组织工程化肌腱研究进展△
作者：秦廷武* 杨志明*
单位：* 华西医科大学附属第一医院骨科(四川成都，610041)
关键词：细胞外基质；肌腱细胞；组织工程化肌腱
组织工程化肌腱研究进展 摘 要 对组织工程化肌腱领域中目前研究的主要成果进行综述，着重阐述了肌腱细胞外基质替代物、肌腱细胞生物学性质及肌腱细胞与细胞外基质材料复合研究中的主要问题。认为，研制适于肌腱细胞生长、粘附和发挥功能的细胞外基质材料；建立生长、增殖可调控的肌腱细胞系；在模拟体内力学条件下，进行肌腱细胞三维培养，将是研究具有特定修复功能的组织工程化肌腱的重要问题。
THE RECENT ADVANCES IN THE STUDY OF TISSUE ENGINEERING TENDON/Qin Tingwu, Yang Zhiming. Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu Sichuan, P.R. China 610041
, http://www.100md.com
Abstract This paper reviewed the main achievements in the research on tissue engineering tendon, focusing on major problems concerning the substitute for extracellular matrix (ECM) of tendon, biological characteristics of tendon cells, and tendon cells compounding with ECM substitute. It was concluded the important problems in the study of the tissue engineering having specific reparative functions could be: to prepare the ECM materials suitable for the tendon cells to attach, grow, and function; to establish the tendon cell line whose growth, proliferation, and immunological antigenicity could be modulated and controlled, and simulating the mechanical environment of tendon in vivo, to adopt three-dimensional tendon cell culture method.
, 百拇医药
Key words Extracellular matrix Tendon cell Tissue engineering tendon
肌腱损伤或缺失后，其手术修复和功能重建是手外科十分重要的研究课题之一。现代外科的发展已使人类替换病损肌腱成为现实。替换物包括异种肌腱、同种异体肌腱、自体肌腱和人工合成材料等。异种肌腱引起相当快速的排斥反应；同种异体肌腱移植尽管在形态方面与自体肌腱相似，在术后早期可被宿主短时间接受，但排斥反应仍可发生；自体肌腱移植会造成供区损伤，以及所能供给的肌腱存在局限性；人工合成材料代肌腱植入后引起异物反应，继发感染及裸露等。这些问题的存在均迫使研究者们寻求新的、更为理想的肌腱替代物。随着细胞培养、材料科学及细胞移植等技术的迅速发展，组织工程(Tissue Engineering)[1]的诞生，使有生命的生物代用品的研制成为可能。已有学者将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，然后将它们移植到动物体内，达到形成新的、有功能的组织的目的[2，3]。在组织工程技术的推动下，组织工程化肌腱研究得到前所未有的发展。到目前为止，关于组织工程化肌腱的研究主要包括三个方面内容：①肌腱细胞外基质替代物的研究；②肌腱细胞生物学性质的研究；③肌腱细胞与细胞外基质复合的研究。现将有关研究结果综述如下。
, 百拇医药
1 肌腱细胞外基质替代物的研究
肌腱是由形态相似、 功能相关的肌腱细胞和细胞外基质组成。细胞外基质是肌腱细胞附着的基本框架和代谢场所。因此，它的形态和功能直接影响其所构成的肌腱的形态和功能，其替代物的研究也就成为组织工程化肌腱的研究内容之一。
1.1 人工合成细胞外基质替代物的研究
自从1910年Lange用浸过石蜡的丝线首先以非生物材料进行游离肌腱移植以来，人们已经采用过许多代用品，如人发辫、尼龙带、蚕丝及涤纶等，特别是60年代以来，人工合成的高分子材料层出不穷，国内外学者已广泛用于临床。其中比较好的材料是硅橡胶制品和碳素纤维，这些材料被认为具有理化性质稳定、不随时间老化、无毒性、无抗原性和不致癌等优点，原则上均可作细胞外基质材料。
硅橡胶耐受拉应力极差，又易于撕裂，难于缝合，不适于作为肌腱细胞外基质材料[4]。戴克戎等[5]以硅橡胶、桑蚕丝和涤纶制成“中空”人工肌腱构架，改善了其抗张强度差的缺点，但用于手部“无人区”时反应较大。黄良夫等[6]认为，碳纤维编织带应用于临床手术实践是一种良好的生物工程材料。近年来的研究表明，碳纤维编织带仍存在许多缺点，它不能作为永久性肌腱构架，植入体内最终被逐渐降解、碎裂[7]。毛宾尧等[8]研究发现，碳纤维作为肌腱支架植入骨和软组织内第6周即开始裂解，认为若不对碳纤维在体内的裂解速度进行改进，将影响碳纤维作为肌腱植入材料的临床应用。
, 百拇医药
Alexander等[9]用碳纤维与聚乳酸(polylactic acid, PLA)的复合物作为肌腱构架，碳纤维提供组织生长的支架，聚乳酸对碳纤维的降解速度进行调节，这种复合物构架具有较强的抗张特性，但柔韧性差。实际中将聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)与PLA共聚，可得到机械性能好，柔韧性好，降解速度可改变的聚合物框架[10]。PGA+PLA是目前组织工程领域应用最广泛的ECM[11]，其存在亲水性差和对细胞吸附力弱等问题。人们在寻找理想的物质来包埋PGA+PLA，增加其亲水性和增强对细胞的吸附力。有学者对PGA+PLA进行包埋，以观察材料对软骨细胞的吸附力改变[12]，这种复合支架用于组织工程化肌腱研究还未见报道。
