氦-氖激光对人大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒影响的图像分析研究
作者：王文礼 袁维中 郑红 夏养志 辛士易
单位：010059 呼和浩特，内蒙古医学院
关键词：淋巴细胞/分析；细胞质颗粒/免疫学；天青染料；激光/标准；细胞学技术
980305.htm 摘 要 目的 探讨氦-氖(He-Ne)激光对人体的免疫刺激作用的机理。方法 用3.1 J/cm2、9.4 J/cm2、25.0 J/cm2和49.9 J/cm2剂量的He-Ne 激光分别在体外辐照人外周血,细胞化学方法显示大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒 ,并用图像分析系统对嗜天青颗粒作定量分析。结果 3.1 J/cm2辐照组的嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度 四项参数值与对照组比较无明显变化；9.4 J/cm2辐照组的四项参数值明显增高; 25.0 J/cm2辐照组的四项参数值进一步增高;49.9 J/cm2辐照组的四项参数值较25.0 J/cm2辐照组明显降低。结论 适当剂量的He-Ne激光能活化人大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒,提高机体的免疫功能;最适激光剂量的选择是临床应用中应考虑的一个重要因素。
, http://www.100md.com
中图号 R312
Image Analysis of He-Ne Laser Irradiation on Azurophilic Granule of Large Granular Lymphocytes in Human
Wang Wenli,Yuan Weizhong, Zheng Hong, et al. Department of Biochemistry, Inner Mongolia Medical College,Huhehot 010059
Abstract Objective To research He-Ne laser stimulating immunity of human.Methods The human peripheral blood was irradiated in vitro by 3.1 J/cm2, 9.4 J/cm2, 25.0 J/cm2 and 49.9 J/cm2 of He-Ne laser respectively.As the azurophilic granule of large granular lymphocytes was localized by a cytochemistry method, the image analysis system was adopted for quantitative analysis.Results The four indexes: number of azurophilic granule, area of granule, ratio of granule area to cell area and granule integral optical density at 3.1 J/cm2 of He-Ne laser irradiation group showed no difference in comparison with the control group.The indexes at 9.4 J/cm2 group showed significant increase,the indexes at 25.0 J/cm2 group showed more increase.But the indexes at 49.9 J/cm2 group showed obvious decrease in comparison with those of 25.0 J/cm2 group.Conclusion He-Ne laser at appropriate dose may activate the azurophilic granule of large granular lymphocytes, raise human immunity.
, 百拇医药
Key words lymphocytes/anal;cytoplasmic granules/immunol;azure stains;lasers/stand;cytological technics
激光对机体的免疫刺激作用是激光医学中的一个重要研究课题,国内外已见有关报道〔1,2〕, 但激光对人大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocytes, LGL)内起重要免疫杀伤作用的嗜天青颗粒(azurophilic granule)的影响尚未见报道。本文采用图像分析方法对体外人LGL细胞内的嗜天青颗粒作定量观察,分析不同氦-氖(He-Ne)激光辐照剂量对嗜天青颗粒的影响, 旨在探讨He-Ne激光对人体的免疫刺激作用的机理,为激光的临床应用提供免疫学依据。
材 料 和 方 法
一、细胞学样品
, 百拇医药
新鲜人外周血50例,由内蒙古中心血站供给。
二、激光辐照
将每例血标本分置于五只内径为0.8 cm的平底小玻璃管中,每管0.5 ml。 一管为对照组,其余四管为辐照组,用上海激光技术研究所1000B(c)He-Ne激光器辐照,波长632.8 nm，输出功率25 mW, 扩束散焦垂直辐照血标本一次,辐照功率20 mW,光斑直径0.7 cm,功率密度52 mW/cm2。四辐照组辐照时间分别为1、 3、8和16分钟。能量密度(剂量)分别为3.1 J/cm2、9.4 J/cm2、 25.0 J/cm2和49.9 J/cm2。
三、细胞化学方法
按Timonen提供的方法显示淋巴细胞内嗜天青颗粒〔3〕。凡胞浆内含紫红色颗粒,直径在10～16μm之间的大淋巴细胞即认定为LGL细胞。
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四、图像分析
