次声刺激诱导大鼠听中枢Fos蛋白的表达
作者：邢晓辉 陈景藻
单位：710032第四军医大学西京医院康复与理疗科
关键词：声刺激/副作用；听觉径路；大鼠
980312.htm 摘 要 目的 探讨次声对大鼠听中枢的作用机理。方法 将大鼠暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,作用1 d、7 d、14 d,应用免疫组织化学ABC法。结果 三个实验组听中枢各部位(耳蜗核、下丘、内侧膝状体、听皮质)Fos蛋白表达均比对照组明显增多,且7 d、14 d组Fos蛋白表达与1 d相比有所减少。结论 120 dB的次声能激活大鼠听中枢的神经元,而大鼠对重复次声的作用能产生适应性。
中图号 R339.16
Infrasonic Stimulation on Fos Protein Expression of Central Auditory Pathways Xing Xiaohui,Chen Jingzao.Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,710032
, 百拇医药
Abstract Objective To clarify the effects of infrasound on the central auditory pathways.Methods After exposed to infrasonic stimulation(8 Hz,120 dB)2 h/d for 1day,7days and 14 days,rats were sacrificed and Fos immunohistochemistry was processed.Results All three experimental groups showed significant increase of Fos protein in the cochlear nucleus,the inferior colliculus,the medial geniculate nucleus and the primary auditory cortex.Compared with the Fos expression as exposed only once,the repeated exposure resulted in obvious abrogation of Fos expression.Conclusion These results indicated that rats could adapt to the stimulation of infrasound on the repeated stimulus.
, 百拇医药
Key words acoustic stimulation/adv eff;auditory pathways;rats
次声是频率≤20 Hz的一种特殊声波,它广泛存在于各种环境中,其作用原理与可听声不同,人耳一般是听不到次声的。有关可听声的生物学效应的报道较多,而对次声的研究则很少。在本实验中,将大鼠暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,分别作用1 d、7 d、14 d后,观察在听中枢各部位(耳蜗核、下丘、内侧膝状体、听皮质)是否能引起Fos蛋白的表达?其表达的量是否有所变化?初步探讨次声对听中枢的作用机理。
材 料 与 方 法
成年健康的雄性SD大鼠21只,体重250～300 g。实验前一周将动物领回喂养,置于安静、室温20℃、自然光照的环境中喂养,避免各种刺激,以防止非特异性Fos蛋白表达。注意观察动物的健康状况,若发现状态不正常的动物,立即剔除。动物随机分为实验组和对照组。
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一、动物模型的制作
实验组动物置于次声压力仓内,分别暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,分为1 d组、7 d组和14 d组(每组n=6),动物暴露于次声的时间均固定在每天的15∶00～17∶00,三组动物在次声作用停止后均存活2 h再处死;在接受次声作用前将动物置于次声仓内适应2 h,实验过程中在次声仓内给一照明光源。
二、组织标本准备
动物均用1%戊巴比妥纳腹腔注射深度麻醉,开胸经主动脉灌注100 ml生理盐水,继而灌注4%多聚甲醛固定液(4℃)500 ml,维持1.5 h,取脑浸入20%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4 ℃),冰冻连续冠状切片,片厚30 μm,分别取耳蜗核、下丘、内侧膝状体和听皮质,切片隔5取1等间隔收集于PBS内。
三、免疫组织化学反应
, 百拇医药
用ABC法行Fos免疫组化反应:①切片放入含0.3%的H2O2-甲醇液(80%甲醇配制),维持0.5 h,室温下30 min,以封闭内源性过氧化物酶;②含0.3% Triton x-100的0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸泡30 min;③加入兔抗Fos血清(1∶1 000,北京中山公司),4 ℃,48 h;④加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶500,sigma),室温4 h;⑤加入卵白素——生物素结合HRP(1∶500,sigma),室温4 h;⑥以上各步间均用0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次;⑦葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法呈色,室温下反应20～30 min;⑧裱片、自然干燥、脱水、透明、封片。
