IL-3基因修饰的G422胶质母细胞瘤细胞体内致瘤性的改变
作者：洪 波 王文仲 卢亦成Δ 周晓平 于益芝▲ 章卫平▲ 曹雪涛▲
单位：
关键词：白介素3；基因治疗；胶质瘤
第二军医大学学报980407 摘要 目的: 探讨IL-3基因治疗脑胶质瘤的可能性。方法: 以重组的复制缺陷型腺病毒作为基因转染的载体，在体外将鼠IL-3基因转染G422小鼠胶质母细胞瘤细胞，RT-PCR检测IL-3基因转染的G422细胞中是否有转基因的mRNA转录;ELISA法检测细胞培养上清液中分泌的IL-3的水平；MTT法检测细胞的体外增殖能力；IL-3基因转染G422细胞接种小鼠皮下，观察肿瘤的生长和小鼠的存活期，并检测小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL的杀伤活性。结果： IL-3基因转染的G422细胞中有目的基因mRNA的转录,分泌高水平的IL-3。IL-3基因转染的G422细胞的体外增殖能力没有显著的改变。皮下接种后，肿瘤生长受抑制，荷瘤小鼠的存活期延长，脾细胞诱导的LAK, CTL杀伤活性增强。结论： IL-3基因转染的G422细胞的体内致瘤性降低，能激活宿主的抗肿瘤免疫反应。
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中国图书资料分类法分类号 R730.264.05
In vivo tumorigenicity of IL-3 gene modified G422 glioblastoma cells
Hong Bo, Wang Wenzhong, Lu Yicheng, Zhou Xiaoping, Yu Yizhi, Zhang Weiping, Cao Xuetao (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Hong Bo, Wang Wenzhong, Lu Yicheng, Zhou Xiaoping, Yu Yizhi, Zhang Weiping, Cao Xuetao (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the possibility of IL-3 gene therapy of brain gliomas. Methods: IL-3 gene was introduced into G422 glioblastoma cells by recombinant adenovirus. RT-PCR was used to detect mRNA expression of the target gene in IL-3 gene modified tumor cells (G422-mIL3). IL-3 secretion by G422-mIL3 was assayed by ELISA. In vitro proliferation potential of G422-mIL3 was detected by MTT assay. The tumor size and survival of tumor bearing mice were observed after G422-mIL3 were inoculated subcutaneously. The splenic LAK and CTL cytotoxicity were analyzed by standard 51Cr release assay. Results: There was mRNA transcription of target gene in G422-mIL3. High level of IL-3 could be detected in the culture supernatant of G422-mIL3. There was no significant change of the in vitro proliferation potential (P>0.05). When inoculated subcutaneously, the tumor growth of G422-mIL3 was significantly inhibited as compared with wild type G422. The survival of mice inoculated with G422-mIL3 was significantly prolongated (P<0.01), and the splenic LAK and CTL cytotoxicity were also significantly enhanced (P<0.01). Conclusion: The reduction of in vivo tumorigenicity of IL-3 gene modified G422 cells may enhanced specific and non-specific anti-tumor immunity.