近年来，随着生命科学和材料科学的相互渗透，发现“惰性、无毒性”的生物材料并不是理想的细胞外基质材料，利用工程学方法将特定信号识别功能的生物分子与现有材料结合，新一代的有特定修复功能的“智能”支架材料是当前生物材料研究领域的前沿课题[13，14]。在ECM研究中，直接也是最先与组织、细胞相接触的是材料表面，因此材料表面性质的不同将影响细胞吸附、增殖及分化等一系列功能[15]。现代物理学和化学的发展，使人们完全有能力对材料表面进行修饰，通过生物化处理及分子设计[16]，使表面蛋白吸附层的蛋白变为单一蛋白，通过控制粘附蛋白来对细胞与生物材料的粘附、增殖及分化等一系列功能进行预测和监控，使反应由随机到有序，由非特异性到特异性。目前，对材料表面进行分子生物学设计，主要是将一些有生理功能的物质如蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子等固定在材料表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体[17]，使表面形成一个能与细胞相适应的过渡层。细胞与其周围环境的反应是通过专门粘附蛋白来进行的，如间充质细胞倾向于利用纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)吸附在细胞外基质的胶原上，FN在组织再生的各个阶段起着多种作用，调节细胞粘附，为细胞运动充当临时基质[18]。Kleinman 等[19]研究发现，FN可直接与胶原纤维连接，Doillon等[20]认为，这种连接促进了成纤维细胞向胶原纤维间渗透，而且增加了胶原纤维对成纤维细胞的吸附性。Wojciak-Stothard等[21]的实验表明，FN作为ECM的一种成分，可明显地影响鼠肌腱细胞的活性。显然，对肌腱细胞外基质进行表面修饰，对组织工程化肌腱的构建是至关重要的，这方面的研究有待进一步开展。
, 百拇医药
1.2 天然的肌腱细胞外基质研究
肌腱的组织成分主要是由胶原纤维组成的粗大纤维束，平行排列，其方向与所承受的牵引力一致。纤维具有韧性，抗牵引力强。原纤维的主要成分是胶原蛋白，因此胶原可以作为组织工程化肌腱的ECM支架。
王维民等[22]用动物的肌腱，经组织工程学方法处理，脱去肌腱细胞，获得了天然的ECM(nature extracellular matrix, NECM)胶原支架，这种支架的抗原性大为降低。张友乐等[23]将异体肌腱进行冷冻干燥处理，不仅明显降低了组织的抗原作用，而且经水合后仍然保留肌腱的基本结构和酶的活性，其力学特性未改变，移植后组织修复能力同自体肌腱。Minami等[24]对同种异体肌腱作为移植供体的免疫抗原性进行实验研究，指出肌腱的胶原成分不显示、不表达主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)，肌腱组织的免疫抗原性是由肌腱细胞成分来表达的。通过冷冻、融化或多聚甲醛处理，可以降低腱细胞的抗原性，而用X线照射、戊二醛和丝裂霉素C等杀肿瘤细胞的处理方法，却不能达到去除腱细胞抗原性的作用。目前通常采用冷冻、冻干及化学处理等方法破坏肌腱中细胞成分，从而降低其抗原性[25]。在天然的肌腱细胞外基质研究方面，尚有不同来源的蛋白基质的力学性质较差，生理学性质不稳定和外来胶原所引起的免疫反应等问题未能彻底解决。
, 百拇医药
2 肌腱细胞生物学特性研究
组织工程化肌腱研究中，移植后的人工活性肌腱能否实现被替代肌腱的功能，肌腱细胞能否适应受区的环境，肌腱细胞的种植浓度对组织工程化的影响，以及肌腱细胞作为种子细胞所具有的生物学特性均是组织工程化肌腱必须研究的问题。
肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，它合成和分泌胶原，接受机体的神经-体液调控，维系肌腱组织的新陈代谢。肌腱细胞是一种分化程度很高的细胞，在体外培养条件下，肌腱细胞增殖相对缓慢，尤其是在经多次传代后，肌腱细胞甚至丧失进入增殖期的能力。这对组织工程化肌腱的研究是不利的。因此，寻找调控肌腱细胞生长的方法是研究的主要问题。
在促进肌腱细胞分裂增殖研究方面，蔚凡等[26]已成功地建立了人胚肌腱细胞系，并建立了一套肌腱细胞分离、纯化、培养及冻存复苏的方法。以此为基础，在培养基中加入胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)，观察其对肌腱细胞生长的作用。结果发现，IGF-1对肌腱细胞的增殖有明显的促进作用，并且在一定浓度范围内有量效依赖关系[27]。为了明确IGF-1促进肌腱细胞生长的作用机制，进一步研究了IGF-1作用后细胞周期的改变，结果表明，IGF-1对肌腱细胞生长的促进作用是通过加快G1期和G2M期的进程实现的[28]。IGF-1受体系统的活跃是维持细胞增殖能力的重要保证，而IGF-1 mRNA在多次传代(第13代)的肌腱细胞中不表达，是导致肌腱细胞出现增殖能力下降等细胞衰老现象的重要因素之一[29]。显然，在肌腱细胞中增强IGF-1 mRNA的表达能否逆转这一细胞衰老现象，或者阻断IGF-1及其受体mRNA的表达能否抑制细胞过度增殖，这将是组织工程化肌腱研究中值得进一步研究的内容。
, 百拇医药
组织工程化肌腱要大规模实施，不能只限于用自体肌腱细胞构建人工活性肌腱，必须解决肌腱细胞移植的免疫排斥问题。研究肌腱细胞及其产物的抗原性和产生机制，降低人体抗原性的方法仍然是组织工程化肌腱研究的重要问题。
肌腱细胞的永生化，是肌腱细胞获得持续生长增殖能力的特性。对腱细胞的永生化不仅在于在排除或控制其致肿瘤的可能性后用于构建人工活性肌腱，更重要的是在于利用它保存了细胞的功能特性和容易长期大量繁殖的特性，为研究肌腱细胞的免疫学和体外构建模式等方面提供容易繁殖的标准细胞株。华西医科大学已经用温度敏感型SV40大T抗原质粒ptsA58H导入肌腱细胞株，成功地为肌腱细胞标准细胞株建立了转化模型。目前，对肌腱细胞永生化还需进行深入研究。
3 肌腱细胞与人工材料复合的研究
组织工程化肌腱的研究目的是获得人工活性肌腱，即体外预制肌腱并将其植入体内，以取代因疾病、损伤而无功能的肌腱。人工活性肌腱必须具备无抗原性，来源不受限，按预先塑形，具有生命力。人工活性肌腱是在肌腱细胞外基质替代物开发和肌腱细胞生物特性的综合研究基础上，借助于肌腱细胞与细胞外基质材料复合培养和移植技术而获得的。其中肌腱细胞在模拟体内力学条件下的三维立体培养，即将肌腱细胞种植于三维细胞外基质构架中，空间上不限制肌腱细胞的立体增殖，从而形成新型人工活性肌腱。在模拟体内力学条件下，在立体空间进行肌腱细胞三维培养是组织工程化肌腱研究中的一个重要问题。
, 百拇医药
Ricci[30]将肌腱段与碳纤维联合进行体外培养，发现培养24小时后有圆形细胞从肌腱段向外逸出，5天后有两种形态的细胞座落在材料表面，细胞间相互衔接，同时在材料上单个细胞突起更长，其突起沿材料纵轴发展。Goodship[31]取小马的肺组织进行体外成纤维细胞与单根碳纤维混合培养发现，细胞吸附于单根碳纤维上，碳纤维上细胞随培养时间增多，形成“鞘状”包绕碳纤维，细胞在碳纤维上爬行方向与碳纤维一致，经历了分裂增殖。
