从保定地区病人血清扩增出与76-118株同亚型的汉坦病毒的核苷酸及其序列分析
作者：陈宇萍 武涌泉 高国均 陈腾 马晓红 董建军 耿志洲 王华
单位：071000 保定 河北省保定市传染病医院(陈宇萍 武涌泉 高国均 陈腾 董建军 耿志洲)；中国预防医学科学院病毒学研究所(王华)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志980335 近年肾综合征出血热(HFRS)在保定地区流行，从1995年的54例增至1996年242例，为此我们对1996年保定市传染病医院收治的HFRS住院病人进行了列题研究，发现有两例为野鼠型(HTN)汉坦病毒感染，其中一例经扩增克隆及核苷酸序列测定其结果与韩国分离的76-118株在核苷酸序列上有着高度的同源性。现将分析研究报告如下。
1 材料和方法
1.1 一般材料 血清标本采自于1996年12月6日住院的一名HFRS患者(编号LBY)，男，54岁，安新县寨里乡农民，无外出打工史，地处水乡，发病第5天采集标本，HFRS临床分型重型。
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1.2 病毒RNA的提取 方法见文献〔1〕。
1.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 所用引物如下。第1组，引物5，1850-1866M(+)，组特异性，785bp；引物8，2634-2615M(-)；自行设计。第2组，引物6，1970-1984M(+)，组特异性，365bp；引物7，2384-2319M(-)，参考文献〔2〕设计。第3组，引物poi，256-282M(+)，poj，717-747M(-)，pi，270-291M(+)，pj，730-711M(-)，均为HTN型特异，461bp，参考文献〔1，3〕设计。第4组，引物pok，258-286M(+)，pol，746-719M(-)，pk，270-291M(+)，p1，730-711M(-)，SEO型特异，461bp，参考文献〔1，3〕设计。病人血清分型及病人血清直接克隆M基因组片段均使用套式RT-PCR方法。逆转录酶购于Promega公司，Taq酶购于中科院遗传所。引物均由中科院微生物所合成。PCR循环参数一般为94℃30～50秒；50℃～55℃40～60秒；72℃40～120秒。共30～35循环。
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1.4 PCR产物的纯化与克隆 使用低熔点琼脂糖凝胶/酚/氯仿抽提法回收PCR产物，用PGEM-T载体试剂盒 (购于Promega)对PCR产物进行克隆。用APQ I和PST I双酶切切下插入片段及用原PCR引物对重组质粒进行扩增来鉴定、筛选重组质粒。
1.5 DNA序列测定 用双脱氧未端终止法，试剂盒购于美国USB公司(Sequenase Version 2.0DNA Sequenciy kit)；使用双链模板，2mol/L NaOH硷变性。模板的提取使用Promega的Wizard Tm minipreps DNA纯化试剂盒。测序胶使用6%的含8mol/L尿素的变性PAGE凝胶。
1.6 序列资料分析 使用DNA sis和DNA软件。
2 结果
2.1 LBY 血清分型 LBY血清经套式RT-PCR分型为HTN型，见图1。
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图 1 套式RT-PCR对LBY 血标本分型结果
1：LBY血清+HTN型引物；2：LBY血清+SEO型引物；3：76-118+HTN型引物；4：76-118+SEO型引物；5：pBR322/BstNI
Fig.1 Serotyping of LBY by nested RT-PCR
1：LBY serum+HTN specific primers.2:LBY serum+SEO specific primers.3:76-118+HTN specific primers.4:76-118+SEO specific primers.5:pBR322/BstNI
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图 2 LBY血清经5-6，7-8引物套式PCR扩增结果
Fig. 2 Nested RT-PCR results of LBY serum amplified by primers 5-6 and primers 7-8
1:λDNA/HindⅢ marker. 2:76-118. 3:LBY.4:Negative control(阴性对照)
2.2 LBY部分核苷酸序列的分析。 LBY血清用5和8以及6和7引物进行套式PCR扩增，结果见图2。扩增出分子量特异的DNA片段。提纯LBY血清6和7引物扩增的特异性核苷酸片段，连接转化后用酶切和PCR扩增进行鉴定。1，4，8号质粒来源于LBY血清，经上述方法鉴定我们选取了1，4，8号三个重组质粒进行序列测定。M基因位于1996至2314位核苷酸及同国内外汉坦病毒HTN型代表株的核苷酸和氨基酸序列的同源性比较见图3和表1。上述结果可见LBY核苷酸及氨基酸序列与已知HTN型病毒具有较高的同源性，特别是与韩国的76-118株极为相似，其核苷酸同源性在98.7%；氨基酸同源性在100%。这表明该病人不仅为HTN型汉坦病毒感染，而且很可能与76-118株为同一亚型。