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Key words interleukin 3; gene therapy; glioma
白介素3(IL-3)的免疫调节功能和潜在的抗肿瘤作用越来越受到人们的重视[1]。目前未见有关IL-3基因治疗胶质瘤的研究报道。为了探讨IL-3基因治疗胶质瘤的可能性，我们采用重组腺病毒作为基因转染的载体，观察IL-3基因转染的G422胶质母细胞瘤细胞的体外生物学特性和体内致瘤性改变，为进一步的治疗研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 动物及细胞株 昆明种雌性小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，由第二军医大学实验动物中心提供。G422小鼠脑胶质母细胞瘤细胞株由北京神经外科研究所提供。检测LAK活性的P815细胞株由第二军医大学免疫学教研室常规传代培养。
1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒购自美国PE公司，PCR产物分析用Marker购自华美公司；鼠rIL-3标准品及ELISA检测试剂盒购自Endogen公司；MTT购自Fluka公司。
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1.3 重组腺病毒载体的扩增和滴度测定 表达鼠IL-3基因的重组腺病毒Adex1 CA mIL-3(Ad-mIL3)，表达LacZ基因的重组腺病毒Adex1 CA LacZ(Ad-LacZ)由日本Hamada博士惠赠。重组腺病毒的扩增和病毒滴度测定方法见文献[2]。
1.4 G422细胞中IL-3基因转染 DMEM培养液洗G422细胞2遍，加少量不含小牛血清的DMEM培养液，按MOI=100加Ad-mIL3，置37℃ 5% CO2孵箱中孵育4 h，DMEM洗2遍去除游离的病毒，加含15% FCS的DMEM培养液，37℃ 5% CO2孵箱中培养(G422-mIL3)，同时设立转染了LacZ基因的细胞对照(G422-LacZ)，野生型肿瘤细胞对照(G422)。
1.5 RT-PCR检测G422-mIL3中目的基因转录 采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒的步骤逆转录成cDNA，mIL-3基因的PCR引物：上游引物为5-TAT GGA TCC GAG ACA ATG GTTC-3，下游引物为5-CGA ATT CTC AGA CTT TAG GTGC-3，PCR参数94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 2 min，30次循环，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.6 G422-mIL3细胞分泌mIL-3水平检测 收集G422-mIL3在基因转染后培养1，2，3，7，14，21 d的培养上清，mIL-3水平的检测采用ELISA法。
1.7 G422-mIL3细胞的体外增殖测定 采用短期培养的MTT法，检测基因转染后G422-mIL3的体外增殖情况，结果用D570表示。
1.8 小鼠皮下荷瘤试验 将昆明种小鼠随机分成3组，每组10只，分别于右腿皮下接种2×105个野生型G422细胞(G422组)，LacZ基因修饰的G422细胞(G422-LacZ组)，mIL-3基因修饰的G422细胞(G422-mIL3组)。每天观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，肿瘤在皮下可扪及后，每3 d用游标卡尺测量肿瘤大小1次，肿瘤的大小用(a+b)/2表示(a，b分别为肿瘤的长短径)，并记录小鼠的存活期，对于存活期大于90 d的小鼠，其存活期计为90 d。
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1.9 荷瘤小鼠脾细胞LAK, CTL活性检测 取荷瘤后14 d的小鼠脾脏，制成脾淋巴细胞悬液，将其与50 Gy 60Co照射灭活后的G422细胞以20∶1置于含10% FCS的RPMI 1640培养液中，脾淋巴细胞的浓度为2×106个/ml，37℃ 5% CO2培养6 d后检测CTL杀伤活性。将脾淋巴细胞加入重组IL-3至终浓度1 000 U/ml培养3 d，检测其LAK的杀伤活性。LAK, CTL活性均采用4 h 51Cr释放法，用P815细胞为靶细胞检测LAK活性，采用野生型G422细胞为靶细胞检测CTL活性，效靶比50∶1。
1.10 统计学处理 由于出现了长期无瘤生存的小鼠，因此，平均存活期检验采用了Wilcoxon等级和检验法(Wilcoxon rank-sum test)。其他数据均采用未配对计量资料的t检验。
2 结 果
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2.1 RT-PCR检测IL-3基因mRNA的转录 从转染mIL-3基因的G422细胞中扩增得到长度约536 bp的基因片段，而野生型G422细胞和转染LacZ基因的G422细胞中没有扩增到相应的基因片段(图1)，提示腺病毒介导的mIL-3基因在G422肿瘤细胞中有其mRNA的转录。
图 1 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物
Fig 1 RT-PCR of IL-3 gene modified G422 tumor cells
A: G422; B:G422-LacZ; C: G422-mIL3; D: Marker
2.2 G422-mIL3细胞分泌mIL-3的水平 G422-mIL3在转染后的不同时间其上清中的mIL-3的水平如图2。在基因转染72 h后mIL-3达到最高水平14.3 ng/(106*24 h)，随后逐渐下降。而G422和G422-LacZ的培养上清中未检测到mIL-3的表达。
