秋水仙碱拮抗肿瘤坏死因子α的肝毒性作用
作者：倪 武 周明行 王国俊
单位：
关键词：秋水仙碱；肿瘤坏死因子；肝坏死；急性
摘要 目的摘要 目的：探讨秋水仙碱(Col)于在体条件下对重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)所致动物肝毒性的影响。方法: 将18只雄性BALB/c小鼠随机分为A～C 3组，腹腔注射D-氨基半乳糖(GalN)700 mg/kg致敏，1 h后再次腹腔注射TNF-α 50 μg/kg诱发急性肝坏死。A组小鼠于TNF-α给药前19和4 h分别腹腔注射生理盐水作为对照，B和C组则按相同时间分别灌服或腹腔注射Col 0.5 mg/kg。给药8 h后测定小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和甘氨酸结合胆汁酸(GCA),并观察小鼠肝脏的病理改变。结果： TNF-α注射8 h后C组ALT及GCA水平明显低于A组(P<0.05),而B组与A组无明显差别；C组小鼠肝脏病理损害程度亦较A组和B组明显减轻(P<0.01)。 结论： Col对TNFα所致的动物肝毒性具有预防作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R575.105
The preventive effect of colchicine against the liver toxicity of tumor necrosis factor-α
Ni Wu, Zhou Mingxing, Wang Guojun (Department of Infectious Diseases, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To determine the effect of colchicine(Col) against the liver toxicity of recombinant human tumor necrosis factor-α(TNF-α)in vivo. Methods: Eighteen male Balb/C mice were divided into three groups(6 mice in each group). Liver toxicity was induced by intraperitoneal administration of 50μg/kg of TNF-α 1 h after the sensitization by D-galactosamine (GalN), which was given intraperitoneally in a 700 mg/kg dosage. At 19 and 4 h prior to TNF-α challenge, mice in group A were intraperitoneally administered with normal saline, while those in group B and C were intubated or intraperitoneally injected with 0.5 mg/kg of Col, respectively. Serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and glycine conjugated bile acid (GCA) were detected and the pathologic changes of the liver were observed 8 h after the TNF-α attack. Results: The serum levels of ALT and GCA in group C were apparently lower than those in group A (P<0.05), while those in group B and group A had no statistic difference. Mice in group C also had more slight hepatic pathological changes than those in group A and B (P<0.01). Conclusion: Col can prevent the liver toxicity induced by TNF-α in vivo.
, 百拇医药
Key words colchicine; tumor necrosis factor; liver necrosis, acute
秋水仙碱(Col)用于肝病的治疗已有多年历史,已证实其对各型病毒性肝炎和重型肝炎具有良好的疗效,但目前Col治疗肝病的确切机制尚未完全阐明。近年来，肿瘤坏死因子(TNF)在病毒性肝炎发病过程中的重要作用已受到普遍的重视，并被认为是导致肝细胞坏死的重要介质，Col与TNF的关系也受到了广泛的关注。本研究应用重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)致小鼠急性肝坏死(ALN)模型，观察了Col对TNF-α所致小鼠肝毒性的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性BALB/c小鼠，8～10周龄，体质量20.7～27.2 g。将18只小鼠随机分为A，B，C 3组。A组小鼠分别在TNF-α注射前19和4 h腹腔注射生理盐水(NS)0.01 ml/kg作为空白对照组；同时B组和C组小鼠分别灌服或腹腔注射Col 0.5 mg/kg。
