急性应激诱导即时反应基因c-fos和c-jun的表达I：c-fos和c-jun表达的时效性
作者：陆 林 刘协和 Mednick SA 李毅
单位：陆林，刘协和，华西医科大学附一院心理卫生研究所，610041；Mednick SA，美国南加利福尼亚大学行为遗传学系；李毅，四川大学图形图像研究所
关键词：应激；c-fos；c-jun；时效性；下丘脑；海马
中国行为医学科学980402.htm
【摘要】 目的 研究下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白的表达与应激反应之间的时效关系。方法 采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法，对游泳应激后不同时间点的大鼠下丘脑和海马内fos和jun蛋白阳性神经元的分布进行观察，用图像分析技术对大鼠下丘脑室旁核
(PVN)、视上核(SON)和海马齿状回(DG)内的fos和jun阳性细胞的相对切面面积比和平均目标灰度进行分析。结果 游泳应激结束后3h，室旁核和视上核及齿状区内可见密集深染的c-fos和c-jun阳性细胞，室旁核小细胞部，背内侧核等区域亦有疏密不一的阳性胞体。图像分析结果发现，游泳应激结束后3～8h内下丘脑PVN和SON及海马DG内fos和jun 阳性胞体的相对切面面积比明显高于正常大鼠(P<0.01)，而平均目标灰度则显著降低(P<0.01)。结论 应激可以诱导下丘脑和海马等相关脑区c-fos和c-jun的表达，并且具有很强的时效关系。
, http://www.100md.com
The acute forced swimming stress induces expression of immediate early gene c-fos and c-jun
Lu Lin， Liu Xiehe， Midnick SA, et al. Institute of Mental Health. The First Hospital Affiliated to West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To explore the possible time-effect relationship between stress response and expression of c-fos and c-jun in hypothalamus and hippocampus. Methods The immunohistochemistry was performed to observe the distribution of c-fos and c-jun neurons within hypothalamus and hippocampus, and the computerized image technique was used to analyze the change in grey degree and relative sectional area of fos and jun-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN), the supraoptic nucleus (SON) and hippocampal dentate gyrus. Results A dense accumulation of fos and jun-positive neurons exhibited in the PVN, SON and DG, and some of fos and jun-positive neurons were also present in other hypothalamus and hippocampus areas including parvocellular PVN (pPVN), dorsomedial nucleus and lateral hypothalamic area (LH). With using computerized image analysis, the relative sectional area of fos and jun-positive neurons in PVN, SON and DG at 3～8h after stress were larger than that of normal group (P<0.01), and the grey degree of fos and jun-positive neurons in PVN, SON and DG at 3～8h after stress were significant lower than that of normal group (P<0.01). Conclusion It is suggested that stress can induce the expression of c-fos and c-jun, and there are time-effect relationship between the stress response and expression of c-fos and c-jun.
, 百拇医药
【Key words】 Stress c-fos c-jun Hypothalamus Hippocampus Time-effect
原癌基因(proto-oncogene)又称快反应基因或即刻早期基因(immediate early gene, IEG)，在神经和行为科学中的应用，始于80年代后期，该基因家族有包括c-fos和c-jun在内的近百个成员，正常情况下c-fos和c-jun等IEG参与细胞的生长、分化、神经功能可塑性改变、学习和记忆等多种生理和行为过程。IEG的一大特点是对细胞外刺激的快速诱导性，应激、针刺或给予神经肽等不同生理、心理刺激均可诱导IEG的表达[1～3]，但c-fos和c-jun等IEG在神经细胞中的表达规律及其生理学、行为学意义，目前仍不完全清楚。本文通过采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法检测c-fos和c-jun蛋白，来探索大鼠应激后不同时间相关脑区c-fos和c-jun的表达规律。
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材料与方法一、实验动物 采用成年雄性Spraqui Dawlay大鼠45只，体重200～250g，随机分为对照组5只，实验1～8组各5只，实验前均在安静的室温下适应性饲养1周以上，自由进食、饮水，自然昼夜节律光照。