用北京航空大学图像中心HI-CI型真彩色医用图象分析系统, 显微镜分辨率0.2 μm;图像分辨率512×512矩阵。于每组在1000倍光镜下随机选择50个LGL细胞,分别测定每个细胞内嗜天青颗粒的数目(GN)、颗粒面积(GA)、颗粒面积与细胞面积比值(GA/CA) 和颗粒积分光密度(IOD)四项参数值。各组每个被检测细胞的各项参数值输入微机作F检验。
结 果
一、细胞化学反应特点
在1000倍光镜下,于50例不同剂量辐照组及对照组外周血中均观察到LGL细胞。LGL细胞含有丰富浅染的胞浆,核呈肾形或有切迹。在浅兰色的胞浆内可见紫红色的嗜天青颗粒。颗粒大小不同,数量不等,着色深浅各异。
二、图像分析结果
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各组LGL细胞的四项参数值及F检验结果见附表。3.1 J/cm2辐照时, 嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数值与对照组比较差异无显著性;9.4 J/cm2和25.0 J/cm2较大剂量辐照时,这四项参数值逐组增高,差异有非常显著性;当剂量增大到49.9 J/cm2时, 四项参数值较25.0 J/cm2辐照组降低，差异有非常显著性。
附表 He-Ne激光对人大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒影响的图像分析结果(
±s,n=50) 观察项目
对照组
辐 照 组
3.1 J/cm2组
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9.4 J/cm2组
25.0 J/cm2组
49.9 J/cm2组
GN
8.02±0.22
8.10±0.18*
10.06±0.32**
12.11±0.25△
10.02±0.33△△
GA(100 μm2)
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1.68±0.16
1. 70±0.14*
2.31±0.17**
2.98 ±0.20△
2.30±0.18△△
GA/CA
0.017±0.002
0.017±0.003*
0.023±0.003**
0.030±0.002△
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0.023±0.001△△
IOD
0.46±0.10
0.47±0.12*
0.65±0.11**
0.84±0.14△
0.63±0.12△△
注 * 与对照组比较 P>0.05 ** 与对照组比较 P<0.01 △ 与9.4 J/cm2辐照组比较 P<0.01 △△ 与25.0 J/cm2辐照组比较 P<0.01
, 百拇医药
讨 论
LGL细胞是具有特殊形态和功能的免疫活性细胞,在免疫监视,免疫杀伤中起重要作用。该细胞在形态学和数量上与自然杀伤细胞(NK细胞)高度相关,能说明所有NK细胞活性〔3,4〕。据1988年第五次国际NK细胞专题讨论会的命名,NK细胞又称LGL细胞〔5〕。电子显微镜观察和细胞化学研究证实,LGL细胞浆内所含嗜天青颗粒就是溶酶体,内含酸性磷酸酶、 芳基硫酸酯酶和酸性α-醋酸萘酯酶等多种生物活性物质〔6〕。该颗粒的数量与NK细胞活性呈正相关,可作为评价机体自然杀伤免疫状态的一个重要指标〔7〕。
近年来, 计算机图像分析技术迅速向细胞学领域渗透。该技术具有快速、精确、可控制性和可重复性等特征, 可以客观地用数字未表达存在于标本中的各种信息, 使细胞学的定量研究产生质的飞跃〔8〕。 本实验采用图像分析法检测、比较嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数, 较检验细胞化学反应强度的等级法、显微分光光度计扫描法,可以更客观,更精确地定量分析不同剂量激光辐照时,LGL细胞内嗜天青颗粒的变化规律。其中积分光密度(integral optical density,IOD)是单独图像各素点分布的总和,以任意单位(Au)表示,可代表嗜天青颗粒内生物活性物质的相对含量, 是更具价值的指标。
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本实验结果表明,9.4 J/cm2和25.0 J/cm2剂量的He-Ne激光辐照使LGL细胞内嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数值升高，其中以25.0 J/cm2辐照组尤甚。表明适当剂量的He-Ne激光能使LGL细胞内嗜天青颗粒的数量增加,颗粒内的生物活性物质含量增多,增强LGL细胞的活性,从而提高机体的自然杀伤免疫功能。观察发现,小剂量3.1 J/cm2的He-Ne激光对LGL细胞内嗜天青颗粒无影响,大剂量49.9 J/cm2的He-Ne激光对嗜天青颗粒的活化作用较25.0 J/cm2辐照组明显减弱。这是本实验的一个有趣发现。Mester曾报道,适当剂量的He-Ne激光对生物体起刺激作用，超过一定剂量时则起抑制作用〔9〕。我们通过对LGL细胞内嗜天青颗粒的图像分析,在细胞学水平上也得到了与此相符的结果。如此看来, 最适激光辐照剂量的选择是激光临床应用中应该考虑的一个重要因素。本文是用激光直接辐照人离体血液,关于活体激光辐照的最适剂量及其对机体其它功能的影响尚需进一步探讨。
, 百拇医药
Abo根据NK细胞的表面型,将NK细胞分为三个亚群,即CD+56CD-3CD-11b、CD+56CD+3CD-11b和CD+56CD-3CD+11b。其中CD+56CD-3CD-11b细胞胞浆内嗜天青颗粒很少,NK活性很弱;CD+56CD+3CD-11b细胞胞浆内颗粒较多,NK活性较强;CD+56CD-3CD+11b细胞胞浆内颗粒最多,NK活性最强。这三个亚群分别代表了NK细胞的不同分化阶段〔10〕。推测,适当剂量的He-Ne激光的作用是促进NK细胞的分化、成熟,活性增强,表现为胞浆内嗜天青颗粒数量的增加,颗粒内生物活性物质的含量增多。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Goldman L.The biomedical laser technology and clinical applications.New York:Springer-verlay, 1981.229-230.