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图 2 G422-mIL3细胞体外培养上清中mIL-3的分泌水平
Fig 2 Level of mIL-3 in the supernatant of
cultured G422-mIL3 cells
2.3 G422-mIL3体外培养增殖能力的改变 G422-mIL3细胞的体外增殖能力和G422及G422-LacZ细胞无显著差异(P>0.05)，其D570分别为0.39±0.04，0.40±0.06，0.43±0.05。
2.4 皮下接种后肿瘤的大小 G422组和G422-LacZ组在接种的第7天已有皮下可扪及的肿瘤，两组之间无显著差异；而G422-mIL3组肿瘤的出现延迟，肿瘤大小和G422组及G422-LacZ组有显著差异(P<0.01,图3)。
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图 3 皮下荷瘤小鼠肿瘤的生长曲线
Fig 3 Tumor growth after subcutaneous inoculation
○:G422; ●:G422-LacZ; □:G422-mIL3
2.5 皮下荷瘤小鼠的存活期 存活曲线见图4。G422组小鼠的平均存活期是(24.2±3.3)d，G422-LacZ组的平均存活期是(25.9±3.8)d，两组小鼠无显著差异，而G422-mIL3组的平均存活期是(38.7±19.0)d，和前两组相差均有显著性意义(P<0.01)，G422-mIL3组荷瘤小鼠的存活期显著延长。
图 4 皮下荷瘤小鼠的生存曲线
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Fig 4 Survival of tumor-bearing mice
after subcutaneous inoculation
○:G422; ●:G422-LacZ； □:G422-mIL3
2.6 荷瘤小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性 G422-mIL3荷瘤小鼠的脾细胞的LAK、CTL活性都有显著升高(P<0.01)，而G422-LacZ组和G422组之间没有显著差异(图5)。
图 5 荷瘤小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL杀伤活性
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Fig 5 Cytotoxicity of splenic LAK and CTL
□:LAK; ■:CTL
3 讨 论
目前治疗脑恶性胶质瘤趋向于手术、放疗、化疗和其他生物治疗的综合方案。尽管如此，治疗的结果并不理想。80年代后，人们经静脉、脑脊液或瘤内局部注射细胞因子,如IFN,IL-2以治疗脑瘤，证明可以直接地抑制脑瘤的生长，但临床仅10%～30%有效，不能延长存活期[3,4]。随着基因治疗研究的开展，人们意识到细胞因子的基因治疗可能会克服使用外源性细胞因子所带来的副作用大、代价昂贵、作用时间短的缺陷。IL-3不仅作用于未成熟的造血前体细胞，还可作用于成熟的免疫细胞，具有一定的免疫调节作用及潜在的抗肿瘤作用[5]。本研究首次报道了IL-3基因治疗脑胶质瘤。我们采用重组的腺病毒载体，腺病毒是一种较安全、转染效率高的基因转移载体。腺病毒载体的滴度高,比逆转录病毒载体有较大的优势。腺病毒的扩增较方便，在纯化和处理时较稳定,是一种很有希望并适合于体内直接应用的基因治疗病毒载体。
, 百拇医药
从实验的RT-PCR结果和G422-mIL3细胞表达IL-3活性可以证实，腺病毒介导的IL-3基因转染后，肿瘤细胞有IL-3目的基因的表达，基因转染后的72 h，在细胞培养的上清中检测IL-3的表达达到最高水平，随着时间的推移，IL-3基因的表达逐渐下降，复制缺陷的腺病毒载体感染细胞以后，其基因组和外源的目的基因是不整合到靶细胞的基因组中的，所以在细胞的不断分裂和其他因素的影响下，目的基因会不断地丢失。目的基因的表达有时间性，这对于肿瘤的基因治疗并不都只是不利的，因为对于细胞因子的基因治疗或是自杀基因的治疗，治疗方案的本身也希望目的基因的表达是在一定的时间范围之内。
腺病毒介导mIL-3基因转染G422细胞后，G422-mIL3脑胶质瘤细胞的体外的增殖能力没有改变，而体内致瘤性有下降，荷瘤小鼠的存活期显著延长，说明IL-3基因的表达在体内激活和增强了宿主的抗肿瘤免疫反应。有研究报道IL-3可以增强CTL细胞的活性[1,5]，促进巨噬细胞的分化、成熟,并提高其肿瘤杀伤活性。在我们的实验中，荷瘤小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL的杀伤活性显著增强。当然，G422-mIL3接种脑内的致瘤性是否下降，其作用的机制，腺病毒介导IL-3体内基因转染对脑内已经生长的胶质瘤模型有无治疗作用,还有待于进一步的研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 章卫平，曹雪涛，王建莉，等. IL-3基因转染的瘤苗与IL-2、低剂量环磷酰胺的联合抗肿瘤作用. 中国科学，1996, 26(3): 271
2 雷 虹，曹雪涛，于益芝，等. 重组腺病毒介导M-CSF基因转染的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究. 中国免疫学杂志， 1995, 11(增刊): 504
3 Barba D, Saris SC, Holder C, et al. Intratumoral LAK cell and interleukin-2 therapy of human gliomas. J Neurosurg, 1989, 70(2):175