张前法等[32]将兔肌腱细胞与碳纤维联合进行体外静态培养，结果发现碳纤维与腱细胞相容性好，有良好的吸附性；腱细胞在碳纤维上呈串珠状排列，多个腱细胞包绕碳纤维编织带，碳纤维间有网状纤维缠绕。进一步研究了兔自体腱细胞与碳纤维联合培养后植入体内的改变，发现肌腱细胞脱离碳纤维支架，在编织带间增殖，合成胶原，其胶原纤维相互衔接，形成致密的组织结构；腱细胞在碳纤维间排列整齐，均匀，胶原纤维间相互连接形成网状，纤维条索主体与碳纤维方向一致[33]。Jenkins等[34]用碳纤维桥接成年羊跟腱缺损，8周后发现碳纤维周围及单根碳纤维间充满了腱细胞样组织结构，这些结构沿着碳纤维按一个方向排列。他们认为，碳纤维诱发的这种腱样组织结构形成的关键因素是碳纤维力学性能逐渐丧失，使新形成的胶原承受的载荷逐渐增大，从而促进了肌腱细胞按应力方向取向并分泌胶原所致。Forster等[35]的实验进一步证实了上述推测。Aragona等[36]将碳纤维与聚乳酸的复合物植入兔跟腱断端，发现术后8周碳纤维形成明显的组织内生，这些新生的胶原组织按一个方向渗透到植入物中，植入物周围成纤维细胞活跃，取向排列，至12周时更明显。新生组织高度结合，成纤维细胞和胶原均按纵向排列，碳纤维复合物被完全渗透。他们认为，这种组织细胞向复合物渗入与植入物牢固的生物固定，进而有正常的应力作用于植入物有关。毛宾尧等[8]将碳素纤维植入兔的胫骨内，进行力学强度测定表明，术后8周，碳纤维与周围组织无间隙，并有显著的碳纤维裂解，外周间隙为胶原纤维、成骨细胞等所填充，植入物抗张强度中包含新生的胶原纤维在碳纤维间的抗张潜能，在载荷-变形曲线上表现为一长的平段，显示“诱发腱”的抗张强度，具有一定的柔韧性。
, http://www.100md.com
综合上述各项研究表明，在静态培养条件下，肌腱细胞与碳纤维编织带进行联合培养，腱细胞在编织带表面生长，分泌胶原取决于碳纤维的取向排列；而在体内植入实验中，腱细胞能脱离碳纤维，在其间生长、分泌胶原；腱细胞和分泌的胶原有明显的取向性，沿碳纤维平行排列。实际上体内植入后腱细胞处在动态环境中，这种动态环境提供了一个张应力环境，进而使腱细胞在此环境下生长、分泌胶原。Tanaka等[37]将鸡屈趾深肌腱撕裂后，在周期性张力作用下进行体外培养发现，14天后增殖的成纤维细胞包绕撕裂处，并沿张力方向排列，21天后张力作用下新生成纤维细胞渗入肌腱内层，而无张力作用时，成纤维细胞只分布在肌腱表面，证实了张力作用促进成纤维细胞的增殖和迁移，进而刺激胶原合成。因此，研究腱细胞在特定动态张应力环境下进行三维立体培养，可望获得新型人工活性肌腱。到目前为止，还未见有关肌腱细胞在张应力环境下进行三维培养的报道。
致谢：感谢华西医科大学附属第一医院骨科裴福兴教授、移植免疫研究室李幼平研究员对本文的指导；同时感谢华西医科大学附属第一医院骨科项舟博士、解慧琪博士对本文的帮助。
, 百拇医药
4 参考文献
1 Heineken FG, Skalak R. Tissue engineering: A brief overview. J Biomech Eng, 1991;113:111
2 Cima LG, Vacanti JP, Vacanti C et al. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates. J Biomech Eng, 1991;113:143
3 Vacanti CA, Upton J. Tissue engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices. Clin Plast Surg, 1994;21:445
, 百拇医药
4 Carrol RE, Andrew L, Robert E. Formation of tendon sheath by siliconerod implants. J Bone Joint Surg(Am), 1963:45(4):884
5 戴克戎，张佩蒂，俞昌泰等.人工肌腱的实验研究.上海医学，1983；6(2)：135
6 黄良夫，俞锦清，孙国平等.国产碳纤维编织带代肌腱、韧带临床应用.中华骨科杂志，1987；7(4)：390
7 毛宾尧，房清敏，刘洪涛等.碳纤维人工肌腱植入骨内的电镜观察.滨州医学院学报，1994；17(1)：97
8 毛宾尧，房清敏，刘洪涛等.碳素纤维人工肌腱植入骨内的力学强度测定.中国修复重建外科杂志，1996；10(1)：9
, http://www.100md.com
9 Alexander H, Weiss AB, Parsons JR et al. Ligament and tendon replacement with absorbable polymerfilamentous carbon tissue scaffolds. Trans Orthop Res Soc, 1979;4(1):27
10 李鸿凯编著.最新美容整形材料与用品.北京：北京出版社，1996：92～93
11 Kim WS, Vacanti JP, Cimer L et al. Cartilage engineered in predermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994;94(3):233
, http://www.100md.com 12 刘彦春，王 炜，曹谊林等.卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究.实用美容整形外科杂志，1997；8(5)：225
13 国家自然科学基金委员会.生物医学工程学.北京：科学出版社，1995：23～24
14 姚康德主编.智能材料——21世纪的新材料.天津：天津大学出版社，1996：1～2
15 Boyan BD, Hummert TW, Dean DD et al. Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response. Biomaterials, 1996;17(2):137
16 顾方舟主编.生物医学材料学.天津：天津科技翻译出版社，1993：483～485
, 百拇医药
17 Winger TM, Ludovice PJ, Chaikof EL. Lipopeptide conjugates: Biomolecular building blocks for receptor activating membrane-mimetic structures. Biomaterials, 1996;17(5):437
18 Kishida A, Takatsuka M, Matsuda T. RGD-Albumin conjugate: Expression of tissue regeneration activity. Biomaterials, 1992;13(13):924
19 Kleinman HK, Wilkes CM, Martin GR. Interaction of fibronectin with collagen fibrils. Biochemistry, 1981;20:2325
, 百拇医药
20 Doillon CJ, Frederick HS, Richard AB. Fibroblast growth on a porous collagen sponge containing hyaluronic acid and fibronectin. Biomaterials, 1987;8:195