2 郑红,秦建中,辛士易,等.氦氖激光激活小鼠单核-巨噬细胞系统的实验研究. 中华理疗杂志,1990,13:1-3.
3 Timonen T,Saksela E. Isolation of human NK cells by density gradient centrifugation. J Immunol Methods, 1980,36:285-291.
4 Timonen T, Ortaldo JR, Herberman RB. Characteristics of human large granular lymphocytes and relationship to natural killer and killer cell. J Exp Med, 1981,153:569-582.
, 百拇医药
5 Hercend T,Schmidt RE. Characteristics and uses of natural killer cells. Immunol Today, 1988,9 :291-295.
6 Grosis CE, Cadoni A, Zicca A, et al. Large granular lymphocytes in human peripheral blood: ultrastructural and cytochemical characterization of the granules. Blood, 1982, 56:277-283.
7 Frydecka I, Slesak B, Benczur M. Heterogeneity of human natural killer cells with respect to lectin-binding ability. JNCI,1987,78:1145-1148.
, 百拇医药
8 徐根兴. 定量细胞学和细胞化学技术. 吉林: 吉林科技出版社,1993.5-6.
9 Mester E, Mester AF, Mester A. The biomedical effects of laser application. Laser Surg Med, 1985, 5:31-39.
10 Abo T, Cooper MD, Balch CM. Postnatal expansion of the natural killer and killer cell population in human identified by the monoclonal HNK-1 antibody. J Exp Med, 1982, 155:321-326.
(收稿 1996-04-15 修回 1998-03-30), 百拇医药
单位：010059 呼和浩特，内蒙古医学院
关键词：淋巴细胞/分析；细胞质颗粒/免疫学；天青染料；激光/标准；细胞学技术
980305.htm 摘 要 目的 探讨氦-氖(He-Ne)激光对人体的免疫刺激作用的机理。方法 用3.1 J/cm2、9.4 J/cm2、25.0 J/cm2和49.9 J/cm2剂量的He-Ne 激光分别在体外辐照人外周血,细胞化学方法显示大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒 ,并用图像分析系统对嗜天青颗粒作定量分析。结果 3.1 J/cm2辐照组的嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度 四项参数值与对照组比较无明显变化；9.4 J/cm2辐照组的四项参数值明显增高; 25.0 J/cm2辐照组的四项参数值进一步增高;49.9 J/cm2辐照组的四项参数值较25.0 J/cm2辐照组明显降低。结论 适当剂量的He-Ne激光能活化人大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒,提高机体的免疫功能;最适激光剂量的选择是临床应用中应考虑的一个重要因素。
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中图号 R312
Image Analysis of He-Ne Laser Irradiation on Azurophilic Granule of Large Granular Lymphocytes in Human
Wang Wenli,Yuan Weizhong, Zheng Hong, et al. Department of Biochemistry, Inner Mongolia Medical College,Huhehot 010059
Abstract Objective To research He-Ne laser stimulating immunity of human.Methods The human peripheral blood was irradiated in vitro by 3.1 J/cm2, 9.4 J/cm2, 25.0 J/cm2 and 49.9 J/cm2 of He-Ne laser respectively.As the azurophilic granule of large granular lymphocytes was localized by a cytochemistry method, the image analysis system was adopted for quantitative analysis.Results The four indexes: number of azurophilic granule, area of granule, ratio of granule area to cell area and granule integral optical density at 3.1 J/cm2 of He-Ne laser irradiation group showed no difference in comparison with the control group.The indexes at 9.4 J/cm2 group showed significant increase,the indexes at 25.0 J/cm2 group showed more increase.But the indexes at 49.9 J/cm2 group showed obvious decrease in comparison with those of 25.0 J/cm2 group.Conclusion He-Ne laser at appropriate dose may activate the azurophilic granule of large granular lymphocytes, raise human immunity.
