一种改良的腺病毒DNA的纯化方法
作者：张陵林 张欣樵
单位：100052 北京 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志980336 属于DNA病毒的腺病毒，已有40多年的研究历史，目前作为有效的病毒载体在基因治疗和基因疫苗研究中有良好的应用前景。腺病毒的分离纯化是研究腺病毒的基本技术，近年来我们在研究中，对常规的方法进行一些改进，简化了步骤，提高了收获率。现以4型腺病毒(Ad4)为例将该法报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料来源 A549细胞为人肺癌细胞系购自ATCC(美国组织细胞培养收集中心)，批号F-10669，第77代，经增菌培养检定无支原体等污染。病毒毒种为Ad4疫苗株，来自美国Wyeth公司四型腺病毒糖丸疫苗，批号为Ad4HK1(88325).CsCL和三氯三氟乙烷(即氟利昂)均为国产分析纯，购自北京化学试剂商店。MEM、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、胰蛋白酶液、Verson液及NaHCO3等，均由病毒所供应室提供。
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1.2 Ad4的培养及收获 细胞成片的大方瓶以Hanks液洗2次，以5-10mol/L接种四型腺病毒毒种液，37℃吸附2小时，每20分钟摇1次，补维持液至8ml。37℃孵育至90%以上细胞出现细胞病变，-20℃冻化3次后，以Amercon正压滤器超滤浓缩，超声波破碎处理后，加等量氟利昂(Fluka产Geaetron 113,或北京亚太化工公司产1，1，2一三氯-1，1，2，三氟乙烷)充分振摇约1分钟，4℃8 000r/min离心15分钟，吸水相重复处理2次。
1.3 Ad4的超速离心 ①垫层离心：取Servall离心机Th64转头用离心管，每管底部垫1.30g/cm3CsCL液1.5ml，1.4g/cm3CsCL液1.5ml，上层约加8.0ml病毒液，36000r/min，4℃离心2小时，吸取位于管下1/3(约1.35g/cm3)处的病毒带。②平衡离心：取Beckman TLX-120台式超速离心机TLS-55型转头用离心管，底部加0.5mll.35g/cm3CsCL液，上层直接加1.7ml垫层离心所得病毒收带液，42000r/min,6℃离心18小时，吸取位于管中的病毒带。
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1.4 病毒DNA的制备 收获的病毒液对1升TE透析液(10mmol/LTris-HCI,lmmol/LEDTA,pH7.5)过夜透析，透析后的病毒液以PEG6000浓缩至适当体积，加蛋白酶K至终浓度50μg/ml,37℃2小时作用后，以等体积的酚抽提1次，酚一氯仿抽提1次，加1/10体积5ml/L NaCL溶液，2.5倍体积无水乙醇，-70℃15分钟沉淀，15000r/mim4℃离心15分钟，以冷无水乙醇洗涤沉淀DNA后，室温自然干燥，加适量无菌水溶解，-70℃贮存备用。
2 结果
使用本方法之前Ad4DNA的产量在50-60μg/6×108细胞以下，改进后一般的产量均在300-500μg/6×108细胞。用改良方法纯化的DNA的纯度与常规方法纯化的DNA纯度相同。使用改良方法纯化的DNA与文献中用常规纯化的等量(2μg)Ad4DNA与表达质粒DNA通过Lipofectin 共转染获得重组病毒成功。
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3 讨论
尽管建立腺病毒纯化及病毒DNA制备方法距今已有30多年。但我们在建立适合本实验室条件的操作程序仍耗费不少精力，尤其是初期走的主要弯路在于：如获取较高纯度病毒，进行连续CsCl梯度离心，造成病毒系列稀释，导致在1.35g/cm3梯度处病毒带丢失。其后，我们采用超滤浓缩，超声波彻底破碎细胞以及小体积进行平衡密度梯度离心等措施，所获病毒量及纯度均较令人满意。
常规的收获法是弃上清只收获细胞，但我们发现病毒培养液中含有相当量的腺病毒。故我们选择用Amecon滤器正压超滤病毒收获液。由于腺病毒颗粒在70～100nm，因此可选用截留高一些的滤膜(如30万的滤膜)。
超声处理一步有利于破碎细胞核，释放在细胞核中的病毒颗粒，可显著增加病毒产量。但在超离中有时可观察到在135g/cm3上方还有一条病毒带是由装配不完全的颗粒(Young particle)组成。另外用氟利昂处理可以除去大量杂蛋白，便于超离纯化，而且不会造成病毒的损失。