21 Wojciak-Stothard B, Denyer M, Mishra M et al. Adhesion, orientation, and movement of cells cultured on ultrathin fibronectin fibers. In Vitro Cell Dev Biol, 1997;33:110
22 王维民，李永岚，高景恒等.动物皮肤、肌腱、软骨和骨的ECM制作.实用美容整形外科杂志，1997；8(5)：232
23 张友乐，杨克非，高新生等.冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究与临床应用.中华骨科杂志，1997；17(1)：59
, 百拇医药
24 Minami A, Ishii S, Ogino T et al. Effect of the immunological antigenitity of the allogeneic tendons on tendon grafting. The Hand, 1982;14(1):111
25 唐林俊，陈秉礼，丁钦蓉等.脱氧鸟苷培养处理的同种异体肌腱移植的实验研究.中华骨科杂志，1996；16(3)：175
26 蔚 凡，杨志明，彭文珍.人胚腱细胞体外培养及生物特性研究.中国修复重建外科杂志，1995；9(3)：161
27 项 舟，杨志明，魏大鹏等.类胰岛素生长因子-1促腱细胞生长的实验研究.中华手外科杂志，1997；13(3)：183
28 杨志明，项 舟，邹立群.类胰岛素生长因子-1作用下肌腱细胞的周期改变.中国修复重建外科杂志，1997；11(5)：296
, 百拇医药
29 项 舟，杨志明，夏庆杰等.类胰岛素生长因子-1及其受体mRNA在培养肌腱细胞内的表达.中国修复重建外科杂志，1997；11(6)：369
30 Ricci G. Morphological characteristics of tendon cells cultured on synthetic fibers. J Biomed Materials Research, 1984;18:1073
31 Goodship AE. An assesment of filamentous carbon fiber for the treatment of tendon injury in the horse. The Veterinary Record, 1980;8:217
32 张前法，杨志明，彭文珍.兔肌腱细胞和成纤维细胞与人工材料体外联合培养的形态学观察.中国修复重建外科杂志，1997；11(2)：103
, 百拇医药
33 张前法，杨志明，彭文珍.兔自体肌腱细胞与碳纤维联合培养后体内植入实验研究.中国修复重建外科杂志，1997；11(3)：168
34 Jenkins DHR, Forster IW, McKibbin B et al. Induction of tnedon and ligament formation by carbon implants. J Bone Joint Surg(Br), 1977;59(1):53
35 Forster IW, Ralis ZA, McKibbin B et al. Biological reaction to carbon fiber implants: The formation and structure of a carbon-induced “neotendon". Clin Orthop, 1978;131:299
36 Aragona J, Parsons JR, Alexander H et al. Soft tissue attachment of a filamentous carbon-absotbable polymer tendon and ligament replacement. Clin Orthop, 1981;160:268
37 Tanaka H, Manske PR, Pruitt DL et al. Effect of cyclic tension on lacerated flexor tendons in vitro. J Hand Surg, 1995;20(4):467
△ 国家自然科学基金、美国中华医学基金资助项目
(收稿：1998-02-20), 百拇医药
单位：* 华西医科大学附属第一医院骨科(四川成都，610041)
关键词：细胞外基质；肌腱细胞；组织工程化肌腱
组织工程化肌腱研究进展 摘 要 对组织工程化肌腱领域中目前研究的主要成果进行综述，着重阐述了肌腱细胞外基质替代物、肌腱细胞生物学性质及肌腱细胞与细胞外基质材料复合研究中的主要问题。认为，研制适于肌腱细胞生长、粘附和发挥功能的细胞外基质材料；建立生长、增殖可调控的肌腱细胞系；在模拟体内力学条件下，进行肌腱细胞三维培养，将是研究具有特定修复功能的组织工程化肌腱的重要问题。
THE RECENT ADVANCES IN THE STUDY OF TISSUE ENGINEERING TENDON/Qin Tingwu, Yang Zhiming. Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu Sichuan, P.R. China 610041
, http://www.100md.com
Abstract This paper reviewed the main achievements in the research on tissue engineering tendon, focusing on major problems concerning the substitute for extracellular matrix (ECM) of tendon, biological characteristics of tendon cells, and tendon cells compounding with ECM substitute. It was concluded the important problems in the study of the tissue engineering having specific reparative functions could be: to prepare the ECM materials suitable for the tendon cells to attach, grow, and function; to establish the tendon cell line whose growth, proliferation, and immunological antigenicity could be modulated and controlled, and simulating the mechanical environment of tendon in vivo, to adopt three-dimensional tendon cell culture method.
