到伸出伪足时，细胞周围的胶原纤维先呈现松散无序的堆积状态，继而出现放射状排列，整个凝胶块的收缩开始发生。因此，FPCL的收缩是与成纤维细胞的延展运动相伴随，快速收缩时相其实是成纤维细胞的突起快速向两极延伸所致。随着凝胶块的进一步收缩，胶原纤维与细胞变得致密，细胞周围的胶原纤维与细胞发生粘附聚合，细胞的运动受到抑制，FPCL收缩减慢，此时的成纤维细胞仍呈双极的长梭形，而胶原纤维也逐渐完成了它的重组过程，与细胞长轴呈现平行的排列极性，进入FPCL慢速收缩时相。有研究表明[4]，细胞与胶原基质的粘附，主要靠纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)介导。我们从实验中也看到细胞表面有粘附斑出现，表明细胞分泌的FN介导了这种细胞与基质的粘附。随着细胞突起的延长与扩展，细胞周围粘附的胶原纤维被进一步牵拉。由此可见，胶原纤维的收缩和重组主要是由于细胞在运动中产生的牵拉力所致。
, 百拇医药
这种牵拉力是否完全由于细胞突起的延伸运动所产生?Grinnel[5]曾通过透射电镜观察FPCL，发现胶原纤维在细胞周边部位有许多结合位点，对应的细胞浆内有许多结构出现了变化，如：微丝在与收缩平行的方向发生聚合排列，部分插入到与胶原纤维相粘连的细胞浆膜内，并有含肌球蛋白特征的致密斑及微管出现。我们认为，这些胞浆内具有收缩力的结构汇集在细胞周边，说明细胞内部也参与了这种牵拉力的产生。细胞浆内的收缩结构可以通过基底膜、缝隙连接及细胞与基质的接触点将收缩力传导到与细胞粘附的胶原纤维束，将胶原纤维向细胞进一步牵拉，以抵抗胶原纤维由于收缩而产生的张力，使得胶原纤维的收缩状态得以维持，这种牵拉力在慢速收缩时相中显得更为重要。
综上所述，我们认为，在有关伤口收缩机理的理论中，“牵拉”理论可能较为合理。这种牵拉不但是随着细胞形态的变化而变化，而且和细胞内部的结构有关。
参考文献
, http://www.100md.com 1 Bell E,Ivarsson B,Merrill C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattic by human fibroblast of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76:1274.
2 李玉瑞主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社,1988.181-183.
3 Robert T T, Murray J D. Mechanistic model of wound contraction. J Surg Res, 1993,55:233.
4 林彭年,杨力.纤维结合蛋白在伤口愈合中的作用.国外医学.创伤与外科基本问题分册,1989,2：132.
5 Grinnell F, Lamker C R. Reorganization of hydrated collagen lattices by human skin fibroblast. J Cell Sci,1984,66:51.
(收稿：1997-12-23 修回：1998-05-28), http://www.100md.com
单位：510515 广州，第一军医大学南方医院整形外科
关键词：成纤维细胞；胶原网架；伤口收缩；体外模型
980306.htm 【摘要】 目的 探讨体外伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架(FPCL)收缩的可能机理。方法 利用光镜及扫描电镜对FPCL的收缩进行动态观察。结果 FPCL的收缩是由成纤维细胞产生的一种牵拉力而引起，该力是一种复合式动力，由细胞突起的延伸运动与细胞浆内的收缩结构共同产生。结论 FPCL收缩的机理支持了有关伤口收缩机理的“牵拉”理论。
Research on the contraction mechanism of an in vitro wound contraction model Shi Anping,Luo Lisheng,Zhang Lixian.Department of Plastic Surgery ,Nanfang Hospital, First Military Medical University. Guangzhou 510515
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【Abstract】 Objective To approach the mechanism of contraction of an in vitro wound contraction model-fibroblast populated collagen lattice (FPCL).Methods The authors observed the process of FPCL dynamic contraction with both light microscopy and scanning electron microscopy. Results FPCL contraction is due to the traction force generated by fibroblasts. The traction force is a compound force exerted by extension of cellular pseudopod and contractile structure in cytoplasm.Conclusion The mechanism of FPCL contraction proves the theory of “traction”.
