神经生长因子影响脊髓可塑性的实验研究△
作者：庞清江1 罗永湘2 李保文1 孔祥洪1
单位：1 滨州医学院附院骨科 256603 山东省滨州市；2 同济医科大学附属同济医院骨科
关键词：神经生长因子；脊髓可塑性；大鼠
中国脊柱脊髓杂志980407 摘要 目的：探讨神经生长因子对脊髓初级传入纤维侧支出芽有无促进作用。方法：切断SD大鼠脊髓左侧L1～L3、L5～L6脊神经背根，留L4作为备用根，硬膜下置入导管给予神经生长因子。应用酶组织化学与图像分析检测脊髓后角第Ⅱ板层无髓传入纤维终末标记物——抗氟化物酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase,FRAP)的活性变化。结果：生理盐水组手术侧L3节段第Ⅱ板层内FRAP含量在术后20d内逐渐减少，至术后50d见FRAP含量回升；神经生长因子组相应平面FRAP含量较生理盐水组明显增多。结论：神经生长因子对脊髓背根侧支出芽有促进作用。
, 百拇医药
Experimental studies on spinal plasticity effected by nerve growth factor/PANG Qingjiang LUO Yongxiang LI Baowen,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(4):201～202
Abstract Objective:To explore whether nerve growth factor(NGF) may stimulate the collateral sprouting of primary afferent fibers of spared root.Methods:L1～3 and L5～6dorsal roots of SD rat were cut,and L4 as the spared root.Enzyme histochemistry and image analysis were conducted for decteting the changes of the fluoride resistant acid phosphatase(FRAP) activity in the lamina.Results:In the normal saline(NS) group,the FRAP content at L3 was gradully reduced after operation,but on 50 days following operation,the FRAP content of L3 lamina Ⅱ began to increase;in NGF group,the FRAP content of L3 lamina was more larger than that of NS group.Conclusion:NGF may stimulate the collateral sprouting of spinal dorsal root.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopedics Affiliated Hospital,Binzhou Medical College,Shandong,256603
Key words Nerve growth factor Spinal plasticity Rat
许多实验证实哺乳类中枢神经系统具有可塑性变化，当某些部位受损伤后能引起邻近完好的神经纤维以侧支出芽方式长出新终末，并与去神经支配的靶细胞重建突触联系。这种可塑性改变了人们过去认为中枢神经系统缺乏再生的悲观看法。目前，有关脊髓可塑性研究较活跃，但有关神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对脊髓可塑性的影响研究尚属空白。为此，本课题选用研究脊髓可塑性常用模型——脊髓备用根模型〔1〕，术后经导管给予NGF，以探讨NGF对脊髓可塑性的影响。
, 百拇医药 1 材料与方法
SD大鼠35只，雌雄不限，体重200～250g，随机分成3组：NGF组(15只)、生理盐水(NS)组(15只)及正常组(5只)。NGF组与NS组鼠经0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，切断左侧L1～L3、L5～L6脊神经背根，保留左L4脊神经背根为备用根。硬膜下置入导管(内径0.8mm，外径1.2mm)。术后1、2、3、5、7、10d经导管，NGF组各注入NGF液0.10ml(含2.5s NGF 0.15mg)；NS组注入等量生理盐水作对照。术后10、20与50d两手术组各取5只大鼠及正常组鼠断头处死，以脊神经根为标志取L3脊髓节段。置10%甲醛(含1%氯化钙)中固定4～6h，再移入20%蔗糖磷酸缓冲液中，待组织下沉后，冰冻切片(20μm)。脊髓段共切9张，每切3张取1张用Gomori法(加0.2mmol/L NaF)染抗氧化物酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase,FRAP)〔2〕。切片经图像分析仪(TJTY-300)处理，分别测出每张切片两个脊髓后角胶状质内FRAP的积分光密度值(integrating optical density,IOD)，以代表FRAP含量。同切片FRAP的IOD值左右比较，求出L3左侧(手术侧)FRAP含量百分比，并经t检验。