, 百拇医药
Key words Extracellular matrix Tendon cell Tissue engineering tendon
肌腱损伤或缺失后，其手术修复和功能重建是手外科十分重要的研究课题之一。现代外科的发展已使人类替换病损肌腱成为现实。替换物包括异种肌腱、同种异体肌腱、自体肌腱和人工合成材料等。异种肌腱引起相当快速的排斥反应；同种异体肌腱移植尽管在形态方面与自体肌腱相似，在术后早期可被宿主短时间接受，但排斥反应仍可发生；自体肌腱移植会造成供区损伤，以及所能供给的肌腱存在局限性；人工合成材料代肌腱植入后引起异物反应，继发感染及裸露等。这些问题的存在均迫使研究者们寻求新的、更为理想的肌腱替代物。随着细胞培养、材料科学及细胞移植等技术的迅速发展，组织工程(Tissue Engineering)[1]的诞生，使有生命的生物代用品的研制成为可能。已有学者将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，然后将它们移植到动物体内，达到形成新的、有功能的组织的目的[2，3]。在组织工程技术的推动下，组织工程化肌腱研究得到前所未有的发展。到目前为止，关于组织工程化肌腱的研究主要包括三个方面内容：①肌腱细胞外基质替代物的研究；②肌腱细胞生物学性质的研究；③肌腱细胞与细胞外基质复合的研究。现将有关研究结果综述如下。
, 百拇医药
1 肌腱细胞外基质替代物的研究
肌腱是由形态相似、 功能相关的肌腱细胞和细胞外基质组成。细胞外基质是肌腱细胞附着的基本框架和代谢场所。因此，它的形态和功能直接影响其所构成的肌腱的形态和功能，其替代物的研究也就成为组织工程化肌腱的研究内容之一。
1.1 人工合成细胞外基质替代物的研究
自从1910年Lange用浸过石蜡的丝线首先以非生物材料进行游离肌腱移植以来，人们已经采用过许多代用品，如人发辫、尼龙带、蚕丝及涤纶等，特别是60年代以来，人工合成的高分子材料层出不穷，国内外学者已广泛用于临床。其中比较好的材料是硅橡胶制品和碳素纤维，这些材料被认为具有理化性质稳定、不随时间老化、无毒性、无抗原性和不致癌等优点，原则上均可作细胞外基质材料。
硅橡胶耐受拉应力极差，又易于撕裂，难于缝合，不适于作为肌腱细胞外基质材料[4]。戴克戎等[5]以硅橡胶、桑蚕丝和涤纶制成“中空”人工肌腱构架，改善了其抗张强度差的缺点，但用于手部“无人区”时反应较大。黄良夫等[6]认为，碳纤维编织带应用于临床手术实践是一种良好的生物工程材料。近年来的研究表明，碳纤维编织带仍存在许多缺点，它不能作为永久性肌腱构架，植入体内最终被逐渐降解、碎裂[7]。毛宾尧等[8]研究发现，碳纤维作为肌腱支架植入骨和软组织内第6周即开始裂解，认为若不对碳纤维在体内的裂解速度进行改进，将影响碳纤维作为肌腱植入材料的临床应用。
, 百拇医药
Alexander等[9]用碳纤维与聚乳酸(polylactic acid, PLA)的复合物作为肌腱构架，碳纤维提供组织生长的支架，聚乳酸对碳纤维的降解速度进行调节，这种复合物构架具有较强的抗张特性，但柔韧性差。实际中将聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)与PLA共聚，可得到机械性能好，柔韧性好，降解速度可改变的聚合物框架[10]。PGA+PLA是目前组织工程领域应用最广泛的ECM[11]，其存在亲水性差和对细胞吸附力弱等问题。人们在寻找理想的物质来包埋PGA+PLA，增加其亲水性和增强对细胞的吸附力。有学者对PGA+PLA进行包埋，以观察材料对软骨细胞的吸附力改变[12]，这种复合支架用于组织工程化肌腱研究还未见报道。
近年来，随着生命科学和材料科学的相互渗透，发现“惰性、无毒性”的生物材料并不是理想的细胞外基质材料，利用工程学方法将特定信号识别功能的生物分子与现有材料结合，新一代的有特定修复功能的“智能”支架材料是当前生物材料研究领域的前沿课题[13，14]。在ECM研究中，直接也是最先与组织、细胞相接触的是材料表面，因此材料表面性质的不同将影响细胞吸附、增殖及分化等一系列功能[15]。现代物理学和化学的发展，使人们完全有能力对材料表面进行修饰，通过生物化处理及分子设计[16]，使表面蛋白吸附层的蛋白变为单一蛋白，通过控制粘附蛋白来对细胞与生物材料的粘附、增殖及分化等一系列功能进行预测和监控，使反应由随机到有序，由非特异性到特异性。目前，对材料表面进行分子生物学设计，主要是将一些有生理功能的物质如蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子等固定在材料表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体[17]，使表面形成一个能与细胞相适应的过渡层。细胞与其周围环境的反应是通过专门粘附蛋白来进行的，如间充质细胞倾向于利用纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)吸附在细胞外基质的胶原上，FN在组织再生的各个阶段起着多种作用，调节细胞粘附，为细胞运动充当临时基质[18]。Kleinman 等[19]研究发现，FN可直接与胶原纤维连接，Doillon等[20]认为，这种连接促进了成纤维细胞向胶原纤维间渗透，而且增加了胶原纤维对成纤维细胞的吸附性。Wojciak-Stothard等[21]的实验表明，FN作为ECM的一种成分，可明显地影响鼠肌腱细胞的活性。显然，对肌腱细胞外基质进行表面修饰，对组织工程化肌腱的构建是至关重要的，这方面的研究有待进一步开展。
, 百拇医药
1.2 天然的肌腱细胞外基质研究