4 Saris SC, Spiess P, Lieberman DM, et al. Treatment of murine primary brain tumors with systemic interleukin-2 and tumor-infiltrating lymphocytes. J Neurosurg, 1992, 76(3): 513
5 Pulaski BA, McAdam AJ, Hutter EK, et al. Interleukin-3 enhances development of tumor-reactive cytotoxic cells by a CD4-dependent mechanism. Cancer Res, 1993, 53(9): 2112
(1997-10-13收稿, 1998-04-28修回)
第二军医大学学报 1998 Aug; 19(4)∶326
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关键词：白介素3；基因治疗；胶质瘤
第二军医大学学报980407 摘要 目的: 探讨IL-3基因治疗脑胶质瘤的可能性。方法: 以重组的复制缺陷型腺病毒作为基因转染的载体，在体外将鼠IL-3基因转染G422小鼠胶质母细胞瘤细胞，RT-PCR检测IL-3基因转染的G422细胞中是否有转基因的mRNA转录;ELISA法检测细胞培养上清液中分泌的IL-3的水平；MTT法检测细胞的体外增殖能力；IL-3基因转染G422细胞接种小鼠皮下，观察肿瘤的生长和小鼠的存活期，并检测小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL的杀伤活性。结果： IL-3基因转染的G422细胞中有目的基因mRNA的转录,分泌高水平的IL-3。IL-3基因转染的G422细胞的体外增殖能力没有显著的改变。皮下接种后，肿瘤生长受抑制，荷瘤小鼠的存活期延长，脾细胞诱导的LAK, CTL杀伤活性增强。结论： IL-3基因转染的G422细胞的体内致瘤性降低，能激活宿主的抗肿瘤免疫反应。
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中国图书资料分类法分类号 R730.264.05
In vivo tumorigenicity of IL-3 gene modified G422 glioblastoma cells
Hong Bo, Wang Wenzhong, Lu Yicheng, Zhou Xiaoping, Yu Yizhi, Zhang Weiping, Cao Xuetao (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Hong Bo, Wang Wenzhong, Lu Yicheng, Zhou Xiaoping, Yu Yizhi, Zhang Weiping, Cao Xuetao (Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
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Abstract Objective: To investigate the possibility of IL-3 gene therapy of brain gliomas. Methods: IL-3 gene was introduced into G422 glioblastoma cells by recombinant adenovirus. RT-PCR was used to detect mRNA expression of the target gene in IL-3 gene modified tumor cells (G422-mIL3). IL-3 secretion by G422-mIL3 was assayed by ELISA. In vitro proliferation potential of G422-mIL3 was detected by MTT assay. The tumor size and survival of tumor bearing mice were observed after G422-mIL3 were inoculated subcutaneously. The splenic LAK and CTL cytotoxicity were analyzed by standard 51Cr release assay. Results: There was mRNA transcription of target gene in G422-mIL3. High level of IL-3 could be detected in the culture supernatant of G422-mIL3. There was no significant change of the in vitro proliferation potential (P>0.05). When inoculated subcutaneously, the tumor growth of G422-mIL3 was significantly inhibited as compared with wild type G422. The survival of mice inoculated with G422-mIL3 was significantly prolongated (P<0.01), and the splenic LAK and CTL cytotoxicity were also significantly enhanced (P<0.01). Conclusion: The reduction of in vivo tumorigenicity of IL-3 gene modified G422 cells may enhanced specific and non-specific anti-tumor immunity.
