应用显微外科技术重建食管45例
作者：李安富* 杨 力* 段振泉* 黄金林* 孙 强*程国良* 杨志贤* 马春山* 常 青*
单位：* 解放军第401医院外科(山东青岛，266071)
关键词：食管重建；显微外科技术； 食管癌
中国修复重建外科杂志980406 摘 要 应用流式细胞技术对32例手指挤压、绞轧伤断指患者再植前后外周血血小板p-选择素(CD62p)进行了检测。选择CD62p明显增高的17例患者，采用大剂量尿激酶等有效抗凝治疗，术后第2，3天再进行CD62p检测。结果显示，术前及术后外周血CD62p均较正常对照组增加，有显著性差异(P<0.01)；术后第2，3天的CD62p检查结果大致在正常范围，临床上血管危象的发生亦明显减少。提示，对于挤压、绞轧等创伤较重的断指，易出现高血凝状态，应特别注意抗凝措施，以提高再植成活率。CD62p检测可以作为灵敏的血小板活化指标，有助于预测高血凝状态。
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THE FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF ACTIVATED PLATELETS OF SEVERED FINGER BY SEVERE INJURY BEFORE AND AFTER REPLANTATION/Zhao Gang, Cai Jinfang, Liu Bingrui et al. Department of Orthopedic Surgery, Jinan Military General Hospital, Jinan, Shandong, P.R. China 250031
Abstract To investigate the significance of activated platelet levels before and after surgical operation in patients with severed finger by severe injury, the P-selectin (CD62p) positive platelet percent in peripheral blood was studied in 32 patients before and after operation by flow cytometric immunology. At the second and third day after operation, seventeen patients, which in a high positive platelet percent, were measured again after anticoagulation treatment with a large dose of urokinase etc. The results were that the levels of CD62p positive platelet in peripheral blood before and after operation were significantly higher than that of the normal group (P<0.01). The CD62p positive platelet percent was increased not much more in the anti-coaggulation patients than in the normal ones (P>0.05). There were a few vascular crisis observed. This study suggested that severed fingers by a crushing or wringing injury enhance the platelet activity and resulted in hypercoagulation, thus anti-coagulation measures should be taken to avoid possible thrombosis and improve the survival rate of replantation. CD62p was one of the sensitive indices of activated platelet, which could be used in calculating hypercoagulation accurately.
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Key words Replantation of severed finger Hypercoagulation Activated platelet Thrombosis
挤压、绞轧性手指离断，部分患者伤后出现高血凝状态，影响再植断指的成活。近年来不少研究表明，血小板的活化与血栓形成关系密切。我们的研究旨在利用流式细胞技术探索血小板活化与挤压、绞轧性断指出现高血凝状态的一般规律和相应的对策。报道如下。
1 材料与方法
1.1 临床资料
本组男27例，女5例。年龄9岁～64岁。均为手指完全离断，2指以上完全离断6例，单指离断26例。冲床挤压伤23例，机器或皮革绞轧伤9例。除1例合并前臂及腕掌部软组织挤压伤，中指移位再造拇指失败外，其余全部成活。所有患者在术前15分钟、术后15分钟抽肘静脉血2 ml送检。17例初检结果，血小板p-选择素(cluster of differentiation 62 platelet, CD62p)明显升高者，除采用肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等常规治疗外，再应用大剂量尿激酶(平均10万U/日～20万U/日)抗凝治疗，术后第2， 3天晨， 再各抽肘静脉血2 ml送检。采血均以乙二胺四乙酸1∶9抗凝。健康成人40例作为对照，晨起抽肘静脉血，抽血量、抗凝法均同上。