, http://www.100md.com
2 结果
正常大鼠L 脊髓段FRAP阳性反应带位于后角胶状质(第Ⅱ板层)内,左右对称呈眉弓状(图1，插Ⅱ)。NS组手术侧L3节段FRAP含量术后减少，至术后20d达最低水平(图2，插Ⅱ)，术后50d见术侧FRAP含量回升。NGF组相应脊髓侧FRAP含量变化规律同NS组，但各检测点FRAP含量较NS组明显增高(图3，插Ⅱ)。两组FRAP含量差异有显著性意义(附表)。
附表 两组手术侧髓内FRAP含量比较
(
±s)(%)
NS组
NGF组
P值
, 百拇医药
术后10d
15.23±1.26
14.01±1.82
>0.05
术后20d
4.25±1.89
9.10±2.68
<0.01
术后50d
10.83±2.34
18.16±2.96
<0.05
, 百拇医药
3 讨论
3.1 脊髓备用根侧支出芽特点
Lin和Chambers(1958年)首次在哺乳类脊髓发现侧支出芽，证实脊髓具有可塑性。McNei等(1987年)借助备用根模型发现鼠初级传入纤维在脊髓内有侧支出芽，且出芽的纤维主要投向备用根的头侧〔1〕。本实验采用这一备用根模型，借助L3脊髓节段FRAP检测，发现术后50d两手术组术侧FRAP含量已见回升，NGF组FRAP含量高于NS组。这一结果进一步验证了备用根有侧支出芽的理论，并证实NGF有促进脊神经根初级传入纤维侧支出芽的作用。
3.2 检测FRAP研究脊髓可塑性的可靠性
FRAP在背根神经节小神经元内合成，仅经背根无髓传入神经纤维运送到脊髓第Ⅱ板层的复合终末内〔3〕，故FRAP可成为初级传入纤维的理想标记物〔4〕，又是研究脊髓可塑性的可靠指标〔1〕。借助FRAP仅经无髓传入纤维运输的特点可提示L 备用根发芽是源于背神经根内无髓纤维。
, 百拇医药
3.3 NGF促进背神经根侧支出芽的机制
有关NGF促进神经侧支出芽的机制目前还不十分清楚，可能与下述作用有关：(1)改变膜的流动性及表面结构，促进蛋白质合成及微管、微丝的形成与稳定〔5〕；(2)通过影响轴突生长锥和胶原细胞的相互作用〔6〕。本实验结果显示损伤能诱导成熟未损伤的感觉神经元侧支发芽，应用NGF能促进脊神经根侧支发芽，进一步证实NGF对脊髓的可塑性有显著影响。结合我们最近的研究〔7、8〕，提示NGF应用于脊髓损伤的治疗充满了希望。
4 参考文献
1 McNeill DL,Hulsebosch CE.Intraspinal sprouting of rat primary afferents after deafferentation.Neurosci Lett,1987,81:57.
, 百拇医药
2 Ainsworth A,Hall P,Wall PD,et al.Effects of capsaicin applied locally to adult peripheral nerve Ⅱ:anatomy and enzyme and peptide chemistry of peripheral nerve and spinal cord. Pain,1981,11:379.
3 Knyinhar E,Gerebtzoff MA.Extra-lysosomal location of acid phosphatase in the spinal cord of the rat.Exp Brain Res,1974,18:383。
4 Knyihar-Csillik E,Csillik G.FRAP:histochemistry of the primary nociceptive neuron.Prog Histochem Cytochem,1981,14:1.
, 百拇医药
5 Greene LA.The nerve growth factor biochemistry synthesis and mechanism of action.Ann Rev Neurosci,1980,3:353.
6 Pang Qingjiang,Luo Yongxiang,Wu Yangguan,et al.Experimental studies on periheral nerve regeneration enhanced by nerve growth factor.J Tongji Med Univ,1993,1:34.
7 庞清江,罗永湘,王继红.神经生长因子在脊髓损伤中的保护作用.中华实验外科杂志,1996,13(增刊):151.
8 庞清江,罗永湘.神经生长因子对脊髓前角运动神经元的保护作用.中华手外科杂志,1997,13(1):19.