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Key words interleukin 3; gene therapy; glioma
白介素3(IL-3)的免疫调节功能和潜在的抗肿瘤作用越来越受到人们的重视[1]。目前未见有关IL-3基因治疗胶质瘤的研究报道。为了探讨IL-3基因治疗胶质瘤的可能性，我们采用重组腺病毒作为基因转染的载体，观察IL-3基因转染的G422胶质母细胞瘤细胞的体外生物学特性和体内致瘤性改变，为进一步的治疗研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 动物及细胞株 昆明种雌性小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，由第二军医大学实验动物中心提供。G422小鼠脑胶质母细胞瘤细胞株由北京神经外科研究所提供。检测LAK活性的P815细胞株由第二军医大学免疫学教研室常规传代培养。
1.2 主要试剂 RT-PCR试剂盒购自美国PE公司，PCR产物分析用Marker购自华美公司；鼠rIL-3标准品及ELISA检测试剂盒购自Endogen公司；MTT购自Fluka公司。
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1.3 重组腺病毒载体的扩增和滴度测定 表达鼠IL-3基因的重组腺病毒Adex1 CA mIL-3(Ad-mIL3)，表达LacZ基因的重组腺病毒Adex1 CA LacZ(Ad-LacZ)由日本Hamada博士惠赠。重组腺病毒的扩增和病毒滴度测定方法见文献[2]。
1.4 G422细胞中IL-3基因转染 DMEM培养液洗G422细胞2遍，加少量不含小牛血清的DMEM培养液，按MOI=100加Ad-mIL3，置37℃ 5% CO2孵箱中孵育4 h，DMEM洗2遍去除游离的病毒，加含15% FCS的DMEM培养液，37℃ 5% CO2孵箱中培养(G422-mIL3)，同时设立转染了LacZ基因的细胞对照(G422-LacZ)，野生型肿瘤细胞对照(G422)。
1.5 RT-PCR检测G422-mIL3中目的基因转录 采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒的步骤逆转录成cDNA，mIL-3基因的PCR引物：上游引物为5-TAT GGA TCC GAG ACA ATG GTTC-3，下游引物为5-CGA ATT CTC AGA CTT TAG GTGC-3，PCR参数94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 2 min，30次循环，PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
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1.6 G422-mIL3细胞分泌mIL-3水平检测 收集G422-mIL3在基因转染后培养1，2，3，7，14，21 d的培养上清，mIL-3水平的检测采用ELISA法。
1.7 G422-mIL3细胞的体外增殖测定 采用短期培养的MTT法，检测基因转染后G422-mIL3的体外增殖情况，结果用D570表示。
1.8 小鼠皮下荷瘤试验 将昆明种小鼠随机分成3组，每组10只，分别于右腿皮下接种2×105个野生型G422细胞(G422组)，LacZ基因修饰的G422细胞(G422-LacZ组)，mIL-3基因修饰的G422细胞(G422-mIL3组)。每天观察小鼠皮下肿瘤的生长情况，肿瘤在皮下可扪及后，每3 d用游标卡尺测量肿瘤大小1次，肿瘤的大小用(a+b)/2表示(a，b分别为肿瘤的长短径)，并记录小鼠的存活期，对于存活期大于90 d的小鼠，其存活期计为90 d。