, 百拇医药
1.2 急性肝坏死模型的建立 参照文献[1]方法。各组小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(GalN)700 mg/kg致敏,1 h后继以TNF-α 50 μg/kg腹腔注射。TNF-α给药8 h后摘眼球放血,濒死小鼠随时放血,分离血清，同时剖取肝脏。
1.3 血清丙氨酸转氨酶(ALT)和甘氨酸结合胆汁酸(GCA)测定 (1)ALT:以CX4型自动生化分析仪检测，采用Beckman公司试剂盒。(2)GCA:用放射免疫测定(RIA)法检测,采用中国原子能科学研究所GCA放射免疫分析试剂盒。
1.4 肝脏病理观察 肝脏大体标本病理分级标准：(-)外观正常；(±)极轻微散在斑点状出血坏死；(+)散在斑点、斑块状出血坏死；(++)广泛斑点、斑块状出血坏死；(++)大块状出血坏死；(++)整个肝脏出血坏死。
1.5 主要试剂 Col为德国Serva公司产品；TNF-α为第二军医大学微生物学教研室产品，细胞毒性法测定比活性为5.3×107 U/mg；GalN为美国公司产品，纯度≥99%。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 数据以
±s表示。定量资料3组间经方差分析(F检验)有显著差异后，以Student-Newman-Keuls检验作组间两两比较。等级资料比较用Wilcoxon检验。
2 结 果
2.1 Col对ALT的影响 受TNF-α攻击后，C组血清ALT水平[(2 008±1 584)U/L]明显低于A组[(6 755±4 023)U/L,P<0.05]；B组ALT水平[(5 387±3 147)U/L]虽较A组有所降低，但两者无统计学差异；C组与B组ALT亦无明显差异。
2.2 Col对GCA的影响 C组小鼠血清GCA水平[(2 456±2 226)U/L]显著低于A组[(6 110±2 651)U/L, P<0.05]和B组[(5 860±2 215)U/L, P<0.05]；而B组与A组血清GCA水平无统计学差异。
, 百拇医药
2.3 Col 对小鼠肝坏死程度及死亡率的影响 C组肝坏死等级与A组和B组比较均有极显著差异(P<0.01)；而B组与A组差异不显著(表1)。小鼠死亡时间为TNF-α给药后6.5～7.5 h。3组小鼠死亡数均无统计学差异。
表 1 各组小鼠肝脏病理损害程度及死亡数
Tab 1 Pathological changes of the liver and
the lethality in each group(n=6)
Group
Death
Grade of liver necrosis
±
, 百拇医药
+
A
2
1
1
1
3
B
2
1
1
, 百拇医药
2
2
C
0
3
2
1
3 讨 论
Col是从百合科植物秋水仙或丽江山茨菇的球茎和种子中提取的一种生物碱。临床上用于痛风、乳腺癌、疟疾和白塞病等的治疗。其主要作用机制为：通过使中性粒细胞微管系统解聚而抑制其游走，达到抗炎作用。已往研究表明，Col能有效防止四氯化碳、GalN、醋氨酚等引起的动物肝损伤，并对各类急、慢性病毒性肝炎、重型肝炎等患者具有较好的疗效[2,3],但其机制尚未完全阐明。近年来已证实，TNF在体内具有双重生物学活性，它一方面可介导抗肿瘤和免疫调节作用，另一方面又可作为炎性介质参与免疫病理损伤，是病毒性肝炎患者中导致肝损伤的重要介质之一[1,4,5]，而Col对TNF的影响也引起了广泛关注。
, 百拇医药
本实验证实了预防性腹腔注射Col能减轻TNF-α引起的小鼠肝坏死程度，这一结果与Tiegs等[1]的报道相一致。但他们采用的TNF-α剂量较小，诱发的肝损伤程度较轻；而本实验则进一步证实了Col能拮抗近半数致死剂量的TNF-α对小鼠肝脏的毒性作用。灌服Col小鼠血清ALT及GCA水平虽较对照组有所降低，但无统计学意义。Col不同给药方法间疗效存在差异的原因可能有两点：(1)灌服给药时，可能由于操作误差或给药后动物将部分药物呕出，导致用药剂量难以精确控制；(2)Col经胃肠道给药可能较腹腔注射给药吸收差，吸收速度亦较慢。这些均有待进一步研究证实。
Col拮抗TNF-α所致肝毒性的机制未明。Col可能通过抑制肝细胞膜表面mTNF-αR的表达及其功能，阻断了TNF-α的毒性作用。Ding等[6]报道，Col及其他微管抑制剂[长春新碱、长春碱、鬼臼毒素(Podothyllotoxin)和诺考哒唑等]均能可逆性抑制人巨噬细胞和脐静脉内皮细胞表达TNF-αR，而对微管无解聚作用的Col衍生物——光秋水仙碱(Lumicolchicine)则无此作用。提示Col等可能通过抑制微管聚合，使TNF-αR合成减少或抑制新合成的受体转运到细胞膜。此外，由于微管功能受抑制，还可使mTNF-αR内化受阻，使细胞膜上潴留更多的mTNF-αR供丝氨酸蛋白酶切除，并影响了TNF-α与受体结合后的信号传递及mTNF-αR的再生。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Tiegs G, Freudenberg MA, Galanos C, et al. Colchicine prevents tumor necrosis factor-induced toxicity in vivo. Infect Immun, 1992,60(5):1941
2 Muriel P, Quintanar ME, Perez-Alvarez V. Effect of colchicine on acetaminophen-induced liver damage. Liver, 1993, 13(4):217