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3 讨论
76-118株为韩国分离的HTN型汉坦病毒的一个亚型。我们通过对LBY血清病毒M基因组部分核苷酸及氨基酸序列的测定，发现与76-118株在核苷酸及氨基酸序列上有着高度的同源性。其核苷酸同源性在98.7%，氨基酸同源性在100%。故我们认为很可能为同一亚型，国内尚未有关报道。为进一步证实，我们拟从基因组全序列进行测定研究。
表 1 核苷酸、氨基酸序列同源性比较(%)
Tab.1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of LBY,76-118 and A9(%)
LBY
76-118
A9
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nt
aa
nt
aa
nt
aa
LBY
100
100
76-118
98.7
100
100
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100
A9
87.15
96.23
86.7
95.45
100
100
图 3 LBY克隆片段的核苷酸序列与其它毒株核苷酸序列的比较
Fig.3 Sequence of LBY and comparison with that of other Hantaan strains参 考 文 献
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1 邱建明 ，董泽平，杭长寿，等.应用反转录-套式PCR方法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病毒特异性RNA.病毒学报，1997,13(2)：119-120.
2 Xiao S Y,Chu Y K,Fredrlek K K,et al.Comparison of hanhantavirus isolates using genus-reactive primer pair poly, merase chain reaction,J Gen Virol,1992,73:567-573.
3 Pilaipan P T,Lee H W,Kang C Y,et al.Typing of hantaviruses from five continents by PCR .Virus Research,1992,26:1-3.
1997年11月15日收稿 1988年4月14日修回, http://www.100md.com
单位：071000 保定 河北省保定市传染病医院(陈宇萍 武涌泉 高国均 陈腾 董建军 耿志洲)；中国预防医学科学院病毒学研究所(王华)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志980335 近年肾综合征出血热(HFRS)在保定地区流行，从1995年的54例增至1996年242例，为此我们对1996年保定市传染病医院收治的HFRS住院病人进行了列题研究，发现有两例为野鼠型(HTN)汉坦病毒感染，其中一例经扩增克隆及核苷酸序列测定其结果与韩国分离的76-118株在核苷酸序列上有着高度的同源性。现将分析研究报告如下。
1 材料和方法
1.1 一般材料 血清标本采自于1996年12月6日住院的一名HFRS患者(编号LBY)，男，54岁，安新县寨里乡农民，无外出打工史，地处水乡，发病第5天采集标本，HFRS临床分型重型。
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1.2 病毒RNA的提取 方法见文献〔1〕。
1.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 所用引物如下。第1组，引物5，1850-1866M(+)，组特异性，785bp；引物8，2634-2615M(-)；自行设计。第2组，引物6，1970-1984M(+)，组特异性，365bp；引物7，2384-2319M(-)，参考文献〔2〕设计。第3组，引物poi，256-282M(+)，poj，717-747M(-)，pi，270-291M(+)，pj，730-711M(-)，均为HTN型特异，461bp，参考文献〔1，3〕设计。第4组，引物pok，258-286M(+)，pol，746-719M(-)，pk，270-291M(+)，p1，730-711M(-)，SEO型特异，461bp，参考文献〔1，3〕设计。病人血清分型及病人血清直接克隆M基因组片段均使用套式RT-PCR方法。逆转录酶购于Promega公司，Taq酶购于中科院遗传所。引物均由中科院微生物所合成。PCR循环参数一般为94℃30～50秒；50℃～55℃40～60秒；72℃40～120秒。共30～35循环。
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1.4 PCR产物的纯化与克隆 使用低熔点琼脂糖凝胶/酚/氯仿抽提法回收PCR产物，用PGEM-T载体试剂盒 (购于Promega)对PCR产物进行克隆。用APQ I和PST I双酶切切下插入片段及用原PCR引物对重组质粒进行扩增来鉴定、筛选重组质粒。