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1.9 荷瘤小鼠脾细胞LAK, CTL活性检测 取荷瘤后14 d的小鼠脾脏，制成脾淋巴细胞悬液，将其与50 Gy 60Co照射灭活后的G422细胞以20∶1置于含10% FCS的RPMI 1640培养液中，脾淋巴细胞的浓度为2×106个/ml，37℃ 5% CO2培养6 d后检测CTL杀伤活性。将脾淋巴细胞加入重组IL-3至终浓度1 000 U/ml培养3 d，检测其LAK的杀伤活性。LAK, CTL活性均采用4 h 51Cr释放法，用P815细胞为靶细胞检测LAK活性，采用野生型G422细胞为靶细胞检测CTL活性，效靶比50∶1。
1.10 统计学处理 由于出现了长期无瘤生存的小鼠，因此，平均存活期检验采用了Wilcoxon等级和检验法(Wilcoxon rank-sum test)。其他数据均采用未配对计量资料的t检验。
2 结 果
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2.1 RT-PCR检测IL-3基因mRNA的转录 从转染mIL-3基因的G422细胞中扩增得到长度约536 bp的基因片段，而野生型G422细胞和转染LacZ基因的G422细胞中没有扩增到相应的基因片段(图1)，提示腺病毒介导的mIL-3基因在G422肿瘤细胞中有其mRNA的转录。
图 1 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物
Fig 1 RT-PCR of IL-3 gene modified G422 tumor cells
A: G422; B:G422-LacZ; C: G422-mIL3; D: Marker
2.2 G422-mIL3细胞分泌mIL-3的水平 G422-mIL3在转染后的不同时间其上清中的mIL-3的水平如图2。在基因转染72 h后mIL-3达到最高水平14.3 ng/(106*24 h)，随后逐渐下降。而G422和G422-LacZ的培养上清中未检测到mIL-3的表达。
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图 2 G422-mIL3细胞体外培养上清中mIL-3的分泌水平
Fig 2 Level of mIL-3 in the supernatant of
cultured G422-mIL3 cells
2.3 G422-mIL3体外培养增殖能力的改变 G422-mIL3细胞的体外增殖能力和G422及G422-LacZ细胞无显著差异(P>0.05)，其D570分别为0.39±0.04，0.40±0.06，0.43±0.05。
2.4 皮下接种后肿瘤的大小 G422组和G422-LacZ组在接种的第7天已有皮下可扪及的肿瘤，两组之间无显著差异；而G422-mIL3组肿瘤的出现延迟，肿瘤大小和G422组及G422-LacZ组有显著差异(P<0.01,图3)。
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图 3 皮下荷瘤小鼠肿瘤的生长曲线
Fig 3 Tumor growth after subcutaneous inoculation
○:G422; ●:G422-LacZ; □:G422-mIL3
2.5 皮下荷瘤小鼠的存活期 存活曲线见图4。G422组小鼠的平均存活期是(24.2±3.3)d，G422-LacZ组的平均存活期是(25.9±3.8)d，两组小鼠无显著差异，而G422-mIL3组的平均存活期是(38.7±19.0)d，和前两组相差均有显著性意义(P<0.01)，G422-mIL3组荷瘤小鼠的存活期显著延长。
图 4 皮下荷瘤小鼠的生存曲线
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Fig 4 Survival of tumor-bearing mice
after subcutaneous inoculation
○:G422; ●:G422-LacZ； □:G422-mIL3
2.6 荷瘤小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性 G422-mIL3荷瘤小鼠的脾细胞的LAK、CTL活性都有显著升高(P<0.01)，而G422-LacZ组和G422组之间没有显著差异(图5)。