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1.2 实验方法
1.2.1 特殊试剂 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanete, FITC)标记的鼠抗人p-选择素(CD62p-FITC)及阴性对照羊抗鼠IgG1(labeled immunglobuliu G1，IgG1-FITC)均由法国国际免疫公司提供。
1.2.2 多血小板血清的制备 抽静脉血2 ml，乙二胺四乙酸1∶9抗凝，800 r/min离心5分钟，取上层血清即为富含血小板血清，调整血小板数1×106/ml。4℃保存，时间不超过24小时。
1.2.3 免疫反应 取两支试管，均加多血小板血清100 μl，再分别加入CD62p-FITC工作液和阴性对照单抗IgG1-FITC工作液20 μl，均避光反应30分钟，2 000 r/min离心15分钟，PBS 2 ml漂洗，离心同上，去上清液加PBS 500 μl待测。
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1.2.4 流式细胞仪(FACS can型，美国BD公司生产)检测 上机前以标准荧光微球调整仪器，使其变异系数稳定在2%以内，上机后收集2万个血小板，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用Cell Quest Plot软件(BD公司生产)分析数据。血小板CD62p含量以其阳性血小板百分率表示，记算方法如下：
1.2.5 医学统计方法 均采用t检验。
2 结果
对照组外周血CD62p阳性血小板含量为(1.38±0.87)%。手术前、后断指患者外周血CD62p阳性血小板含量分别为(3.82±0.75)%，(4.36±0.54)%。术后第2，3天外周血CD62p阳性血小板含量分别为(1.97±0.76)%，(1.74±0.67)%。t检验证实再植手术前、后患者血小板CD62p阳性率与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。采用大剂量尿激酶、肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等抗凝治疗后的术后第2，3天组，分别与对照组比较无显著差异(P>0.05)，而分别与手术前、后组比较有显著性差异(P<0.05)。
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3 讨论
CD62p抗原分子量为140 ku，它介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的粘附；它在血小板α-颗粒内表达，经激活或凝血酶刺激后，此抗原转移到血小板和内皮细胞表面，使血小板成为活化血小板[1，2]。近几年的研究证明[1～4]，血小板活化与血栓性疾病关系密切。由于挤压、绞轧伤断指组织及血管内皮的损伤，对血小板有明显的活化作用，临床上虽有学者[5]对高血凝状态与断指再植的关系进行过研究，提出了不少有益的见解，但至今尚未见有关血小板活化与断指再植方面的研究报道。传统的检验方法如血小板计数、血小板粘附性试验、凝血酶原时间、抗凝血酶活性及血液流变学常规检查，综合起来进行分析，也可以大致判断机体的高血凝状态，指导治疗。但由于方法和影响因素的多样性，临床应用比较繁琐，且有一定的不准确性。我们应用流式细胞技术对挤压、绞轧断指患者血小板CD62p进行了定量研究，此方法简便、准确及快速，能够预测血小板的活化状态，为断指再植患者防凝及抗凝提供客观依据。顾玉东等[6]研究认为，血管内皮细胞的修复在术后72小时，可完成总体的47%左右，即再植手术3天后，血栓形成的机率明显下降。因此，再植术后的前3天预防血栓形成所致的血管危象尤为重要。本组选择CD62p检测结果明显增高者，采用尿激酶、肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等治疗后，再于术后动态测定CD62p，证明及时、有效的抗凝治疗，可使血小板活化率稳定在大致正常的范围内，明显降低了血栓形成的机率。CD62p可准确预测断指患者外周血的高血凝状态，指导抗凝治疗。
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4 参考文献
1 Lucia G, Piet WM, Albert EG et al. P-selectin ca-depandent adhesion of activeatated platelets to many different types of leukocytes: Detection by flow cytometry. Blood, 1992;80(2):134
2 McEver RP. Propertis of GMP-140 an inducible granule membrane protein of platelets and endothelium. Blood, 1990;16(1):73
3 王建中，孙 荠，王淑娟等.流式细胞术检测活化血小板.中华医学检验杂志，1994；17(4)：232
4 Peter S, Barbara G, Wolfgang M. Flow cytometric detection of intracellular platelet antigens. Cytometry, 1996;23(3):284
5 范启申，王成琪，曹 斌等.高血凝状态在断指再植后的临床研究.中华手外科杂志，1994；10(4)：209
6 顾玉东，李继峰，姜继福等.血管内皮细胞愈合机制的探讨.中华显微外科杂志，1989；12(4)：220