1998年3月11日收稿 6月12日修回, 百拇医药
单位：100052 北京 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志980336 属于DNA病毒的腺病毒，已有40多年的研究历史，目前作为有效的病毒载体在基因治疗和基因疫苗研究中有良好的应用前景。腺病毒的分离纯化是研究腺病毒的基本技术，近年来我们在研究中，对常规的方法进行一些改进，简化了步骤，提高了收获率。现以4型腺病毒(Ad4)为例将该法报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料来源 A549细胞为人肺癌细胞系购自ATCC(美国组织细胞培养收集中心)，批号F-10669，第77代，经增菌培养检定无支原体等污染。病毒毒种为Ad4疫苗株，来自美国Wyeth公司四型腺病毒糖丸疫苗，批号为Ad4HK1(88325).CsCL和三氯三氟乙烷(即氟利昂)均为国产分析纯，购自北京化学试剂商店。MEM、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、胰蛋白酶液、Verson液及NaHCO3等，均由病毒所供应室提供。
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1.2 Ad4的培养及收获 细胞成片的大方瓶以Hanks液洗2次，以5-10mol/L接种四型腺病毒毒种液，37℃吸附2小时，每20分钟摇1次，补维持液至8ml。37℃孵育至90%以上细胞出现细胞病变，-20℃冻化3次后，以Amercon正压滤器超滤浓缩，超声波破碎处理后，加等量氟利昂(Fluka产Geaetron 113,或北京亚太化工公司产1，1，2一三氯-1，1，2，三氟乙烷)充分振摇约1分钟，4℃8 000r/min离心15分钟，吸水相重复处理2次。
1.3 Ad4的超速离心 ①垫层离心：取Servall离心机Th64转头用离心管，每管底部垫1.30g/cm3CsCL液1.5ml，1.4g/cm3CsCL液1.5ml，上层约加8.0ml病毒液，36000r/min，4℃离心2小时，吸取位于管下1/3(约1.35g/cm3)处的病毒带。②平衡离心：取Beckman TLX-120台式超速离心机TLS-55型转头用离心管，底部加0.5mll.35g/cm3CsCL液，上层直接加1.7ml垫层离心所得病毒收带液，42000r/min,6℃离心18小时，吸取位于管中的病毒带。
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1.4 病毒DNA的制备 收获的病毒液对1升TE透析液(10mmol/LTris-HCI,lmmol/LEDTA,pH7.5)过夜透析，透析后的病毒液以PEG6000浓缩至适当体积，加蛋白酶K至终浓度50μg/ml,37℃2小时作用后，以等体积的酚抽提1次，酚一氯仿抽提1次，加1/10体积5ml/L NaCL溶液，2.5倍体积无水乙醇，-70℃15分钟沉淀，15000r/mim4℃离心15分钟，以冷无水乙醇洗涤沉淀DNA后，室温自然干燥，加适量无菌水溶解，-70℃贮存备用。
2 结果
使用本方法之前Ad4DNA的产量在50-60μg/6×108细胞以下，改进后一般的产量均在300-500μg/6×108细胞。用改良方法纯化的DNA的纯度与常规方法纯化的DNA纯度相同。使用改良方法纯化的DNA与文献中用常规纯化的等量(2μg)Ad4DNA与表达质粒DNA通过Lipofectin 共转染获得重组病毒成功。
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3 讨论
尽管建立腺病毒纯化及病毒DNA制备方法距今已有30多年。但我们在建立适合本实验室条件的操作程序仍耗费不少精力，尤其是初期走的主要弯路在于：如获取较高纯度病毒，进行连续CsCl梯度离心，造成病毒系列稀释，导致在1.35g/cm3梯度处病毒带丢失。其后，我们采用超滤浓缩，超声波彻底破碎细胞以及小体积进行平衡密度梯度离心等措施，所获病毒量及纯度均较令人满意。
常规的收获法是弃上清只收获细胞，但我们发现病毒培养液中含有相当量的腺病毒。故我们选择用Amecon滤器正压超滤病毒收获液。由于腺病毒颗粒在70～100nm，因此可选用截留高一些的滤膜(如30万的滤膜)。
超声处理一步有利于破碎细胞核，释放在细胞核中的病毒颗粒，可显著增加病毒产量。但在超离中有时可观察到在135g/cm3上方还有一条病毒带是由装配不完全的颗粒(Young particle)组成。另外用氟利昂处理可以除去大量杂蛋白，便于超离纯化，而且不会造成病毒的损失。
1998年3月11日收稿 6月12日修回, 百拇医药