图 5 荷瘤小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL杀伤活性
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Fig 5 Cytotoxicity of splenic LAK and CTL
□:LAK; ■:CTL
3 讨 论
目前治疗脑恶性胶质瘤趋向于手术、放疗、化疗和其他生物治疗的综合方案。尽管如此，治疗的结果并不理想。80年代后，人们经静脉、脑脊液或瘤内局部注射细胞因子,如IFN,IL-2以治疗脑瘤，证明可以直接地抑制脑瘤的生长，但临床仅10%～30%有效，不能延长存活期[3,4]。随着基因治疗研究的开展，人们意识到细胞因子的基因治疗可能会克服使用外源性细胞因子所带来的副作用大、代价昂贵、作用时间短的缺陷。IL-3不仅作用于未成熟的造血前体细胞，还可作用于成熟的免疫细胞，具有一定的免疫调节作用及潜在的抗肿瘤作用[5]。本研究首次报道了IL-3基因治疗脑胶质瘤。我们采用重组的腺病毒载体，腺病毒是一种较安全、转染效率高的基因转移载体。腺病毒载体的滴度高,比逆转录病毒载体有较大的优势。腺病毒的扩增较方便，在纯化和处理时较稳定,是一种很有希望并适合于体内直接应用的基因治疗病毒载体。
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从实验的RT-PCR结果和G422-mIL3细胞表达IL-3活性可以证实，腺病毒介导的IL-3基因转染后，肿瘤细胞有IL-3目的基因的表达，基因转染后的72 h，在细胞培养的上清中检测IL-3的表达达到最高水平，随着时间的推移，IL-3基因的表达逐渐下降，复制缺陷的腺病毒载体感染细胞以后，其基因组和外源的目的基因是不整合到靶细胞的基因组中的，所以在细胞的不断分裂和其他因素的影响下，目的基因会不断地丢失。目的基因的表达有时间性，这对于肿瘤的基因治疗并不都只是不利的，因为对于细胞因子的基因治疗或是自杀基因的治疗，治疗方案的本身也希望目的基因的表达是在一定的时间范围之内。
腺病毒介导mIL-3基因转染G422细胞后，G422-mIL3脑胶质瘤细胞的体外的增殖能力没有改变，而体内致瘤性有下降，荷瘤小鼠的存活期显著延长，说明IL-3基因的表达在体内激活和增强了宿主的抗肿瘤免疫反应。有研究报道IL-3可以增强CTL细胞的活性[1,5]，促进巨噬细胞的分化、成熟,并提高其肿瘤杀伤活性。在我们的实验中，荷瘤小鼠脾细胞诱导的LAK, CTL的杀伤活性显著增强。当然，G422-mIL3接种脑内的致瘤性是否下降，其作用的机制，腺病毒介导IL-3体内基因转染对脑内已经生长的胶质瘤模型有无治疗作用,还有待于进一步的研究。
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参 考 文 献
1 章卫平，曹雪涛，王建莉，等. IL-3基因转染的瘤苗与IL-2、低剂量环磷酰胺的联合抗肿瘤作用. 中国科学，1996, 26(3): 271
2 雷 虹，曹雪涛，于益芝，等. 重组腺病毒介导M-CSF基因转染的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究. 中国免疫学杂志， 1995, 11(增刊): 504
3 Barba D, Saris SC, Holder C, et al. Intratumoral LAK cell and interleukin-2 therapy of human gliomas. J Neurosurg, 1989, 70(2):175
4 Saris SC, Spiess P, Lieberman DM, et al. Treatment of murine primary brain tumors with systemic interleukin-2 and tumor-infiltrating lymphocytes. J Neurosurg, 1992, 76(3): 513
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(1997-10-13收稿, 1998-04-28修回)
第二军医大学学报 1998 Aug; 19(4)∶326
, 百拇医药