3 周明行,陈保龙,钟佛锦,等. 秋水仙碱治疗肝炎系列研究报告:动物实验及临床病例观察. 解放军医学杂志, 1993,18(1):19
4 袁爱力,罗元辉,刘思德,等. 慢性肝病肿瘤坏死因子α水平及其与发病机制的关系. 中华内科杂志, 1994,33(10):672
, 百拇医药
5 Marinos G, Naoumov NV, Rossol S, et al. Tumor necrosis factor receptors in patients with chronic hepatitis B virus infection. Gastroenterology, 1995, 108(5):1453
6 Ding AH, Porteu F, Sanchez E, et al. Down-regulation of tumor necrosis factor receptors of macrophages and endothelial cells by microtubule depolymerizing agents. J Exp Med, 1990, 171(3):715
(1997-12-14收稿, 1998-04-29修回), 百拇医药
单位：
关键词：秋水仙碱；肿瘤坏死因子；肝坏死；急性
摘要 目的摘要 目的：探讨秋水仙碱(Col)于在体条件下对重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)所致动物肝毒性的影响。方法: 将18只雄性BALB/c小鼠随机分为A～C 3组，腹腔注射D-氨基半乳糖(GalN)700 mg/kg致敏，1 h后再次腹腔注射TNF-α 50 μg/kg诱发急性肝坏死。A组小鼠于TNF-α给药前19和4 h分别腹腔注射生理盐水作为对照，B和C组则按相同时间分别灌服或腹腔注射Col 0.5 mg/kg。给药8 h后测定小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和甘氨酸结合胆汁酸(GCA),并观察小鼠肝脏的病理改变。结果： TNF-α注射8 h后C组ALT及GCA水平明显低于A组(P<0.05),而B组与A组无明显差别；C组小鼠肝脏病理损害程度亦较A组和B组明显减轻(P<0.01)。 结论： Col对TNFα所致的动物肝毒性具有预防作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R575.105
The preventive effect of colchicine against the liver toxicity of tumor necrosis factor-α
Ni Wu, Zhou Mingxing, Wang Guojun (Department of Infectious Diseases, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
Abstract Objective: To determine the effect of colchicine(Col) against the liver toxicity of recombinant human tumor necrosis factor-α(TNF-α)in vivo. Methods: Eighteen male Balb/C mice were divided into three groups(6 mice in each group). Liver toxicity was induced by intraperitoneal administration of 50μg/kg of TNF-α 1 h after the sensitization by D-galactosamine (GalN), which was given intraperitoneally in a 700 mg/kg dosage. At 19 and 4 h prior to TNF-α challenge, mice in group A were intraperitoneally administered with normal saline, while those in group B and C were intubated or intraperitoneally injected with 0.5 mg/kg of Col, respectively. Serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and glycine conjugated bile acid (GCA) were detected and the pathologic changes of the liver were observed 8 h after the TNF-α attack. Results: The serum levels of ALT and GCA in group C were apparently lower than those in group A (P<0.05), while those in group B and group A had no statistic difference. Mice in group C also had more slight hepatic pathological changes than those in group A and B (P<0.01). Conclusion: Col can prevent the liver toxicity induced by TNF-α in vivo.