Fos蛋白位于细胞核,用以上呈色方法显示免疫反应产物呈紫黑色,故阳性神经元的胞核呈紫黑色,胞浆不呈色。
四、对照组(n=3)
, 百拇医药
正常大鼠置于次声压力仓内2 h,不启动次声声源,从仓内取出存活2 h后直接灌注取材,作Fos免疫组化染色,方法同前。
五、结果观察
图象分析用Quantiment 570C(德国Leica公司)图象分析系统,采用灰度阈值法,计数Fos阳性神经元。实验数据以平均数(
)±标准差(s)表示。
结 果
一、空白对照组
动物的耳蜗核、下丘、内侧膝状体和听皮质均只有极少量的、染色很弱的Fos阳性神经元。
二、实验组
1d组大鼠听中枢各部位有大量Fos蛋白的表达,而7d组和14d组仅有少量Fos蛋白的表达,与1d组相比,Fos蛋白表达明显减少。借助图象分析系统,定量测定各实验组大鼠听中枢Fos阳性神经元数量:在20倍显微镜下,每只动物分别在耳蜗核、下丘、内侧膝状体、皮质听区切片随机选取六个视野,计录各个部位的Fos阳性神经元,算出各实验组每个部位Fos阳性神经元的总数,再求得其均数,结果见附表。
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附表 次声作用后大鼠听中枢Fos阳性
神经元计数(±s,n=6) 分组
Fos阳性神经元计数
耳蜗核
下丘
内侧膝状体
听皮质
实验组
6±2
15±3
14±5
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31±5
对照组
1 d
209±21*
265±22*
133±10*
761±33*
7 d
67±5*
84±7*
73±8*
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216±27*
14 d
88±13*
75±9*
81±11*
187±19*
注 与对照组比较 *P<0.01讨 论
c-fos这一脑内最主要的即早基因,作为第三信使,它可将短程刺激与长时程效应相藕联〔1〕。Fos可参与对多种形式的急性刺激的反应,这方面已有大量的文献报道;另外也有一些慢性、重复性刺激后有关Fos蛋白表达的报道〔2～4〕,如重复性的电惊厥、重复性的束缚应激等,在这些实验中Fos蛋白的表达与急性实验相比均有所降低。研究者认为即早基因反应的减弱是由于中枢神经系统对重复刺激产生了适应。在进一步的研究中,有学者发现:在慢性重复实验中,Fos蛋白表达减少,血浆糖皮质激素也是重要的影响因素之一〔5,6〕。
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次声可影响神经内分泌系统的活性,有文献报道:将大鼠暴露于16 Hz,120 dB的次声,从第三天开始,大鼠肾上腺功能提高,这种现象一直持续到实验结束的第28天〔7〕。我们认为:慢性或重复的次声作用,使血中的糖皮质激素水平升高,从而影响了继发应激诱导的Fos蛋白表达。分子生物学研究提示配体激活的糖皮激素受体,可结合于一个糖皮质激素反应元件序列,而此序列位于c-fos血清反应元件内,通过拮抗正性转录因子,如血清反应因子的功能,进而抑制c-fos启动子的激活〔8〕。因此,血中糖皮质激素可能是次声长时程作用后,使大鼠听中枢Fos表达减弱的影响因素之一。
从次声的作用原理看,它可直接作用于细胞膜或线粒体膜,从而影响细胞的形态或功能〔9〕,影响Ca2+泵等的功能,由此提示它也可能影响细胞内的信号转导。而Fos蛋白在第二信使和靶基因表达中起着桥梁的作用,第二信使系统的改变也可能影响Fos的表达。本实验中观察到:各实验组大鼠听中枢Fos蛋白表达均比对照组明显升高(P<0.01),这说明120 dB的次声作用足够强烈,使听中枢神经元被激活;而7 d组、14 d组重复次声刺激后,听中枢Fos蛋白表达较1 d组有所减弱,可能与听中枢内一些第二信使对刺激反应能力的改变有关。影响Fos表达的因素很多,次声作用于生物体的途径不是单一的,以上这些途径均可影响Fos的表达;并且Fos表达的量一定程度上与刺激的强度成正比,如果损害超过了一定的强度,则无Fos蛋白的表达〔10〕。7d组和14d组大鼠听中枢各部位Fos蛋白的表达与1d组相比虽然减少了,但其表达仍比对照组明显,这说明在上述次声作用条件下,并没有对实验动物产生严重的损害,大鼠有可能对这种刺激产生了适应。
, 百拇医药
重复次声作用后听中枢内的Fos蛋白的表达明显减少,提示可能有其它的转录因子在对重复次声作用的反应中起着更为重要的作用。另外不能排除这样一种可能性:即Fos蛋白的量虽然减少了,但其与靶基因位点结合力提高了,故仍起着重要的调节作用。有学者报道重复束缚应激实验能提高c-fos与目的基因多巴胺β-羟化酶启动子区调节元件的结合,进而使DBH mRNA水平升高〔11〕。总之,Fos蛋白在对次声的反应和调节中具有重要的作用。
参 考 文 献
1 Bullit E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.J Comp Neurol,1990,296(4):517.
2 Winston SM,Hayward MD,Nestler EJ.Chronic electroconvulsive seizures down-regulate expression of the immediate-early genes c-fos and c-jun in rat cerebral cortex.J Neurochem,1990,54:1920-1925.