二、应激模型的建立 实验组动物均在15:00～16:00之间于水深25cm，水温恒定在36℃的玻璃水缸中接受强迫游泳30min，游泳结束后，分别于15min、30min、1h、3h、5h、8h、12h、24h等不同时间点处死，每次处死5只。强迫动物游泳过程中，操作轻柔，避免对动物用力挤、捏、抓、压等。
三、灌注和切片 所有大鼠均给于戊巴比妥钠深麻醉(55mg/kg)，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水250ml，继之灌注4℃ 4%多聚甲醛(用PBS配制，PH=7.4)200～250ml，持续0.5～1h，然后剥离鼠脑修块，置同样浓度的多聚甲醛固定液中24h以上，经石腊包埋后，连续冠状切片，片厚约5um，用涂有APES胶的载玻片捞片。
, 百拇医药
四、c-fos和c-jun蛋白免疫组化法：①上述石腊切片常规脱蜡至水，用3%H2O2-甲醇溶液37℃孵育30min，0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min，2%BSA(小牛血清白蛋白)37℃孵育2h。②滴加免抗多克隆fos抗体(sigma)(稀释度1:200)或免抗多克隆jun抗体(sigma)
(稀释度为1:200)，37℃孵育2h或4℃过夜。③滴加生物素标记的单抗兔IgG(Zymed公司)，稀释度1:100，37℃孵育30min。④滴加辣根酶标记的链霉卵白素(Zymed公司)，稀释度为1:100，37℃孵育15min。⑤DAB显色，显微镜下控制显色时间3～5min，自来水冲洗，终止显色反应，最后脱水透明和封片，上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS冲洗3×5min。
五、图像分析 对正常组和游泳应激各组的每只动物各取具有下丘脑的室旁核(PVN)、视止核(SON)和海马的齿状回(DG)切片10±1张在计算机图像分析系统(MIAS～2000)上分别测量下丘脑和海马内fos和jun阳性细胞相对切面面积比(阳性细胞面积总和占视场面积的百分比)和平均目标灰度值(所测阳性细胞的平均灰度)，灰度单位分为256个等级，免疫反应的强弱与灰度值呈反比关系，对每只动物所测量的切片得出的数据取平均值，结果采用两样比均数比较的t检验。
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表1 游泳应激后不同时间的大鼠下丘脑PVN和SON及海马DG内c-fos阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值
分 组
DG
PVN
SON
面积比 灰度值
面积比 灰度值
面积比 灰度值
对照组
0.75±0.02
176.31±3.15
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0.59±0.11
178.5±7.61
0.54±0.03
173.17±10.3
应激后15min
0.72±0.01
178.51±4.10
0.67±0.12
175.68±8.11
0.56±0.02
167.50±9.45
, 百拇医药 30min
0.92±0.13
172.11±3.73
0.78±0.17
160.46±7.21
0.67±0.02
158.71±9.35
1h
1.77±0.27*
158.73±3.92
1.16±0.23
174.08±8.10
, 百拇医药
1.47±0.10*
160.54±8.41
3h
2.49±0.20**
129.65±2.45**
2.28±0.47*
135.84±6.10*
2.28±0.16**
135.84±6.4**
5h
, 百拇医药
3.80±0.52**
121.22±2.16**
4.06±0.39**
125.22±5.61**
4.61±0.19**
124.22±5.53**
8h
2.28±0.41**
137.02±2.51*
, 百拇医药
3.54±0.35**
137.02±5.14*
2.28±0.17**
131.02±5.10*
12h
1.87±0.24*
130.75±2.84*
2.44±0.37*
164.15±7.20
1.18±0.09
, 百拇医药
158.27±7.31
24h
1.21±0.19
160.75±3.6
1.16±0.09
172.37±8.31
1.16±0.07
160.46±7.62
注：与对照组相比 * P<0.05 ** P<0.01
表 2 游泳应激后不同时间点大鼠下丘脑PVN和SON及海马DG内c-jun阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
, 百拇医药
DG
PVN
SON
面积比 灰度值
面积比 灰度值
面积比 灰度值
对照组
1.12±0.74
183.11±7.84
0.98±0.04
194.22±8.71
0.94±0.05
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173.12±7.45
应激后15min
1.16±0.71
189.78±7.63
1.54±0.06
185.27±8.31
1.42±0.07
177.12±7.81
30min
1.87±0.72
174.54±6.84
, 百拇医药 1.89±0.12
160.46±7.56
1.78±0.09
160.71±6.75
1h
2.49±0.75*
158.73±6.92
2.02±0.12*
155.12±6.18
2.34±0.13*
145.51±6.18
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3h
3.80±0.82*
150.11±5.45*
3.54±0.13**
139.65±4.19*
4.61±0.19**
131.21±5.10*
5h
5.01±1.12**
135.84±5.29*
, 百拇医药
3.11±0.15**
125.12±4.65**
3.21±0.13**
139.11±4.61*
8h
4.61±0.97**
137.21±5.28*
2.48±0.08*
131.18±5.45*
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2.25±0.09*
148.75±4.71
12h
2.20±0.86*
172.27±6.83
1.47±0.06
174.21±5.08
1.89±0.07*
158.28±4.80
24h
1.77±0.81
, 百拇医药
175.50±6.09
1.35±0.07
178.08±5.46
1.45±0.05
160.21±7.21
注：与对照组相比，* P<0.05 ** P<0.01
结 果