, 百拇医药
Key words colchicine; tumor necrosis factor; liver necrosis, acute
秋水仙碱(Col)用于肝病的治疗已有多年历史,已证实其对各型病毒性肝炎和重型肝炎具有良好的疗效,但目前Col治疗肝病的确切机制尚未完全阐明。近年来，肿瘤坏死因子(TNF)在病毒性肝炎发病过程中的重要作用已受到普遍的重视，并被认为是导致肝细胞坏死的重要介质，Col与TNF的关系也受到了广泛的关注。本研究应用重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)致小鼠急性肝坏死(ALN)模型，观察了Col对TNF-α所致小鼠肝毒性的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性BALB/c小鼠，8～10周龄，体质量20.7～27.2 g。将18只小鼠随机分为A，B，C 3组。A组小鼠分别在TNF-α注射前19和4 h腹腔注射生理盐水(NS)0.01 ml/kg作为空白对照组；同时B组和C组小鼠分别灌服或腹腔注射Col 0.5 mg/kg。
, 百拇医药
1.2 急性肝坏死模型的建立 参照文献[1]方法。各组小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(GalN)700 mg/kg致敏,1 h后继以TNF-α 50 μg/kg腹腔注射。TNF-α给药8 h后摘眼球放血,濒死小鼠随时放血,分离血清，同时剖取肝脏。
1.3 血清丙氨酸转氨酶(ALT)和甘氨酸结合胆汁酸(GCA)测定 (1)ALT:以CX4型自动生化分析仪检测，采用Beckman公司试剂盒。(2)GCA:用放射免疫测定(RIA)法检测,采用中国原子能科学研究所GCA放射免疫分析试剂盒。
1.4 肝脏病理观察 肝脏大体标本病理分级标准：(-)外观正常；(±)极轻微散在斑点状出血坏死；(+)散在斑点、斑块状出血坏死；(++)广泛斑点、斑块状出血坏死；(++)大块状出血坏死；(++)整个肝脏出血坏死。
1.5 主要试剂 Col为德国Serva公司产品；TNF-α为第二军医大学微生物学教研室产品，细胞毒性法测定比活性为5.3×107 U/mg；GalN为美国公司产品，纯度≥99%。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 数据以
±s表示。定量资料3组间经方差分析(F检验)有显著差异后，以Student-Newman-Keuls检验作组间两两比较。等级资料比较用Wilcoxon检验。2 结 果
2.1 Col对ALT的影响 受TNF-α攻击后，C组血清ALT水平[(2 008±1 584)U/L]明显低于A组[(6 755±4 023)U/L,P<0.05]；B组ALT水平[(5 387±3 147)U/L]虽较A组有所降低，但两者无统计学差异；C组与B组ALT亦无明显差异。
2.2 Col对GCA的影响 C组小鼠血清GCA水平[(2 456±2 226)U/L]显著低于A组[(6 110±2 651)U/L, P<0.05]和B组[(5 860±2 215)U/L, P<0.05]；而B组与A组血清GCA水平无统计学差异。
, 百拇医药
2.3 Col 对小鼠肝坏死程度及死亡率的影响 C组肝坏死等级与A组和B组比较均有极显著差异(P<0.01)；而B组与A组差异不显著(表1)。小鼠死亡时间为TNF-α给药后6.5～7.5 h。3组小鼠死亡数均无统计学差异。
表 1 各组小鼠肝脏病理损害程度及死亡数
Tab 1 Pathological changes of the liver and
the lethality in each group(n=6)
Group
Death
Grade of liver necrosis
±
, 百拇医药
+
A
2
1
1
1
3
B
2
1
1
, 百拇医药
2
2
C
0
3
2
1
3 讨 论