, http://www.100md.com
3 Smith MA,Baneriee S,Cold PW,et al.Induction of c-fos mRNA in rat brain by conditioned and unconditioned stressors.Brain Res,1992,578:135-141.
4 Melia KR,Ryabinin AE,Schroeder R.Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.J Neurosci,1994,14:5929-5938.
5 Santa Umemoto,Koichi Noguchi.Repeated stress reduces the subsequent stress-induced expression of Fos in rat brain.Neuroscience Letters,1994,167:101-104.
, 百拇医药
6 Umemoto S.Chronic glucocorticoid administration as well as repeated stress the subsequent acute immobilization stress-induced expression of immediate early genes but not that of NGFI-A.Neuroscience,1997,80:763-773.
7 Shiraishi KM.Effects of long term exposure to infrasound on growth,activity,and urinary 17-OHCS levels in rats.J Low Frequency Noise and Vibration,1990,9:15-22.
8 Karagianni N,Tsawdaroglou N.The c-fos serum response element(SRE) confers negative response to glucocorticoids.Oncogene,1994,9:2327-2334.
, 百拇医药
9 陈景藻.次声的产生及生物学效应.医药卫生科学技术进展.中国人民解放军总后勤部卫生部编.北京:军事医学科学出版社,1997.194-197.
10 王艺东,黄如训.脑缺血后c-fos原癌基因表达的改变.国外医学脑血疾病分册,1996,4(5):269-272.
11 Nankova B,Devlin D.Repeated immobilization stress increases the binding of c-fos like proteins to a rat dopamine β-hydroxylase promoter enhancer sequence.J Neurochem,1993,61:776-779.
(收稿 1998-05-19), 百拇医药
单位：710032第四军医大学西京医院康复与理疗科
关键词：声刺激/副作用；听觉径路；大鼠
980312.htm 摘 要 目的 探讨次声对大鼠听中枢的作用机理。方法 将大鼠暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,作用1 d、7 d、14 d,应用免疫组织化学ABC法。结果 三个实验组听中枢各部位(耳蜗核、下丘、内侧膝状体、听皮质)Fos蛋白表达均比对照组明显增多,且7 d、14 d组Fos蛋白表达与1 d相比有所减少。结论 120 dB的次声能激活大鼠听中枢的神经元,而大鼠对重复次声的作用能产生适应性。
中图号 R339.16
Infrasonic Stimulation on Fos Protein Expression of Central Auditory Pathways Xing Xiaohui,Chen Jingzao.Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,710032
, 百拇医药
Abstract Objective To clarify the effects of infrasound on the central auditory pathways.Methods After exposed to infrasonic stimulation(8 Hz,120 dB)2 h/d for 1day,7days and 14 days,rats were sacrificed and Fos immunohistochemistry was processed.Results All three experimental groups showed significant increase of Fos protein in the cochlear nucleus,the inferior colliculus,the medial geniculate nucleus and the primary auditory cortex.Compared with the Fos expression as exposed only once,the repeated exposure resulted in obvious abrogation of Fos expression.Conclusion These results indicated that rats could adapt to the stimulation of infrasound on the repeated stimulus.
