人脑源性神经营养因子cDNA克隆及在酵母中的表达
作者：刘志敏 蓝正道△ 谢志伟△ 王笑辛△ 戚正武△ 朱 诚
单位：
关键词：人脑源性神经营养因子；基因表达；酿酒酵母
第二军医大学学报980405 摘要 目的：了解肝细胞生长因子(HGF)及其受体基因在人肝癌和癌旁肝组织中表达的变化规律，以及这种变化与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用地高辛标记的HGF及其受体DNA探针，检测26例人原发性肝癌及其癌旁肝组织中HGF及其受体基因的表达。结果：HGF在人肝癌和癌旁肝组织中虽都有表达，但阳性率不及其受体基因表达，HGF受体在肝癌和癌旁肝组织中均呈过度表达,且肝癌组织中杂交信号明显高于癌旁肝组织，有肝内外转移者其表达更高。结论：HGF受体基因过度表达与肝癌的转移密切相关，HGF及其受体系统对调节肿瘤生长、转移起重要作用。
中国图书资料分类法分类号 R735.7
, http://www.100md.com
The gene expression of hepatocyte growth factor and hepatocyte growth factor receptor in hepatocellular carcinoma tissue and
nontumourous liver tissue
Luo Yunquan, Wu Mengchao, Cong Wenming (Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University , Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the changes of gene expression of hepatocyte growth factor (HGF) and hepatocyte growth factor receptor (HGFr) in hepatocellular carcinoma(HCC) tissue and nontumourous liver tissue and the relationship between these changes and the biological behavior of the tumor. Methods: The gene expression of HGF and HGFr in 26 cases of HCC tissue and nontumourous liver tissue was determined with digoxigenin-labled DNA probes. Results: The positive expression of HGF in HCC tissue was similar to that in their adjacent nontumourous liver tissue, but the positive rate of HGF expression was lower than HGFr gene expression. However, in the cases of metastasis, HGFr expression were higher. We found over-expression of HGFr in HCC tissue and their adjacent nontumourous liver tissue. Conclusion: There is closely relationship between over-expression of HGFr gene and metastasis of tumor, and the HGF and HGFr system plays an important role in regulating tumor growth and metastasis.
, 百拇医药
Key words liver neoplasms; hepatocyte growth factor; receptors, hepatocyte growth factor; gene expression
在各种致癌因子引起的癌变中,基因突变是其发病的基础和本质,癌基因和抗癌基因的突变、生长因子与生长因子受体及染色体稳定性的改变是肿瘤产生的根本原因。本研究采用肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-met)基因的DNA探针，对26例人原发性肝癌及癌旁肝组织进行自身对照研究，从转录水平观察基因产物的表达情况，并探讨它们在肝癌发生和发展中的作用及意义。
1 材料和方法
1.1 标本 经病理证实为肝细胞癌及癌旁肝组织(距癌2 cm)26例，男22例，女4例，年龄34～63岁，平均年龄48.5岁。无菌操作下将手术切取的新鲜组织置液氮保存。
, http://www.100md.com
1.2 RNA抽提[1] 取组织块0.5 g加4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸纳、0.5% Sarcosyl, 5 ml 0.1 mol/L β-巯基乙醇溶液,置于干净离心管，冰浴中高速匀浆1～2 min；加入0.5 ml 2 mol/L NaAc(pH 4.0)、5 ml饱和酚、1 ml氯仿-异戊醇(49∶1),振荡混匀5 min，冰浴15 min。4℃ 9 200 r/min离心20 min。取上清加异丙醇5 ml，混匀，9 200 r/min离心20 min, -20℃沉淀2 h，2 200 r/min离心20 min,4℃,弃上清，沉淀用75%乙醇洗1次，真空干燥，RNA溶于0.5 ml经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水，于-70℃保存备用。
1.3 探针的制备与标记
1.3.1 探针的来源 HGF探针质粒由美国基因工程公司惠赠，HGF受体质粒(c-met质粒)由日本癌症研究资源基因库惠赠。
, 百拇医药