, 百拇医药
Key words lymphocytes/anal;cytoplasmic granules/immunol;azure stains;lasers/stand;cytological technics
激光对机体的免疫刺激作用是激光医学中的一个重要研究课题,国内外已见有关报道〔1,2〕, 但激光对人大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocytes, LGL)内起重要免疫杀伤作用的嗜天青颗粒(azurophilic granule)的影响尚未见报道。本文采用图像分析方法对体外人LGL细胞内的嗜天青颗粒作定量观察,分析不同氦-氖(He-Ne)激光辐照剂量对嗜天青颗粒的影响, 旨在探讨He-Ne激光对人体的免疫刺激作用的机理,为激光的临床应用提供免疫学依据。
材 料 和 方 法
一、细胞学样品
, 百拇医药
新鲜人外周血50例,由内蒙古中心血站供给。
二、激光辐照
将每例血标本分置于五只内径为0.8 cm的平底小玻璃管中,每管0.5 ml。 一管为对照组,其余四管为辐照组,用上海激光技术研究所1000B(c)He-Ne激光器辐照,波长632.8 nm，输出功率25 mW, 扩束散焦垂直辐照血标本一次,辐照功率20 mW,光斑直径0.7 cm,功率密度52 mW/cm2。四辐照组辐照时间分别为1、 3、8和16分钟。能量密度(剂量)分别为3.1 J/cm2、9.4 J/cm2、 25.0 J/cm2和49.9 J/cm2。
三、细胞化学方法
按Timonen提供的方法显示淋巴细胞内嗜天青颗粒〔3〕。凡胞浆内含紫红色颗粒,直径在10～16μm之间的大淋巴细胞即认定为LGL细胞。
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四、图像分析
用北京航空大学图像中心HI-CI型真彩色医用图象分析系统, 显微镜分辨率0.2 μm;图像分辨率512×512矩阵。于每组在1000倍光镜下随机选择50个LGL细胞,分别测定每个细胞内嗜天青颗粒的数目(GN)、颗粒面积(GA)、颗粒面积与细胞面积比值(GA/CA) 和颗粒积分光密度(IOD)四项参数值。各组每个被检测细胞的各项参数值输入微机作F检验。
结 果
一、细胞化学反应特点
在1000倍光镜下,于50例不同剂量辐照组及对照组外周血中均观察到LGL细胞。LGL细胞含有丰富浅染的胞浆,核呈肾形或有切迹。在浅兰色的胞浆内可见紫红色的嗜天青颗粒。颗粒大小不同,数量不等,着色深浅各异。
二、图像分析结果
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各组LGL细胞的四项参数值及F检验结果见附表。3.1 J/cm2辐照时, 嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数值与对照组比较差异无显著性;9.4 J/cm2和25.0 J/cm2较大剂量辐照时,这四项参数值逐组增高,差异有非常显著性;当剂量增大到49.9 J/cm2时, 四项参数值较25.0 J/cm2辐照组降低，差异有非常显著性。
附表 He-Ne激光对人大颗粒淋巴细胞内嗜天青颗粒影响的图像分析结果(
±s,n=50) 观察项目对照组
辐 照 组
3.1 J/cm2组
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9.4 J/cm2组
25.0 J/cm2组
49.9 J/cm2组
GN
8.02±0.22
8.10±0.18*
10.06±0.32**
12.11±0.25△
10.02±0.33△△
GA(100 μm2)
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1.68±0.16
1. 70±0.14*
2.31±0.17**
2.98 ±0.20△
2.30±0.18△△
GA/CA
0.017±0.002
0.017±0.003*
0.023±0.003**
0.030±0.002△
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0.023±0.001△△
IOD
0.46±0.10
0.47±0.12*
0.65±0.11**
0.84±0.14△
0.63±0.12△△
注 * 与对照组比较 P>0.05 ** 与对照组比较 P<0.01 △ 与9.4 J/cm2辐照组比较 P<0.01 △△ 与25.0 J/cm2辐照组比较 P<0.01
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讨 论
LGL细胞是具有特殊形态和功能的免疫活性细胞,在免疫监视,免疫杀伤中起重要作用。该细胞在形态学和数量上与自然杀伤细胞(NK细胞)高度相关,能说明所有NK细胞活性〔3,4〕。据1988年第五次国际NK细胞专题讨论会的命名,NK细胞又称LGL细胞〔5〕。电子显微镜观察和细胞化学研究证实,LGL细胞浆内所含嗜天青颗粒就是溶酶体,内含酸性磷酸酶、 芳基硫酸酯酶和酸性α-醋酸萘酯酶等多种生物活性物质〔6〕。该颗粒的数量与NK细胞活性呈正相关,可作为评价机体自然杀伤免疫状态的一个重要指标〔7〕。
近年来, 计算机图像分析技术迅速向细胞学领域渗透。该技术具有快速、精确、可控制性和可重复性等特征, 可以客观地用数字未表达存在于标本中的各种信息, 使细胞学的定量研究产生质的飞跃〔8〕。 本实验采用图像分析法检测、比较嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数, 较检验细胞化学反应强度的等级法、显微分光光度计扫描法,可以更客观,更精确地定量分析不同剂量激光辐照时,LGL细胞内嗜天青颗粒的变化规律。其中积分光密度(integral optical density,IOD)是单独图像各素点分布的总和,以任意单位(Au)表示,可代表嗜天青颗粒内生物活性物质的相对含量, 是更具价值的指标。