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Key words acoustic stimulation/adv eff;auditory pathways;rats
次声是频率≤20 Hz的一种特殊声波,它广泛存在于各种环境中,其作用原理与可听声不同,人耳一般是听不到次声的。有关可听声的生物学效应的报道较多,而对次声的研究则很少。在本实验中,将大鼠暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,分别作用1 d、7 d、14 d后,观察在听中枢各部位(耳蜗核、下丘、内侧膝状体、听皮质)是否能引起Fos蛋白的表达?其表达的量是否有所变化?初步探讨次声对听中枢的作用机理。
材 料 与 方 法
成年健康的雄性SD大鼠21只,体重250～300 g。实验前一周将动物领回喂养,置于安静、室温20℃、自然光照的环境中喂养,避免各种刺激,以防止非特异性Fos蛋白表达。注意观察动物的健康状况,若发现状态不正常的动物,立即剔除。动物随机分为实验组和对照组。
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一、动物模型的制作
实验组动物置于次声压力仓内,分别暴露于8 Hz,120 dB的次声,2 h/d,分为1 d组、7 d组和14 d组(每组n=6),动物暴露于次声的时间均固定在每天的15∶00～17∶00,三组动物在次声作用停止后均存活2 h再处死;在接受次声作用前将动物置于次声仓内适应2 h,实验过程中在次声仓内给一照明光源。
二、组织标本准备
动物均用1%戊巴比妥纳腹腔注射深度麻醉,开胸经主动脉灌注100 ml生理盐水,继而灌注4%多聚甲醛固定液(4℃)500 ml,维持1.5 h,取脑浸入20%蔗糖磷酸缓冲液中过夜(4 ℃),冰冻连续冠状切片,片厚30 μm,分别取耳蜗核、下丘、内侧膝状体和听皮质,切片隔5取1等间隔收集于PBS内。
三、免疫组织化学反应
, 百拇医药
用ABC法行Fos免疫组化反应:①切片放入含0.3%的H2O2-甲醇液(80%甲醇配制),维持0.5 h,室温下30 min,以封闭内源性过氧化物酶;②含0.3% Triton x-100的0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸泡30 min;③加入兔抗Fos血清(1∶1 000,北京中山公司),4 ℃,48 h;④加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶500,sigma),室温4 h;⑤加入卵白素——生物素结合HRP(1∶500,sigma),室温4 h;⑥以上各步间均用0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次;⑦葡萄糖-DAB-硫酸镍铵法呈色,室温下反应20～30 min;⑧裱片、自然干燥、脱水、透明、封片。
Fos蛋白位于细胞核,用以上呈色方法显示免疫反应产物呈紫黑色,故阳性神经元的胞核呈紫黑色,胞浆不呈色。
四、对照组(n=3)
, 百拇医药
正常大鼠置于次声压力仓内2 h,不启动次声声源,从仓内取出存活2 h后直接灌注取材,作Fos免疫组化染色,方法同前。
五、结果观察
图象分析用Quantiment 570C(德国Leica公司)图象分析系统,采用灰度阈值法,计数Fos阳性神经元。实验数据以平均数(
)±标准差(s)表示。结 果
一、空白对照组
动物的耳蜗核、下丘、内侧膝状体和听皮质均只有极少量的、染色很弱的Fos阳性神经元。
二、实验组
1d组大鼠听中枢各部位有大量Fos蛋白的表达,而7d组和14d组仅有少量Fos蛋白的表达,与1d组相比,Fos蛋白表达明显减少。借助图象分析系统,定量测定各实验组大鼠听中枢Fos阳性神经元数量:在20倍显微镜下,每只动物分别在耳蜗核、下丘、内侧膝状体、皮质听区切片随机选取六个视野,计录各个部位的Fos阳性神经元,算出各实验组每个部位Fos阳性神经元的总数,再求得其均数,结果见附表。
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附表 次声作用后大鼠听中枢Fos阳性
神经元计数(
±s,n=6) 分组Fos阳性神经元计数
耳蜗核
下丘
内侧膝状体
听皮质
实验组
6±2
15±3
14±5
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31±5
对照组
1 d
209±21*
265±22*
133±10*
761±33*
7 d
67±5*
84±7*
73±8*
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216±27*
14 d
88±13*
75±9*
81±11*
187±19*
注 与对照组比较 *P<0.01讨 论
c-fos这一脑内最主要的即早基因,作为第三信使,它可将短程刺激与长时程效应相藕联〔1〕。Fos可参与对多种形式的急性刺激的反应,这方面已有大量的文献报道;另外也有一些慢性、重复性刺激后有关Fos蛋白表达的报道〔2～4〕,如重复性的电惊厥、重复性的束缚应激等,在这些实验中Fos蛋白的表达与急性实验相比均有所降低。研究者认为即早基因反应的减弱是由于中枢神经系统对重复刺激产生了适应。在进一步的研究中,有学者发现:在慢性重复实验中,Fos蛋白表达减少,血浆糖皮质激素也是重要的影响因素之一〔5,6〕。
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次声可影响神经内分泌系统的活性,有文献报道:将大鼠暴露于16 Hz,120 dB的次声,从第三天开始,大鼠肾上腺功能提高,这种现象一直持续到实验结束的第28天〔7〕。我们认为:慢性或重复的次声作用,使血中的糖皮质激素水平升高,从而影响了继发应激诱导的Fos蛋白表达。分子生物学研究提示配体激活的糖皮激素受体,可结合于一个糖皮质激素反应元件序列,而此序列位于c-fos血清反应元件内,通过拮抗正性转录因子,如血清反应因子的功能,进而抑制c-fos启动子的激活〔8〕。因此,血中糖皮质激素可能是次声长时程作用后,使大鼠听中枢Fos表达减弱的影响因素之一。