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【key words】 Fibroblast populated Collagen lattice Wound contraction In vitro model
伤口收缩是开放性伤口愈合的典型特征。许多学者为探明伤口收缩的机理进行了大量的研究，并形成了众多的理论。1979年，Bell[1]提出一种具有结缔组织样结构的“含成纤维细胞的胶原网架(Fibroblast Populated Collagen Lattice,FPCL)”系统，其本质是将成纤维细胞培养在胶原纤维构成的基质网架中。由于这一系统含有成纤维细胞与胶原基质，并能产生一种类似人体伤口收缩的过程，因此，该系统可以用作研究伤口收缩的体外模型。但关于FPCL收缩的机理论述不多，目前各家意见也不统一。本实验用光镜和电镜对FPCL收缩中的成纤维细胞与胶原基质的相互作用进行动态观察，探讨其收缩机理，为临床利用该模型进行伤口收缩研究提供参考。
材料与方法
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一、细胞培养
应用组织块法进行成纤维细胞的原代培养，取新鲜成人皮肤组织，在少量小牛血清中剪碎，组织块(0.5～1 mm3)接种于培养瓶，5 %二氧化碳，37℃，饱和湿度条件下培养8～10小时，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，然后加入适量含30 %小牛血清的DMEM(Dulbeco's modified minimal essential medium)，继续培养，每3天换液1次。3～4周后，原代培养细胞生成细胞单层。用0.25 %胰蛋白酶消化后，再传代培养，实验用第6～10代细胞。
二、胶原的提取[2]
取成人皮肤组织200 g，剪成小块，浸泡于0.5 M/L 乙酸中，加入胃蛋白酶，溶液中酶浓度为2 mg/ml。持续搅拌24小时。离心45分钟。于上清液中加入胃蛋白酶抑制剂对NaH2PO充分透析至有沉淀形成，然后再离心，弃去上清，所得沉淀为Ⅰ、Ⅲ型胶原混合物。将沉淀冻干，称重，溶于1m M/L HCL溶液中，配成5 mg/ml 的胶原溶液，4 ℃冰箱中储存备用。
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三、FPCL的制备
将第6～10代指数生长期细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，调整细胞悬液浓度为2.5×105个细胞/ml。按照细胞0.5 ml∶CMEM液0.8 ml∶小牛血清0.2 ml∶胶原0.5 ml的比例将细胞等4种成份快速均匀混合，形成成纤维细胞胶原混悬液，并立即将该混悬液移入直径为35 mm培养皿中，置37℃培养箱内10分钟后混悬液形成凝胶，每皿加入0.5 ml含10 %小牛血清的DMEM液，使凝胶与培养皿表面分离。
四、观察指标
1.相差显微镜观察：定期在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞与胶原纤维在FPCL收缩过程中的动态变化情况。
2.扫描电镜观察：在FPCL形成1、6、24小时及6天后，分别取凝胶块1块，用0.001M/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，然后置于2.5 %戊二醛中固定24小时，脱水漂洗，树脂固定，喷银，于S450扫描电镜下观察在胶原基质中的细胞形态变化及胶原纤维重组与排列情况。
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结 果
一、相差显微镜下观察所见
在凝胶块中，成纤维细胞不像在二维培养中那样迅速沉淀，其位置相对固定，并很快粘附在胶原网架中。刚开始时，经酶消化的细胞呈圆形，凝胶块不收缩。4小时后，圆形的细胞逐渐伸展延长成较多胞质突起，外观似星芒状(图1a)。继而突起减少，在两极形成较长且大的突起，细胞变为长梭形，在胶原基质中，细胞散乱地分布在不同层次，无明显极性排列，并可观察到细胞周围胶原呈放射状分布(图1b)。从细胞发出突起后的24小时之内，凝胶块发生快速收缩，面积缩小50 %以上，这一段时间为FPCL的快速收缩时相。随着凝胶块的进一步收缩，细胞变得致密，形态难以分辩，细胞及胶原纤维呈明显的平行极性排列趋势(图1c)，这一段时间为FPCL的慢速收缩时相。
图1a FPCL形成后4小时，成纤维细胞出现较多胞质突起，外观似星芒状 LM 10×1
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图1b 细胞变为长梭形，周围胶原纤维呈放射状分布 LM 20×1.5