1.5 DNA序列测定 用双脱氧未端终止法，试剂盒购于美国USB公司(Sequenase Version 2.0DNA Sequenciy kit)；使用双链模板，2mol/L NaOH硷变性。模板的提取使用Promega的Wizard Tm minipreps DNA纯化试剂盒。测序胶使用6%的含8mol/L尿素的变性PAGE凝胶。
1.6 序列资料分析 使用DNA sis和DNA软件。
2 结果
2.1 LBY 血清分型 LBY血清经套式RT-PCR分型为HTN型，见图1。
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图 1 套式RT-PCR对LBY 血标本分型结果
1：LBY血清+HTN型引物；2：LBY血清+SEO型引物；3：76-118+HTN型引物；4：76-118+SEO型引物；5：pBR322/BstNI
Fig.1 Serotyping of LBY by nested RT-PCR
1：LBY serum+HTN specific primers.2:LBY serum+SEO specific primers.3:76-118+HTN specific primers.4:76-118+SEO specific primers.5:pBR322/BstNI
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图 2 LBY血清经5-6，7-8引物套式PCR扩增结果
Fig. 2 Nested RT-PCR results of LBY serum amplified by primers 5-6 and primers 7-8
1:λDNA/HindⅢ marker. 2:76-118. 3:LBY.4:Negative control(阴性对照)
2.2 LBY部分核苷酸序列的分析。 LBY血清用5和8以及6和7引物进行套式PCR扩增，结果见图2。扩增出分子量特异的DNA片段。提纯LBY血清6和7引物扩增的特异性核苷酸片段，连接转化后用酶切和PCR扩增进行鉴定。1，4，8号质粒来源于LBY血清，经上述方法鉴定我们选取了1，4，8号三个重组质粒进行序列测定。M基因位于1996至2314位核苷酸及同国内外汉坦病毒HTN型代表株的核苷酸和氨基酸序列的同源性比较见图3和表1。上述结果可见LBY核苷酸及氨基酸序列与已知HTN型病毒具有较高的同源性，特别是与韩国的76-118株极为相似，其核苷酸同源性在98.7%；氨基酸同源性在100%。这表明该病人不仅为HTN型汉坦病毒感染，而且很可能与76-118株为同一亚型。
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3 讨论
76-118株为韩国分离的HTN型汉坦病毒的一个亚型。我们通过对LBY血清病毒M基因组部分核苷酸及氨基酸序列的测定，发现与76-118株在核苷酸及氨基酸序列上有着高度的同源性。其核苷酸同源性在98.7%，氨基酸同源性在100%。故我们认为很可能为同一亚型，国内尚未有关报道。为进一步证实，我们拟从基因组全序列进行测定研究。
表 1 核苷酸、氨基酸序列同源性比较(%)
Tab.1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of LBY,76-118 and A9(%)
LBY
76-118
A9
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LBY
100
100
76-118
98.7
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87.15
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86.7
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图 3 LBY克隆片段的核苷酸序列与其它毒株核苷酸序列的比较
Fig.3 Sequence of LBY and comparison with that of other Hantaan strains参 考 文 献
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1 邱建明 ，董泽平，杭长寿，等.应用反转录-套式PCR方法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病毒特异性RNA.病毒学报，1997,13(2)：119-120.
2 Xiao S Y,Chu Y K,Fredrlek K K,et al.Comparison of hanhantavirus isolates using genus-reactive primer pair poly, merase chain reaction,J Gen Virol,1992,73:567-573.
3 Pilaipan P T,Lee H W,Kang C Y,et al.Typing of hantaviruses from five continents by PCR .Virus Research,1992,26:1-3.
1997年11月15日收稿 1988年4月14日修回, http://www.100md.com