1.3.2 探针的制备与标记 参照文献[2]进行；HGF质粒经EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切得1.4 kb片段做探针，c-met质粒经EcoRⅠ-SalⅠ酶切后得1.6 kb片段做探针。标记按地高辛随机引物法进行。
1.4 RNA斑点杂交
1.4.1 杂交膜的制备 将10 μl RNA与下列溶液混合：100%甲酰胺20 μl, 37%甲醛7 μl, 20×SSC 2 μl,于68℃,15 min后立即入冰浴冷却，将变性RNA点在预先处理过的硝酸纤维膜上，每点10 μl(膜先水湿，后浸20×SSC 1 h),真空炉80℃干烤2 h，密封于塑料袋中备用。
1.4.2 杂交 具体方法参照地高辛DNA标记检测试剂盒说明进行。
1.5 原位分子杂交
1.5.1 载玻片的处理 载玻片用硫酸浸泡过夜，洗净，180℃干烤3 h，然后用白胶涂片，白胶中加入0.1% DEPC抑制RNA酶活性。
, http://www.100md.com
1.5.2 冷冻切片制作 切6 μm厚冷冻切片，冷风吹干后用4%多聚甲醛缓冲液固定10 min，梯度乙醇脱水，-70℃保存至临用前。
1.5.3 原位杂交程序 同样参照地高辛DNA标记检测试剂盒说明进行。
1.6 统计学处理 样本百分率比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 RNA斑点杂交结果 结果表明，HGF在肝癌(5/26)和癌旁组织(6/26)中都有表达，但表达阳性率不高，两组间无差异；c-met在肝癌和癌旁组织中都有较高表达，且癌组织(17/26)中表达高于癌旁组织(8/26)，两者差异显著(P<0.05,图1,2)。
, http://www.100md.com 图 1 人肝癌和癌旁组织RNA斑点杂交 (Dig-c-met)
Fig 1 The result of RNA dot blot of HCC and nontumourous liver tissue(Dig-c-met)
A: HCC; B: Nontumourous
图 2 人肝癌组织原位分子杂交(Dig-c-met)
Fig 2 The result of RNA ISH of HCC tissue (Dig-c-met)
2.2 原位杂交结果 原位杂交结果按阴性、弱、中和强分为4个等级(表1)，HGF基因在肝癌和癌旁组织中的阳性表达均不高；c-met基因则有较高的
, 百拇医药
表 1 肝癌和癌旁组织原位分子杂交结果
Tab 1 The results of RNA ISH of HCC tissue and
nontumourous liver tissue Group
n
HGF expression
c-met expression
N
W
M
S
N
, 百拇医药
W
M
S
HCC
26
20
2
3
1
9
1
6
10
Nontumourous
, 百拇医药
26
18
3
3
2
13
4
6
3
N=Negative; W=Weak(10%～20%); M=Midium(40%～60%); S=Strong(70%～80%)表达，这结果与斑点杂交近似，就其分布而言，HGF基因表达以弱和中等为主(图2)，而c-met基因则以中、强表达为主。
2.3 癌组织中c-met基因表达与肿瘤转移的关系
, 百拇医药
通过对比发现，伴有癌肿转移组(15/18)，c-met基因表达远远高于不伴肿瘤转移组(2/8)，两者比较有显著差异(P<0.01)。
3 讨 论
3.1 肝癌和癌旁组织中HGF及其受体基因表达的特点及意义 HGF具有广泛的生物学活性。新近研究还发现，HGF可抑制肝细胞癌细胞系生长，同时还抑制肝细胞癌系AFP基因的表达[3]。HGF受体为c-met癌基因产物，在许多肿瘤组织中c-met mRNA呈过量表达[4]。有关HGF及其受体基因在肝癌中的表达变化规律的研究，尚未见报道。本研究结果发现，HGF在肝癌和癌旁组织中虽都有表达，但阳性率远没有c-met基因表达阳性率高；c-met基因在肝癌和癌旁组织中都有很高的表达，且肿瘤组织中表达高于非肿瘤组织。c-met基因的这种表达方式与其在其他肿瘤组织中相似;HGF表达在肝癌和癌旁组织中无差异。在c-met基因高表达情况下，恶性肿瘤细胞对HGF的敏感性增高，只要有少许HGF便会引起明显反应，造成肿瘤的扩散和转移。因此，通过检测c-met基因表达，可以判定肿瘤的恶性度和预后。
, http://www.100md.com
3.2 c-met基因过量表达与肿瘤转移 研究表明，在正常组织中c-met mRNA浓度很低甚至测不出，但其相对应癌组织中则有很高表达值，原HGF阴性的细胞一旦感染，受HGF刺激后其受体可使该细胞活动并侵犯基底膜，具有高浓度HGF受体的恶性细胞对HGF的反应更为敏感和强烈[5]。研究发现，癌细胞具有c-met蛋白后转录加工的缺陷，而该蛋白的产生涉及190 kb原始基因的合成，c-met的α和β亚单位的裂解以及成熟HGF受体形成，需要HGF的结合[6]。某些癌细胞有裂解过程的缺陷，原始基因本身是活跃的，如癌细胞不裂解则失去受HGF控制，即使在无外源性HGF存在情况下，细胞活力也会增加。恶性肿瘤细胞上HGF受体表达与正常细胞明显不同，虽然在肝或肾切除后，正常细胞的HGF受体表达有暂时性增高，但在损伤后很快恢复正常。这是因为正常细胞和器官可以降低受体表达，具有控制对HGF的反应能力，而恶性肿瘤细胞持续有受体的过度表达，以致与HGF起过度反应,这就使得恶性细胞具有活动和侵犯的特点[7]。本研究发现，伴有癌转移者其c-met基因呈过度表达。c-met过度表达与肿瘤转移和侵润密切相关，HGF及其受体系统对调节肝肿瘤的生长和转移起重要作用。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162(1):156
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual .2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.1345～1356