Col是从百合科植物秋水仙或丽江山茨菇的球茎和种子中提取的一种生物碱。临床上用于痛风、乳腺癌、疟疾和白塞病等的治疗。其主要作用机制为：通过使中性粒细胞微管系统解聚而抑制其游走，达到抗炎作用。已往研究表明，Col能有效防止四氯化碳、GalN、醋氨酚等引起的动物肝损伤，并对各类急、慢性病毒性肝炎、重型肝炎等患者具有较好的疗效[2,3],但其机制尚未完全阐明。近年来已证实，TNF在体内具有双重生物学活性，它一方面可介导抗肿瘤和免疫调节作用，另一方面又可作为炎性介质参与免疫病理损伤，是病毒性肝炎患者中导致肝损伤的重要介质之一[1,4,5]，而Col对TNF的影响也引起了广泛关注。
, 百拇医药
本实验证实了预防性腹腔注射Col能减轻TNF-α引起的小鼠肝坏死程度，这一结果与Tiegs等[1]的报道相一致。但他们采用的TNF-α剂量较小，诱发的肝损伤程度较轻；而本实验则进一步证实了Col能拮抗近半数致死剂量的TNF-α对小鼠肝脏的毒性作用。灌服Col小鼠血清ALT及GCA水平虽较对照组有所降低，但无统计学意义。Col不同给药方法间疗效存在差异的原因可能有两点：(1)灌服给药时，可能由于操作误差或给药后动物将部分药物呕出，导致用药剂量难以精确控制；(2)Col经胃肠道给药可能较腹腔注射给药吸收差，吸收速度亦较慢。这些均有待进一步研究证实。
Col拮抗TNF-α所致肝毒性的机制未明。Col可能通过抑制肝细胞膜表面mTNF-αR的表达及其功能，阻断了TNF-α的毒性作用。Ding等[6]报道，Col及其他微管抑制剂[长春新碱、长春碱、鬼臼毒素(Podothyllotoxin)和诺考哒唑等]均能可逆性抑制人巨噬细胞和脐静脉内皮细胞表达TNF-αR，而对微管无解聚作用的Col衍生物——光秋水仙碱(Lumicolchicine)则无此作用。提示Col等可能通过抑制微管聚合，使TNF-αR合成减少或抑制新合成的受体转运到细胞膜。此外，由于微管功能受抑制，还可使mTNF-αR内化受阻，使细胞膜上潴留更多的mTNF-αR供丝氨酸蛋白酶切除，并影响了TNF-α与受体结合后的信号传递及mTNF-αR的再生。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1 Tiegs G, Freudenberg MA, Galanos C, et al. Colchicine prevents tumor necrosis factor-induced toxicity in vivo. Infect Immun, 1992,60(5):1941
2 Muriel P, Quintanar ME, Perez-Alvarez V. Effect of colchicine on acetaminophen-induced liver damage. Liver, 1993, 13(4):217
3 周明行,陈保龙,钟佛锦,等. 秋水仙碱治疗肝炎系列研究报告:动物实验及临床病例观察. 解放军医学杂志, 1993,18(1):19
4 袁爱力,罗元辉,刘思德,等. 慢性肝病肿瘤坏死因子α水平及其与发病机制的关系. 中华内科杂志, 1994,33(10):672
, 百拇医药
5 Marinos G, Naoumov NV, Rossol S, et al. Tumor necrosis factor receptors in patients with chronic hepatitis B virus infection. Gastroenterology, 1995, 108(5):1453
6 Ding AH, Porteu F, Sanchez E, et al. Down-regulation of tumor necrosis factor receptors of macrophages and endothelial cells by microtubule depolymerizing agents. J Exp Med, 1990, 171(3):715
(1997-12-14收稿, 1998-04-29修回), 百拇医药