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本实验结果表明,9.4 J/cm2和25.0 J/cm2剂量的He-Ne激光辐照使LGL细胞内嗜天青颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积比值和颗粒积分光密度四项参数值升高，其中以25.0 J/cm2辐照组尤甚。表明适当剂量的He-Ne激光能使LGL细胞内嗜天青颗粒的数量增加,颗粒内的生物活性物质含量增多,增强LGL细胞的活性,从而提高机体的自然杀伤免疫功能。观察发现,小剂量3.1 J/cm2的He-Ne激光对LGL细胞内嗜天青颗粒无影响,大剂量49.9 J/cm2的He-Ne激光对嗜天青颗粒的活化作用较25.0 J/cm2辐照组明显减弱。这是本实验的一个有趣发现。Mester曾报道,适当剂量的He-Ne激光对生物体起刺激作用，超过一定剂量时则起抑制作用〔9〕。我们通过对LGL细胞内嗜天青颗粒的图像分析,在细胞学水平上也得到了与此相符的结果。如此看来, 最适激光辐照剂量的选择是激光临床应用中应该考虑的一个重要因素。本文是用激光直接辐照人离体血液,关于活体激光辐照的最适剂量及其对机体其它功能的影响尚需进一步探讨。
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Abo根据NK细胞的表面型,将NK细胞分为三个亚群,即CD+56CD-3CD-11b、CD+56CD+3CD-11b和CD+56CD-3CD+11b。其中CD+56CD-3CD-11b细胞胞浆内嗜天青颗粒很少,NK活性很弱;CD+56CD+3CD-11b细胞胞浆内颗粒较多,NK活性较强;CD+56CD-3CD+11b细胞胞浆内颗粒最多,NK活性最强。这三个亚群分别代表了NK细胞的不同分化阶段〔10〕。推测,适当剂量的He-Ne激光的作用是促进NK细胞的分化、成熟,活性增强,表现为胞浆内嗜天青颗粒数量的增加,颗粒内生物活性物质的含量增多。
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参 考 文 献
1 Goldman L.The biomedical laser technology and clinical applications.New York:Springer-verlay, 1981.229-230.
2 郑红,秦建中,辛士易,等.氦氖激光激活小鼠单核-巨噬细胞系统的实验研究. 中华理疗杂志,1990,13:1-3.
3 Timonen T,Saksela E. Isolation of human NK cells by density gradient centrifugation. J Immunol Methods, 1980,36:285-291.
4 Timonen T, Ortaldo JR, Herberman RB. Characteristics of human large granular lymphocytes and relationship to natural killer and killer cell. J Exp Med, 1981,153:569-582.
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5 Hercend T,Schmidt RE. Characteristics and uses of natural killer cells. Immunol Today, 1988,9 :291-295.
6 Grosis CE, Cadoni A, Zicca A, et al. Large granular lymphocytes in human peripheral blood: ultrastructural and cytochemical characterization of the granules. Blood, 1982, 56:277-283.
7 Frydecka I, Slesak B, Benczur M. Heterogeneity of human natural killer cells with respect to lectin-binding ability. JNCI,1987,78:1145-1148.
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8 徐根兴. 定量细胞学和细胞化学技术. 吉林: 吉林科技出版社,1993.5-6.
9 Mester E, Mester AF, Mester A. The biomedical effects of laser application. Laser Surg Med, 1985, 5:31-39.
10 Abo T, Cooper MD, Balch CM. Postnatal expansion of the natural killer and killer cell population in human identified by the monoclonal HNK-1 antibody. J Exp Med, 1982, 155:321-326.
(收稿 1996-04-15 修回 1998-03-30), 百拇医药