3 Noguchi O, Enomoto N, Ikeda T, et al. Gene expressions of c-met and hepatocyte growth factor in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 1996, 24(3):286
, 百拇医药
4 Kaji M, Yonemura Y, Harada S, et al. Participation of c-met in the progression of human gastric cancers: anti-c-met oligonucleotides inhibit proliferation or invasiveness of gastric cancer cells. Cancer Gene Ther, 1996, 3(6):393
5 Jeffers M, Rong S, Woude GF. Hepatocyte growth factor/scatter factor-met signaling in tumorigenicity and invasion/metastasis. J Mol Med, 1996,74(9):505
6 Schirmacher P, Odenthal M, Steinberg P, et al. Growth factors in liver regeneration and hepatocarcinogenesis. Verh Dtsch Ges Pathol, 1995,79(1):55
7 Lamszus K, Jin L, Fuchs A, et al. Scatter factor stimulates tumor growth and tumor angiogenesis in human breast cancers in the mammary fat pads of nude mice. Lab Invest, 1997,76(3):339
(1997-11-03收稿; 1998-05-06修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：人脑源性神经营养因子；基因表达；酿酒酵母
第二军医大学学报980405 摘要 目的：了解肝细胞生长因子(HGF)及其受体基因在人肝癌和癌旁肝组织中表达的变化规律，以及这种变化与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用地高辛标记的HGF及其受体DNA探针，检测26例人原发性肝癌及其癌旁肝组织中HGF及其受体基因的表达。结果：HGF在人肝癌和癌旁肝组织中虽都有表达，但阳性率不及其受体基因表达，HGF受体在肝癌和癌旁肝组织中均呈过度表达,且肝癌组织中杂交信号明显高于癌旁肝组织，有肝内外转移者其表达更高。结论：HGF受体基因过度表达与肝癌的转移密切相关，HGF及其受体系统对调节肿瘤生长、转移起重要作用。
中国图书资料分类法分类号 R735.7
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The gene expression of hepatocyte growth factor and hepatocyte growth factor receptor in hepatocellular carcinoma tissue and
nontumourous liver tissue
Luo Yunquan, Wu Mengchao, Cong Wenming (Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second Military Medical University , Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the changes of gene expression of hepatocyte growth factor (HGF) and hepatocyte growth factor receptor (HGFr) in hepatocellular carcinoma(HCC) tissue and nontumourous liver tissue and the relationship between these changes and the biological behavior of the tumor. Methods: The gene expression of HGF and HGFr in 26 cases of HCC tissue and nontumourous liver tissue was determined with digoxigenin-labled DNA probes. Results: The positive expression of HGF in HCC tissue was similar to that in their adjacent nontumourous liver tissue, but the positive rate of HGF expression was lower than HGFr gene expression. However, in the cases of metastasis, HGFr expression were higher. We found over-expression of HGFr in HCC tissue and their adjacent nontumourous liver tissue. Conclusion: There is closely relationship between over-expression of HGFr gene and metastasis of tumor, and the HGF and HGFr system plays an important role in regulating tumor growth and metastasis.