图1c 收缩后期细胞与胶原纤维呈明显极性排列 LM 10×1.5
二、扫描电镜下观察所见
不同时间的FPCL扫描电镜下的形态学特点与相差显微镜下所见略同，当圆形的细胞刚置入胶原网架上，胶原纤维呈松散无序的结构(图2a)；随后细胞逐渐向两侧伸出突起，表面有胶原粘附斑出现，周围可见胶原纤维粘附(图2b)；细胞继续延长为双极的长梭形，将周围的胶原纤维牵拉成放射状排列(图2c)；最后细胞完全包埋在胶原基质中，胶原纤维更加致密，呈现与细胞长轴平行的有序排列(图2d)。
, http://www.100md.com 图2a 圆形的细胞刚置入胶原网架上 SEM×4 000
图2b 细胞表面出现胶原粘附斑，可见胶原纤维粘附 SEM×4 000
讨 论
伤口收缩机理的理论，目前主要有两种[3]：“相框”理论，认为伤口收缩是由于伤口边缘的细胞向伤口内迁移时，将伤口边缘的皮肤向中央拉拢；“牵拉”理论，认为伤口内的细胞在基质中运动时产生一种牵拉力，从而使伤口缘向中央收缩。这两种理论都把细胞作为伤口收缩的原动力。
图2c 细胞周围胶原纤维呈放射状排列 SEM×4 000
, 百拇医药
图2d 细胞被胶原纤维包埋，胶原纤维与细胞长轴平行排列 SEM×4 000
FPCL系统的组成与结构和伤口中的结缔组织十分相似，且能逼真地再现伤口收缩与组织重塑的过程。因此，探讨FPCL收缩的机理，能在一定程度上反映伤收缩的机理。
我们在实验中观察到FPCL中胶原块收缩的动力是来自成纤维细胞。当球形的成纤维细胞在胶原基质中开始发出星芒状突起到伸出伪足时，细胞周围的胶原纤维先呈现松散无序的堆积状态，继而出现放射状排列，整个凝胶块的收缩开始发生。因此，FPCL的收缩是与成纤维细胞的延展运动相伴随，快速收缩时相其实是成纤维细胞的突起快速向两极延伸所致。随着凝胶块的进一步收缩，胶原纤维与细胞变得致密，细胞周围的胶原纤维与细胞发生粘附聚合，细胞的运动受到抑制，FPCL收缩减慢，此时的成纤维细胞仍呈双极的长梭形，而胶原纤维也逐渐完成了它的重组过程，与细胞长轴呈现平行的排列极性，进入FPCL慢速收缩时相。有研究表明[4]，细胞与胶原基质的粘附，主要靠纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)介导。我们从实验中也看到细胞表面有粘附斑出现，表明细胞分泌的FN介导了这种细胞与基质的粘附。随着细胞突起的延长与扩展，细胞周围粘附的胶原纤维被进一步牵拉。由此可见，胶原纤维的收缩和重组主要是由于细胞在运动中产生的牵拉力所致。
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这种牵拉力是否完全由于细胞突起的延伸运动所产生?Grinnel[5]曾通过透射电镜观察FPCL，发现胶原纤维在细胞周边部位有许多结合位点，对应的细胞浆内有许多结构出现了变化，如：微丝在与收缩平行的方向发生聚合排列，部分插入到与胶原纤维相粘连的细胞浆膜内，并有含肌球蛋白特征的致密斑及微管出现。我们认为，这些胞浆内具有收缩力的结构汇集在细胞周边，说明细胞内部也参与了这种牵拉力的产生。细胞浆内的收缩结构可以通过基底膜、缝隙连接及细胞与基质的接触点将收缩力传导到与细胞粘附的胶原纤维束，将胶原纤维向细胞进一步牵拉，以抵抗胶原纤维由于收缩而产生的张力，使得胶原纤维的收缩状态得以维持，这种牵拉力在慢速收缩时相中显得更为重要。
综上所述，我们认为，在有关伤口收缩机理的理论中，“牵拉”理论可能较为合理。这种牵拉不但是随着细胞形态的变化而变化，而且和细胞内部的结构有关。
参考文献
, http://www.100md.com 1 Bell E,Ivarsson B,Merrill C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattic by human fibroblast of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76:1274.
2 李玉瑞主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社,1988.181-183.
3 Robert T T, Murray J D. Mechanistic model of wound contraction. J Surg Res, 1993,55:233.
4 林彭年,杨力.纤维结合蛋白在伤口愈合中的作用.国外医学.创伤与外科基本问题分册,1989,2：132.
5 Grinnell F, Lamker C R. Reorganization of hydrated collagen lattices by human skin fibroblast. J Cell Sci,1984,66:51.
(收稿：1997-12-23 修回：1998-05-28), http://www.100md.com