(收稿：1998-02-18), http://www.100md.com
单位：* 解放军第401医院外科(山东青岛，266071)
关键词：食管重建；显微外科技术； 食管癌
中国修复重建外科杂志980406 摘 要 应用流式细胞技术对32例手指挤压、绞轧伤断指患者再植前后外周血血小板p-选择素(CD62p)进行了检测。选择CD62p明显增高的17例患者，采用大剂量尿激酶等有效抗凝治疗，术后第2，3天再进行CD62p检测。结果显示，术前及术后外周血CD62p均较正常对照组增加，有显著性差异(P<0.01)；术后第2，3天的CD62p检查结果大致在正常范围，临床上血管危象的发生亦明显减少。提示，对于挤压、绞轧等创伤较重的断指，易出现高血凝状态，应特别注意抗凝措施，以提高再植成活率。CD62p检测可以作为灵敏的血小板活化指标，有助于预测高血凝状态。
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THE FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF ACTIVATED PLATELETS OF SEVERED FINGER BY SEVERE INJURY BEFORE AND AFTER REPLANTATION/Zhao Gang, Cai Jinfang, Liu Bingrui et al. Department of Orthopedic Surgery, Jinan Military General Hospital, Jinan, Shandong, P.R. China 250031
Abstract To investigate the significance of activated platelet levels before and after surgical operation in patients with severed finger by severe injury, the P-selectin (CD62p) positive platelet percent in peripheral blood was studied in 32 patients before and after operation by flow cytometric immunology. At the second and third day after operation, seventeen patients, which in a high positive platelet percent, were measured again after anticoagulation treatment with a large dose of urokinase etc. The results were that the levels of CD62p positive platelet in peripheral blood before and after operation were significantly higher than that of the normal group (P<0.01). The CD62p positive platelet percent was increased not much more in the anti-coaggulation patients than in the normal ones (P>0.05). There were a few vascular crisis observed. This study suggested that severed fingers by a crushing or wringing injury enhance the platelet activity and resulted in hypercoagulation, thus anti-coagulation measures should be taken to avoid possible thrombosis and improve the survival rate of replantation. CD62p was one of the sensitive indices of activated platelet, which could be used in calculating hypercoagulation accurately.
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Key words Replantation of severed finger Hypercoagulation Activated platelet Thrombosis
挤压、绞轧性手指离断，部分患者伤后出现高血凝状态，影响再植断指的成活。近年来不少研究表明，血小板的活化与血栓形成关系密切。我们的研究旨在利用流式细胞技术探索血小板活化与挤压、绞轧性断指出现高血凝状态的一般规律和相应的对策。报道如下。
1 材料与方法
1.1 临床资料
本组男27例，女5例。年龄9岁～64岁。均为手指完全离断，2指以上完全离断6例，单指离断26例。冲床挤压伤23例，机器或皮革绞轧伤9例。除1例合并前臂及腕掌部软组织挤压伤，中指移位再造拇指失败外，其余全部成活。所有患者在术前15分钟、术后15分钟抽肘静脉血2 ml送检。17例初检结果，血小板p-选择素(cluster of differentiation 62 platelet, CD62p)明显升高者，除采用肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等常规治疗外，再应用大剂量尿激酶(平均10万U/日～20万U/日)抗凝治疗，术后第2， 3天晨， 再各抽肘静脉血2 ml送检。采血均以乙二胺四乙酸1∶9抗凝。健康成人40例作为对照，晨起抽肘静脉血，抽血量、抗凝法均同上。