肌腱的组织成分主要是由胶原纤维组成的粗大纤维束，平行排列，其方向与所承受的牵引力一致。纤维具有韧性，抗牵引力强。原纤维的主要成分是胶原蛋白，因此胶原可以作为组织工程化肌腱的ECM支架。
王维民等[22]用动物的肌腱，经组织工程学方法处理，脱去肌腱细胞，获得了天然的ECM(nature extracellular matrix, NECM)胶原支架，这种支架的抗原性大为降低。张友乐等[23]将异体肌腱进行冷冻干燥处理，不仅明显降低了组织的抗原作用，而且经水合后仍然保留肌腱的基本结构和酶的活性，其力学特性未改变，移植后组织修复能力同自体肌腱。Minami等[24]对同种异体肌腱作为移植供体的免疫抗原性进行实验研究，指出肌腱的胶原成分不显示、不表达主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)，肌腱组织的免疫抗原性是由肌腱细胞成分来表达的。通过冷冻、融化或多聚甲醛处理，可以降低腱细胞的抗原性，而用X线照射、戊二醛和丝裂霉素C等杀肿瘤细胞的处理方法，却不能达到去除腱细胞抗原性的作用。目前通常采用冷冻、冻干及化学处理等方法破坏肌腱中细胞成分，从而降低其抗原性[25]。在天然的肌腱细胞外基质研究方面，尚有不同来源的蛋白基质的力学性质较差，生理学性质不稳定和外来胶原所引起的免疫反应等问题未能彻底解决。
, 百拇医药
2 肌腱细胞生物学特性研究
组织工程化肌腱研究中，移植后的人工活性肌腱能否实现被替代肌腱的功能，肌腱细胞能否适应受区的环境，肌腱细胞的种植浓度对组织工程化的影响，以及肌腱细胞作为种子细胞所具有的生物学特性均是组织工程化肌腱必须研究的问题。
肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，它合成和分泌胶原，接受机体的神经-体液调控，维系肌腱组织的新陈代谢。肌腱细胞是一种分化程度很高的细胞，在体外培养条件下，肌腱细胞增殖相对缓慢，尤其是在经多次传代后，肌腱细胞甚至丧失进入增殖期的能力。这对组织工程化肌腱的研究是不利的。因此，寻找调控肌腱细胞生长的方法是研究的主要问题。
在促进肌腱细胞分裂增殖研究方面，蔚凡等[26]已成功地建立了人胚肌腱细胞系，并建立了一套肌腱细胞分离、纯化、培养及冻存复苏的方法。以此为基础，在培养基中加入胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)，观察其对肌腱细胞生长的作用。结果发现，IGF-1对肌腱细胞的增殖有明显的促进作用，并且在一定浓度范围内有量效依赖关系[27]。为了明确IGF-1促进肌腱细胞生长的作用机制，进一步研究了IGF-1作用后细胞周期的改变，结果表明，IGF-1对肌腱细胞生长的促进作用是通过加快G1期和G2M期的进程实现的[28]。IGF-1受体系统的活跃是维持细胞增殖能力的重要保证，而IGF-1 mRNA在多次传代(第13代)的肌腱细胞中不表达，是导致肌腱细胞出现增殖能力下降等细胞衰老现象的重要因素之一[29]。显然，在肌腱细胞中增强IGF-1 mRNA的表达能否逆转这一细胞衰老现象，或者阻断IGF-1及其受体mRNA的表达能否抑制细胞过度增殖，这将是组织工程化肌腱研究中值得进一步研究的内容。
, 百拇医药
组织工程化肌腱要大规模实施，不能只限于用自体肌腱细胞构建人工活性肌腱，必须解决肌腱细胞移植的免疫排斥问题。研究肌腱细胞及其产物的抗原性和产生机制，降低人体抗原性的方法仍然是组织工程化肌腱研究的重要问题。
肌腱细胞的永生化，是肌腱细胞获得持续生长增殖能力的特性。对腱细胞的永生化不仅在于在排除或控制其致肿瘤的可能性后用于构建人工活性肌腱，更重要的是在于利用它保存了细胞的功能特性和容易长期大量繁殖的特性，为研究肌腱细胞的免疫学和体外构建模式等方面提供容易繁殖的标准细胞株。华西医科大学已经用温度敏感型SV40大T抗原质粒ptsA58H导入肌腱细胞株，成功地为肌腱细胞标准细胞株建立了转化模型。目前，对肌腱细胞永生化还需进行深入研究。
3 肌腱细胞与人工材料复合的研究
组织工程化肌腱的研究目的是获得人工活性肌腱，即体外预制肌腱并将其植入体内，以取代因疾病、损伤而无功能的肌腱。人工活性肌腱必须具备无抗原性，来源不受限，按预先塑形，具有生命力。人工活性肌腱是在肌腱细胞外基质替代物开发和肌腱细胞生物特性的综合研究基础上，借助于肌腱细胞与细胞外基质材料复合培养和移植技术而获得的。其中肌腱细胞在模拟体内力学条件下的三维立体培养，即将肌腱细胞种植于三维细胞外基质构架中，空间上不限制肌腱细胞的立体增殖，从而形成新型人工活性肌腱。在模拟体内力学条件下，在立体空间进行肌腱细胞三维培养是组织工程化肌腱研究中的一个重要问题。
, 百拇医药
Ricci[30]将肌腱段与碳纤维联合进行体外培养，发现培养24小时后有圆形细胞从肌腱段向外逸出，5天后有两种形态的细胞座落在材料表面，细胞间相互衔接，同时在材料上单个细胞突起更长，其突起沿材料纵轴发展。Goodship[31]取小马的肺组织进行体外成纤维细胞与单根碳纤维混合培养发现，细胞吸附于单根碳纤维上，碳纤维上细胞随培养时间增多，形成“鞘状”包绕碳纤维，细胞在碳纤维上爬行方向与碳纤维一致，经历了分裂增殖。