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Key words liver neoplasms; hepatocyte growth factor; receptors, hepatocyte growth factor; gene expression
在各种致癌因子引起的癌变中,基因突变是其发病的基础和本质,癌基因和抗癌基因的突变、生长因子与生长因子受体及染色体稳定性的改变是肿瘤产生的根本原因。本研究采用肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-met)基因的DNA探针，对26例人原发性肝癌及癌旁肝组织进行自身对照研究，从转录水平观察基因产物的表达情况，并探讨它们在肝癌发生和发展中的作用及意义。
1 材料和方法
1.1 标本 经病理证实为肝细胞癌及癌旁肝组织(距癌2 cm)26例，男22例，女4例，年龄34～63岁，平均年龄48.5岁。无菌操作下将手术切取的新鲜组织置液氮保存。
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1.2 RNA抽提[1] 取组织块0.5 g加4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸纳、0.5% Sarcosyl, 5 ml 0.1 mol/L β-巯基乙醇溶液,置于干净离心管，冰浴中高速匀浆1～2 min；加入0.5 ml 2 mol/L NaAc(pH 4.0)、5 ml饱和酚、1 ml氯仿-异戊醇(49∶1),振荡混匀5 min，冰浴15 min。4℃ 9 200 r/min离心20 min。取上清加异丙醇5 ml，混匀，9 200 r/min离心20 min, -20℃沉淀2 h，2 200 r/min离心20 min,4℃,弃上清，沉淀用75%乙醇洗1次，真空干燥，RNA溶于0.5 ml经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水，于-70℃保存备用。
1.3 探针的制备与标记
1.3.1 探针的来源 HGF探针质粒由美国基因工程公司惠赠，HGF受体质粒(c-met质粒)由日本癌症研究资源基因库惠赠。
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1.3.2 探针的制备与标记 参照文献[2]进行；HGF质粒经EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切得1.4 kb片段做探针，c-met质粒经EcoRⅠ-SalⅠ酶切后得1.6 kb片段做探针。标记按地高辛随机引物法进行。
1.4 RNA斑点杂交
1.4.1 杂交膜的制备 将10 μl RNA与下列溶液混合：100%甲酰胺20 μl, 37%甲醛7 μl, 20×SSC 2 μl,于68℃,15 min后立即入冰浴冷却，将变性RNA点在预先处理过的硝酸纤维膜上，每点10 μl(膜先水湿，后浸20×SSC 1 h),真空炉80℃干烤2 h，密封于塑料袋中备用。
1.4.2 杂交 具体方法参照地高辛DNA标记检测试剂盒说明进行。
1.5 原位分子杂交
1.5.1 载玻片的处理 载玻片用硫酸浸泡过夜，洗净，180℃干烤3 h，然后用白胶涂片，白胶中加入0.1% DEPC抑制RNA酶活性。
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1.5.2 冷冻切片制作 切6 μm厚冷冻切片，冷风吹干后用4%多聚甲醛缓冲液固定10 min，梯度乙醇脱水，-70℃保存至临用前。
1.5.3 原位杂交程序 同样参照地高辛DNA标记检测试剂盒说明进行。
1.6 统计学处理 样本百分率比较采用χ2检验。
2 结 果
2.1 RNA斑点杂交结果 结果表明，HGF在肝癌(5/26)和癌旁组织(6/26)中都有表达，但表达阳性率不高，两组间无差异；c-met在肝癌和癌旁组织中都有较高表达，且癌组织(17/26)中表达高于癌旁组织(8/26)，两者差异显著(P<0.05,图1,2)。
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Fig 1 The result of RNA dot blot of HCC and nontumourous liver tissue(Dig-c-met)
A: HCC; B: Nontumourous
图 2 人肝癌组织原位分子杂交(Dig-c-met)
Fig 2 The result of RNA ISH of HCC tissue (Dig-c-met)
2.2 原位杂交结果 原位杂交结果按阴性、弱、中和强分为4个等级(表1)，HGF基因在肝癌和癌旁组织中的阳性表达均不高；c-met基因则有较高的
, 百拇医药
表 1 肝癌和癌旁组织原位分子杂交结果
Tab 1 The results of RNA ISH of HCC tissue and
nontumourous liver tissue Group
n
HGF expression
c-met expression
N
W
M
S
N
, 百拇医药
W
M
S
HCC
26
20
2
3
1
9
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6
10
Nontumourous
, 百拇医药
26
18
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2
13
4
6
3