△ 本课题为国家自然科学基金资助项目(C030306)收稿日期：1997-08-22 修回日期：1998-05-15
, 百拇医药(庞清江1 罗永湘2 李保文1 孔祥洪1)
单位：1 滨州医学院附院骨科 256603 山东省滨州市；2 同济医科大学附属同济医院骨科
关键词：神经生长因子；脊髓可塑性；大鼠
中国脊柱脊髓杂志980407 摘要 目的：探讨神经生长因子对脊髓初级传入纤维侧支出芽有无促进作用。方法：切断SD大鼠脊髓左侧L1～L3、L5～L6脊神经背根，留L4作为备用根，硬膜下置入导管给予神经生长因子。应用酶组织化学与图像分析检测脊髓后角第Ⅱ板层无髓传入纤维终末标记物——抗氟化物酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase,FRAP)的活性变化。结果：生理盐水组手术侧L3节段第Ⅱ板层内FRAP含量在术后20d内逐渐减少，至术后50d见FRAP含量回升；神经生长因子组相应平面FRAP含量较生理盐水组明显增多。结论：神经生长因子对脊髓背根侧支出芽有促进作用。
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Experimental studies on spinal plasticity effected by nerve growth factor/PANG Qingjiang LUO Yongxiang LI Baowen,et al//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(4):201～202
Abstract Objective:To explore whether nerve growth factor(NGF) may stimulate the collateral sprouting of primary afferent fibers of spared root.Methods:L1～3 and L5～6dorsal roots of SD rat were cut,and L4 as the spared root.Enzyme histochemistry and image analysis were conducted for decteting the changes of the fluoride resistant acid phosphatase(FRAP) activity in the lamina.Results:In the normal saline(NS) group,the FRAP content at L3 was gradully reduced after operation,but on 50 days following operation,the FRAP content of L3 lamina Ⅱ began to increase;in NGF group,the FRAP content of L3 lamina was more larger than that of NS group.Conclusion:NGF may stimulate the collateral sprouting of spinal dorsal root.
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Authors address Department of Orthopedics Affiliated Hospital,Binzhou Medical College,Shandong,256603
Key words Nerve growth factor Spinal plasticity Rat
许多实验证实哺乳类中枢神经系统具有可塑性变化，当某些部位受损伤后能引起邻近完好的神经纤维以侧支出芽方式长出新终末，并与去神经支配的靶细胞重建突触联系。这种可塑性改变了人们过去认为中枢神经系统缺乏再生的悲观看法。目前，有关脊髓可塑性研究较活跃，但有关神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对脊髓可塑性的影响研究尚属空白。为此，本课题选用研究脊髓可塑性常用模型——脊髓备用根模型〔1〕，术后经导管给予NGF，以探讨NGF对脊髓可塑性的影响。
, 百拇医药 1 材料与方法
SD大鼠35只，雌雄不限，体重200～250g，随机分成3组：NGF组(15只)、生理盐水(NS)组(15只)及正常组(5只)。NGF组与NS组鼠经0.3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，切断左侧L1～L3、L5～L6脊神经背根，保留左L4脊神经背根为备用根。硬膜下置入导管(内径0.8mm，外径1.2mm)。术后1、2、3、5、7、10d经导管，NGF组各注入NGF液0.10ml(含2.5s NGF 0.15mg)；NS组注入等量生理盐水作对照。术后10、20与50d两手术组各取5只大鼠及正常组鼠断头处死，以脊神经根为标志取L3脊髓节段。置10%甲醛(含1%氯化钙)中固定4～6h，再移入20%蔗糖磷酸缓冲液中，待组织下沉后，冰冻切片(20μm)。脊髓段共切9张，每切3张取1张用Gomori法(加0.2mmol/L NaF)染抗氧化物酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase,FRAP)〔2〕。切片经图像分析仪(TJTY-300)处理，分别测出每张切片两个脊髓后角胶状质内FRAP的积分光密度值(integrating optical density,IOD)，以代表FRAP含量。同切片FRAP的IOD值左右比较，求出L3左侧(手术侧)FRAP含量百分比，并经t检验。