张前法等[32]将兔肌腱细胞与碳纤维联合进行体外静态培养，结果发现碳纤维与腱细胞相容性好，有良好的吸附性；腱细胞在碳纤维上呈串珠状排列，多个腱细胞包绕碳纤维编织带，碳纤维间有网状纤维缠绕。进一步研究了兔自体腱细胞与碳纤维联合培养后植入体内的改变，发现肌腱细胞脱离碳纤维支架，在编织带间增殖，合成胶原，其胶原纤维相互衔接，形成致密的组织结构；腱细胞在碳纤维间排列整齐，均匀，胶原纤维间相互连接形成网状，纤维条索主体与碳纤维方向一致[33]。Jenkins等[34]用碳纤维桥接成年羊跟腱缺损，8周后发现碳纤维周围及单根碳纤维间充满了腱细胞样组织结构，这些结构沿着碳纤维按一个方向排列。他们认为，碳纤维诱发的这种腱样组织结构形成的关键因素是碳纤维力学性能逐渐丧失，使新形成的胶原承受的载荷逐渐增大，从而促进了肌腱细胞按应力方向取向并分泌胶原所致。Forster等[35]的实验进一步证实了上述推测。Aragona等[36]将碳纤维与聚乳酸的复合物植入兔跟腱断端，发现术后8周碳纤维形成明显的组织内生，这些新生的胶原组织按一个方向渗透到植入物中，植入物周围成纤维细胞活跃，取向排列，至12周时更明显。新生组织高度结合，成纤维细胞和胶原均按纵向排列，碳纤维复合物被完全渗透。他们认为，这种组织细胞向复合物渗入与植入物牢固的生物固定，进而有正常的应力作用于植入物有关。毛宾尧等[8]将碳素纤维植入兔的胫骨内，进行力学强度测定表明，术后8周，碳纤维与周围组织无间隙，并有显著的碳纤维裂解，外周间隙为胶原纤维、成骨细胞等所填充，植入物抗张强度中包含新生的胶原纤维在碳纤维间的抗张潜能，在载荷-变形曲线上表现为一长的平段，显示“诱发腱”的抗张强度，具有一定的柔韧性。
, http://www.100md.com
综合上述各项研究表明，在静态培养条件下，肌腱细胞与碳纤维编织带进行联合培养，腱细胞在编织带表面生长，分泌胶原取决于碳纤维的取向排列；而在体内植入实验中，腱细胞能脱离碳纤维，在其间生长、分泌胶原；腱细胞和分泌的胶原有明显的取向性，沿碳纤维平行排列。实际上体内植入后腱细胞处在动态环境中，这种动态环境提供了一个张应力环境，进而使腱细胞在此环境下生长、分泌胶原。Tanaka等[37]将鸡屈趾深肌腱撕裂后，在周期性张力作用下进行体外培养发现，14天后增殖的成纤维细胞包绕撕裂处，并沿张力方向排列，21天后张力作用下新生成纤维细胞渗入肌腱内层，而无张力作用时，成纤维细胞只分布在肌腱表面，证实了张力作用促进成纤维细胞的增殖和迁移，进而刺激胶原合成。因此，研究腱细胞在特定动态张应力环境下进行三维立体培养，可望获得新型人工活性肌腱。到目前为止，还未见有关肌腱细胞在张应力环境下进行三维培养的报道。
致谢：感谢华西医科大学附属第一医院骨科裴福兴教授、移植免疫研究室李幼平研究员对本文的指导；同时感谢华西医科大学附属第一医院骨科项舟博士、解慧琪博士对本文的帮助。
, 百拇医药
4 参考文献
1 Heineken FG, Skalak R. Tissue engineering: A brief overview. J Biomech Eng, 1991;113:111
2 Cima LG, Vacanti JP, Vacanti C et al. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates. J Biomech Eng, 1991;113:143
3 Vacanti CA, Upton J. Tissue engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices. Clin Plast Surg, 1994;21:445
, 百拇医药
4 Carrol RE, Andrew L, Robert E. Formation of tendon sheath by siliconerod implants. J Bone Joint Surg(Am), 1963:45(4):884
5 戴克戎，张佩蒂，俞昌泰等.人工肌腱的实验研究.上海医学，1983；6(2)：135
6 黄良夫，俞锦清，孙国平等.国产碳纤维编织带代肌腱、韧带临床应用.中华骨科杂志，1987；7(4)：390
7 毛宾尧，房清敏，刘洪涛等.碳纤维人工肌腱植入骨内的电镜观察.滨州医学院学报，1994；17(1)：97
8 毛宾尧，房清敏，刘洪涛等.碳素纤维人工肌腱植入骨内的力学强度测定.中国修复重建外科杂志，1996；10(1)：9
, http://www.100md.com
9 Alexander H, Weiss AB, Parsons JR et al. Ligament and tendon replacement with absorbable polymerfilamentous carbon tissue scaffolds. Trans Orthop Res Soc, 1979;4(1):27
10 李鸿凯编著.最新美容整形材料与用品.北京：北京出版社，1996：92～93
11 Kim WS, Vacanti JP, Cimer L et al. Cartilage engineered in predermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994;94(3):233
, http://www.100md.com 12 刘彦春，王 炜，曹谊林等.卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究.实用美容整形外科杂志，1997；8(5)：225
13 国家自然科学基金委员会.生物医学工程学.北京：科学出版社，1995：23～24
14 姚康德主编.智能材料——21世纪的新材料.天津：天津大学出版社，1996：1～2
15 Boyan BD, Hummert TW, Dean DD et al. Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response. Biomaterials, 1996;17(2):137
16 顾方舟主编.生物医学材料学.天津：天津科技翻译出版社，1993：483～485
, 百拇医药