从次声的作用原理看,它可直接作用于细胞膜或线粒体膜,从而影响细胞的形态或功能〔9〕,影响Ca2+泵等的功能,由此提示它也可能影响细胞内的信号转导。而Fos蛋白在第二信使和靶基因表达中起着桥梁的作用,第二信使系统的改变也可能影响Fos的表达。本实验中观察到:各实验组大鼠听中枢Fos蛋白表达均比对照组明显升高(P<0.01),这说明120 dB的次声作用足够强烈,使听中枢神经元被激活;而7 d组、14 d组重复次声刺激后,听中枢Fos蛋白表达较1 d组有所减弱,可能与听中枢内一些第二信使对刺激反应能力的改变有关。影响Fos表达的因素很多,次声作用于生物体的途径不是单一的,以上这些途径均可影响Fos的表达;并且Fos表达的量一定程度上与刺激的强度成正比,如果损害超过了一定的强度,则无Fos蛋白的表达〔10〕。7d组和14d组大鼠听中枢各部位Fos蛋白的表达与1d组相比虽然减少了,但其表达仍比对照组明显,这说明在上述次声作用条件下,并没有对实验动物产生严重的损害,大鼠有可能对这种刺激产生了适应。
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重复次声作用后听中枢内的Fos蛋白的表达明显减少,提示可能有其它的转录因子在对重复次声作用的反应中起着更为重要的作用。另外不能排除这样一种可能性:即Fos蛋白的量虽然减少了,但其与靶基因位点结合力提高了,故仍起着重要的调节作用。有学者报道重复束缚应激实验能提高c-fos与目的基因多巴胺β-羟化酶启动子区调节元件的结合,进而使DBH mRNA水平升高〔11〕。总之,Fos蛋白在对次声的反应和调节中具有重要的作用。
参 考 文 献
1 Bullit E.Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat.J Comp Neurol,1990,296(4):517.
2 Winston SM,Hayward MD,Nestler EJ.Chronic electroconvulsive seizures down-regulate expression of the immediate-early genes c-fos and c-jun in rat cerebral cortex.J Neurochem,1990,54:1920-1925.
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3 Smith MA,Baneriee S,Cold PW,et al.Induction of c-fos mRNA in rat brain by conditioned and unconditioned stressors.Brain Res,1992,578:135-141.
4 Melia KR,Ryabinin AE,Schroeder R.Induction and habituation of immediate early gene expression in rat brain by acute and repeated restraint stress.J Neurosci,1994,14:5929-5938.
5 Santa Umemoto,Koichi Noguchi.Repeated stress reduces the subsequent stress-induced expression of Fos in rat brain.Neuroscience Letters,1994,167:101-104.
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6 Umemoto S.Chronic glucocorticoid administration as well as repeated stress the subsequent acute immobilization stress-induced expression of immediate early genes but not that of NGFI-A.Neuroscience,1997,80:763-773.
7 Shiraishi KM.Effects of long term exposure to infrasound on growth,activity,and urinary 17-OHCS levels in rats.J Low Frequency Noise and Vibration,1990,9:15-22.
8 Karagianni N,Tsawdaroglou N.The c-fos serum response element(SRE) confers negative response to glucocorticoids.Oncogene,1994,9:2327-2334.
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9 陈景藻.次声的产生及生物学效应.医药卫生科学技术进展.中国人民解放军总后勤部卫生部编.北京:军事医学科学出版社,1997.194-197.
10 王艺东,黄如训.脑缺血后c-fos原癌基因表达的改变.国外医学脑血疾病分册,1996,4(5):269-272.
11 Nankova B,Devlin D.Repeated immobilization stress increases the binding of c-fos like proteins to a rat dopamine β-hydroxylase promoter enhancer sequence.J Neurochem,1993,61:776-779.
(收稿 1998-05-19), 百拇医药