N=Negative; W=Weak(10%～20%); M=Midium(40%～60%); S=Strong(70%～80%)表达，这结果与斑点杂交近似，就其分布而言，HGF基因表达以弱和中等为主(图2)，而c-met基因则以中、强表达为主。
2.3 癌组织中c-met基因表达与肿瘤转移的关系
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通过对比发现，伴有癌肿转移组(15/18)，c-met基因表达远远高于不伴肿瘤转移组(2/8)，两者比较有显著差异(P<0.01)。
3 讨 论
3.1 肝癌和癌旁组织中HGF及其受体基因表达的特点及意义 HGF具有广泛的生物学活性。新近研究还发现，HGF可抑制肝细胞癌细胞系生长，同时还抑制肝细胞癌系AFP基因的表达[3]。HGF受体为c-met癌基因产物，在许多肿瘤组织中c-met mRNA呈过量表达[4]。有关HGF及其受体基因在肝癌中的表达变化规律的研究，尚未见报道。本研究结果发现，HGF在肝癌和癌旁组织中虽都有表达，但阳性率远没有c-met基因表达阳性率高；c-met基因在肝癌和癌旁组织中都有很高的表达，且肿瘤组织中表达高于非肿瘤组织。c-met基因的这种表达方式与其在其他肿瘤组织中相似;HGF表达在肝癌和癌旁组织中无差异。在c-met基因高表达情况下，恶性肿瘤细胞对HGF的敏感性增高，只要有少许HGF便会引起明显反应，造成肿瘤的扩散和转移。因此，通过检测c-met基因表达，可以判定肿瘤的恶性度和预后。
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3.2 c-met基因过量表达与肿瘤转移 研究表明，在正常组织中c-met mRNA浓度很低甚至测不出，但其相对应癌组织中则有很高表达值，原HGF阴性的细胞一旦感染，受HGF刺激后其受体可使该细胞活动并侵犯基底膜，具有高浓度HGF受体的恶性细胞对HGF的反应更为敏感和强烈[5]。研究发现，癌细胞具有c-met蛋白后转录加工的缺陷，而该蛋白的产生涉及190 kb原始基因的合成，c-met的α和β亚单位的裂解以及成熟HGF受体形成，需要HGF的结合[6]。某些癌细胞有裂解过程的缺陷，原始基因本身是活跃的，如癌细胞不裂解则失去受HGF控制，即使在无外源性HGF存在情况下，细胞活力也会增加。恶性肿瘤细胞上HGF受体表达与正常细胞明显不同，虽然在肝或肾切除后，正常细胞的HGF受体表达有暂时性增高，但在损伤后很快恢复正常。这是因为正常细胞和器官可以降低受体表达，具有控制对HGF的反应能力，而恶性肿瘤细胞持续有受体的过度表达，以致与HGF起过度反应,这就使得恶性细胞具有活动和侵犯的特点[7]。本研究发现，伴有癌转移者其c-met基因呈过度表达。c-met过度表达与肿瘤转移和侵润密切相关，HGF及其受体系统对调节肝肿瘤的生长和转移起重要作用。
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参 考 文 献
1 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162(1):156
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual .2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.1345～1356
3 Noguchi O, Enomoto N, Ikeda T, et al. Gene expressions of c-met and hepatocyte growth factor in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 1996, 24(3):286
, 百拇医药
4 Kaji M, Yonemura Y, Harada S, et al. Participation of c-met in the progression of human gastric cancers: anti-c-met oligonucleotides inhibit proliferation or invasiveness of gastric cancer cells. Cancer Gene Ther, 1996, 3(6):393
5 Jeffers M, Rong S, Woude GF. Hepatocyte growth factor/scatter factor-met signaling in tumorigenicity and invasion/metastasis. J Mol Med, 1996,74(9):505
6 Schirmacher P, Odenthal M, Steinberg P, et al. Growth factors in liver regeneration and hepatocarcinogenesis. Verh Dtsch Ges Pathol, 1995,79(1):55
7 Lamszus K, Jin L, Fuchs A, et al. Scatter factor stimulates tumor growth and tumor angiogenesis in human breast cancers in the mammary fat pads of nude mice. Lab Invest, 1997,76(3):339
(1997-11-03收稿; 1998-05-06修回)
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