17 Winger TM, Ludovice PJ, Chaikof EL. Lipopeptide conjugates: Biomolecular building blocks for receptor activating membrane-mimetic structures. Biomaterials, 1996;17(5):437
18 Kishida A, Takatsuka M, Matsuda T. RGD-Albumin conjugate: Expression of tissue regeneration activity. Biomaterials, 1992;13(13):924
19 Kleinman HK, Wilkes CM, Martin GR. Interaction of fibronectin with collagen fibrils. Biochemistry, 1981;20:2325
, 百拇医药
20 Doillon CJ, Frederick HS, Richard AB. Fibroblast growth on a porous collagen sponge containing hyaluronic acid and fibronectin. Biomaterials, 1987;8:195
21 Wojciak-Stothard B, Denyer M, Mishra M et al. Adhesion, orientation, and movement of cells cultured on ultrathin fibronectin fibers. In Vitro Cell Dev Biol, 1997;33:110
22 王维民，李永岚，高景恒等.动物皮肤、肌腱、软骨和骨的ECM制作.实用美容整形外科杂志，1997；8(5)：232
23 张友乐，杨克非，高新生等.冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究与临床应用.中华骨科杂志，1997；17(1)：59
, 百拇医药
24 Minami A, Ishii S, Ogino T et al. Effect of the immunological antigenitity of the allogeneic tendons on tendon grafting. The Hand, 1982;14(1):111
25 唐林俊，陈秉礼，丁钦蓉等.脱氧鸟苷培养处理的同种异体肌腱移植的实验研究.中华骨科杂志，1996；16(3)：175
26 蔚 凡，杨志明，彭文珍.人胚腱细胞体外培养及生物特性研究.中国修复重建外科杂志，1995；9(3)：161
27 项 舟，杨志明，魏大鹏等.类胰岛素生长因子-1促腱细胞生长的实验研究.中华手外科杂志，1997；13(3)：183
28 杨志明，项 舟，邹立群.类胰岛素生长因子-1作用下肌腱细胞的周期改变.中国修复重建外科杂志，1997；11(5)：296
, 百拇医药
29 项 舟，杨志明，夏庆杰等.类胰岛素生长因子-1及其受体mRNA在培养肌腱细胞内的表达.中国修复重建外科杂志，1997；11(6)：369
30 Ricci G. Morphological characteristics of tendon cells cultured on synthetic fibers. J Biomed Materials Research, 1984;18:1073
31 Goodship AE. An assesment of filamentous carbon fiber for the treatment of tendon injury in the horse. The Veterinary Record, 1980;8:217
32 张前法，杨志明，彭文珍.兔肌腱细胞和成纤维细胞与人工材料体外联合培养的形态学观察.中国修复重建外科杂志，1997；11(2)：103
, 百拇医药
33 张前法，杨志明，彭文珍.兔自体肌腱细胞与碳纤维联合培养后体内植入实验研究.中国修复重建外科杂志，1997；11(3)：168
34 Jenkins DHR, Forster IW, McKibbin B et al. Induction of tnedon and ligament formation by carbon implants. J Bone Joint Surg(Br), 1977;59(1):53
35 Forster IW, Ralis ZA, McKibbin B et al. Biological reaction to carbon fiber implants: The formation and structure of a carbon-induced “neotendon". Clin Orthop, 1978;131:299
36 Aragona J, Parsons JR, Alexander H et al. Soft tissue attachment of a filamentous carbon-absotbable polymer tendon and ligament replacement. Clin Orthop, 1981;160:268
37 Tanaka H, Manske PR, Pruitt DL et al. Effect of cyclic tension on lacerated flexor tendons in vitro. J Hand Surg, 1995;20(4):467
△ 国家自然科学基金、美国中华医学基金资助项目
(收稿：1998-02-20), 百拇医药