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1.2 实验方法
1.2.1 特殊试剂 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanete, FITC)标记的鼠抗人p-选择素(CD62p-FITC)及阴性对照羊抗鼠IgG1(labeled immunglobuliu G1，IgG1-FITC)均由法国国际免疫公司提供。
1.2.2 多血小板血清的制备 抽静脉血2 ml，乙二胺四乙酸1∶9抗凝，800 r/min离心5分钟，取上层血清即为富含血小板血清，调整血小板数1×106/ml。4℃保存，时间不超过24小时。
1.2.3 免疫反应 取两支试管，均加多血小板血清100 μl，再分别加入CD62p-FITC工作液和阴性对照单抗IgG1-FITC工作液20 μl，均避光反应30分钟，2 000 r/min离心15分钟，PBS 2 ml漂洗，离心同上，去上清液加PBS 500 μl待测。
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1.2.4 流式细胞仪(FACS can型，美国BD公司生产)检测 上机前以标准荧光微球调整仪器，使其变异系数稳定在2%以内，上机后收集2万个血小板，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用Cell Quest Plot软件(BD公司生产)分析数据。血小板CD62p含量以其阳性血小板百分率表示，记算方法如下：
1.2.5 医学统计方法 均采用t检验。
2 结果
对照组外周血CD62p阳性血小板含量为(1.38±0.87)%。手术前、后断指患者外周血CD62p阳性血小板含量分别为(3.82±0.75)%，(4.36±0.54)%。术后第2，3天外周血CD62p阳性血小板含量分别为(1.97±0.76)%，(1.74±0.67)%。t检验证实再植手术前、后患者血小板CD62p阳性率与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。采用大剂量尿激酶、肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等抗凝治疗后的术后第2，3天组，分别与对照组比较无显著差异(P>0.05)，而分别与手术前、后组比较有显著性差异(P<0.05)。
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3 讨论
CD62p抗原分子量为140 ku，它介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的粘附；它在血小板α-颗粒内表达，经激活或凝血酶刺激后，此抗原转移到血小板和内皮细胞表面，使血小板成为活化血小板[1，2]。近几年的研究证明[1～4]，血小板活化与血栓性疾病关系密切。由于挤压、绞轧伤断指组织及血管内皮的损伤，对血小板有明显的活化作用，临床上虽有学者[5]对高血凝状态与断指再植的关系进行过研究，提出了不少有益的见解，但至今尚未见有关血小板活化与断指再植方面的研究报道。传统的检验方法如血小板计数、血小板粘附性试验、凝血酶原时间、抗凝血酶活性及血液流变学常规检查，综合起来进行分析，也可以大致判断机体的高血凝状态，指导治疗。但由于方法和影响因素的多样性，临床应用比较繁琐，且有一定的不准确性。我们应用流式细胞技术对挤压、绞轧断指患者血小板CD62p进行了定量研究，此方法简便、准确及快速，能够预测血小板的活化状态，为断指再植患者防凝及抗凝提供客观依据。顾玉东等[6]研究认为，血管内皮细胞的修复在术后72小时，可完成总体的47%左右，即再植手术3天后，血栓形成的机率明显下降。因此，再植术后的前3天预防血栓形成所致的血管危象尤为重要。本组选择CD62p检测结果明显增高者，采用尿激酶、肠溶阿斯匹林和低分子右旋糖酐等治疗后，再于术后动态测定CD62p，证明及时、有效的抗凝治疗，可使血小板活化率稳定在大致正常的范围内，明显降低了血栓形成的机率。CD62p可准确预测断指患者外周血的高血凝状态，指导抗凝治疗。
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4 参考文献
1 Lucia G, Piet WM, Albert EG et al. P-selectin ca-depandent adhesion of activeatated platelets to many different types of leukocytes: Detection by flow cytometry. Blood, 1992;80(2):134
2 McEver RP. Propertis of GMP-140 an inducible granule membrane protein of platelets and endothelium. Blood, 1990;16(1):73
3 王建中，孙 荠，王淑娟等.流式细胞术检测活化血小板.中华医学检验杂志，1994；17(4)：232
4 Peter S, Barbara G, Wolfgang M. Flow cytometric detection of intracellular platelet antigens. Cytometry, 1996;23(3):284
5 范启申，王成琪，曹 斌等.高血凝状态在断指再植后的临床研究.中华手外科杂志，1994；10(4)：209
6 顾玉东，李继峰，姜继福等.血管内皮细胞愈合机制的探讨.中华显微外科杂志，1989；12(4)：220
(收稿：1998-02-18), http://www.100md.com