, http://www.100md.com
2 结果
正常大鼠L 脊髓段FRAP阳性反应带位于后角胶状质(第Ⅱ板层)内,左右对称呈眉弓状(图1，插Ⅱ)。NS组手术侧L3节段FRAP含量术后减少，至术后20d达最低水平(图2，插Ⅱ)，术后50d见术侧FRAP含量回升。NGF组相应脊髓侧FRAP含量变化规律同NS组，但各检测点FRAP含量较NS组明显增高(图3，插Ⅱ)。两组FRAP含量差异有显著性意义(附表)。
附表 两组手术侧髓内FRAP含量比较
(
±s)(%)NS组
NGF组
P值
, 百拇医药
术后10d
15.23±1.26
14.01±1.82
>0.05
术后20d
4.25±1.89
9.10±2.68
<0.01
术后50d
10.83±2.34
18.16±2.96
<0.05
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3 讨论
3.1 脊髓备用根侧支出芽特点
Lin和Chambers(1958年)首次在哺乳类脊髓发现侧支出芽，证实脊髓具有可塑性。McNei等(1987年)借助备用根模型发现鼠初级传入纤维在脊髓内有侧支出芽，且出芽的纤维主要投向备用根的头侧〔1〕。本实验采用这一备用根模型，借助L3脊髓节段FRAP检测，发现术后50d两手术组术侧FRAP含量已见回升，NGF组FRAP含量高于NS组。这一结果进一步验证了备用根有侧支出芽的理论，并证实NGF有促进脊神经根初级传入纤维侧支出芽的作用。
3.2 检测FRAP研究脊髓可塑性的可靠性
FRAP在背根神经节小神经元内合成，仅经背根无髓传入神经纤维运送到脊髓第Ⅱ板层的复合终末内〔3〕，故FRAP可成为初级传入纤维的理想标记物〔4〕，又是研究脊髓可塑性的可靠指标〔1〕。借助FRAP仅经无髓传入纤维运输的特点可提示L 备用根发芽是源于背神经根内无髓纤维。
, 百拇医药
3.3 NGF促进背神经根侧支出芽的机制
有关NGF促进神经侧支出芽的机制目前还不十分清楚，可能与下述作用有关：(1)改变膜的流动性及表面结构，促进蛋白质合成及微管、微丝的形成与稳定〔5〕；(2)通过影响轴突生长锥和胶原细胞的相互作用〔6〕。本实验结果显示损伤能诱导成熟未损伤的感觉神经元侧支发芽，应用NGF能促进脊神经根侧支发芽，进一步证实NGF对脊髓的可塑性有显著影响。结合我们最近的研究〔7、8〕，提示NGF应用于脊髓损伤的治疗充满了希望。
4 参考文献
1 McNeill DL,Hulsebosch CE.Intraspinal sprouting of rat primary afferents after deafferentation.Neurosci Lett,1987,81:57.
, 百拇医药
2 Ainsworth A,Hall P,Wall PD,et al.Effects of capsaicin applied locally to adult peripheral nerve Ⅱ:anatomy and enzyme and peptide chemistry of peripheral nerve and spinal cord. Pain,1981,11:379.
3 Knyinhar E,Gerebtzoff MA.Extra-lysosomal location of acid phosphatase in the spinal cord of the rat.Exp Brain Res,1974,18:383。
4 Knyihar-Csillik E,Csillik G.FRAP:histochemistry of the primary nociceptive neuron.Prog Histochem Cytochem,1981,14:1.
, 百拇医药
5 Greene LA.The nerve growth factor biochemistry synthesis and mechanism of action.Ann Rev Neurosci,1980,3:353.
6 Pang Qingjiang,Luo Yongxiang,Wu Yangguan,et al.Experimental studies on periheral nerve regeneration enhanced by nerve growth factor.J Tongji Med Univ,1993,1:34.
7 庞清江,罗永湘,王继红.神经生长因子在脊髓损伤中的保护作用.中华实验外科杂志,1996,13(增刊):151.
8 庞清江,罗永湘.神经生长因子对脊髓前角运动神经元的保护作用.中华手外科杂志,1997,13(1):19.
△ 本课题为国家自然科学基金资助项目(C030306)收稿日期：1997-08-22 修回日期：1998-05-15
, 百拇医药(庞清江1 罗永湘2 李保文1 孔祥洪1)