一、下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白的表达和分布光镜下观察，游泳应激后3h动物的c-fos和c-jun蛋白免疫反应物质呈棕黄色颗粒状，位于神经细胞核内，c-fos蛋白的表达以PVN和SON最为密集，且主要集中于室旁核小细胞部(pPVN)，c-jun的表达主要集中于视上核、背内侧核(DMN)和结节内核核(Mt)，下丘脑的外侧区亦有较强的c-fos和c-jun蛋白表达，但与上述部位相比染色较弱，海马内CA1～CA3和DG等部位均有c-fos和c-jun蛋白表达，c-fos蛋白以CA1区最为密集，c-jun的表达以DG染色最强。正常对照组动物在上述脑区偶见零星的c-fos和c-jun表达，但染色较弱。
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二、下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白表达的时效性光镜下观察，游泳应激结束后从1h开始，大鼠下丘脑和海马内c-fos和c-jun阳性细胞密度和染色强度均高于正常对照组，经计算机图像分析后，结果见表1，表2。
以对照组的平均灰度值为基线作图 ，平均灰度越低，细胞染色越深，c-fos和c-jun蛋白表达越强。
图1 应激后c-fos蛋白表达的时效性
图2 应激后c-jun蛋白表达的时效性
讨 论 IEG是一组非特异的转录调控因子，其中有一些基因(如NGFI)编码的调控蛋白，具有两个锌指结构(Zinc finger)，锌指I的P盒与DNA上激素反应元件(HER)特异的结合，调节基因的转录，而c-fos蛋白具有亮氨酸拉链结构，与Jun蛋白形成同源或异源二聚体，改变自身与DNA结合的特异性，增加AP-1结合活性[4～6]，参与信号传递系统各效应酶的转录过程，调控其它多种基因的表达和靶蛋白的合成。一般认为，c-fos mRNA的表达在应激后15min开始，30～60min达到高峰，而c-fos 蛋白的表达在应激后1h左右开始，4～6h达到高峰。本研究中c-fos蛋白的表达于应激30min～1h开始，至3～5h表达最强，8～12h仍有一定程度的表达，24h基本降到正常水平。c-jun mRNA的表达一般稍晚于c-fos[7,8]，在本文中，c-jun蛋白表达的时效性与c-fos差异不明显。
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应激通过机体的感知引起神经元的兴奋而释放神经递质(或激素)，这些神经递质作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，激活胞内第二信使，如cAMP、cGMP、甘油二脂(DG)和Ca2+等，它们参与特定的生理反应，同时也可以诱导IEG的转录和表达。已有研究证实[9]，下丘脑释放的促皮质激素释放激素(CRF)可以刺激PVN神经元中c-fos表达，而注射CRF拮抗剂α-helical CRF则能显著减少下丘脑PVN神经细胞c-fos表达，说明应激是通过CRF的释放或HPA轴活性改变来诱导c-fos的表达，而c-fos蛋白又可能调控CRF基因和其它靶基因的活性，从而调节相关递质(或激素)的合成，而发挥第三信使作用。在本研究中，PVN中c-fos蛋白染色最强，表达最多，而PVN亦正是CRF的分泌和释放的重要部位，在PVN中已发现有丰富的CRF免疫活性纤维和高亲和力结合位点[9]。另外，fos蛋白与HPA轴活性维持有关，如微量注射CRF在诱导c-fos表达同时，亦可使促上腺皮质激素(ACTH)的释放增加，在肾上腺皮质，ACTH和c-fos成正相关，c-fos表达减少，ACTH的释放亦有下降。
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作为学习和记忆的重要神经解剖部位的海马DG，在应激后发挥的作用机制，目前仍不完全清楚[8]。在本研究中，应激后1h左右开始，DG区的c-fos和c-jun蛋白表达均明显增强，可能与应激过程中海马神经元的适应性和可塑性有关，其详细机制值得进一步研究。
国家自然科学启动基金题(960179)及美国南加利福尼亚大学全作项目的部分支助。
参考文献[1]Morgan JI, Cohen D, Hampstead J, et al. Mapping patterns c-fos antigen in the central nervous system after seizure. Science, 1982, 237: 192～193.
[2]Cullinan WE, Hepman JP, Battaglia DF, et al. Expression in rat brain following acute stress. Neuroscience, 1995，64:477～505.
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[3]Morgan S, Greeberg ME. The regulation and function of c-fos and immediate early gene in the nervous system. Neuron, 1990， 4:477～485.
[4]Beck CH, Fibiger HC. Chronic dosipramine alters stress-induced behaviors and regional expression of the immediate early gene, c-fos. Pharmaco Biochem Behav, 1995，51: 331～338.
[5]Svenningsson P, Strom A, Johansson B, et al. Increased expression of c-jun, junB, Ap-1 and preproenkephalin mRNA in rat striatum following a single injection of caffeine. J Neavoscience, 1995，15: 3583～3594.
, 百拇医药
[6]Honkamiemi J, Kononen J, Kainn T, et al. Induction of multiple immediate early genes in rat hypothalamic paraventricular nucleus after stress. Molecular Brain Research, 1994，25: 234～241.
[7]Roccillard C, Bovetto S, Gervais J, et al. Fenfluramine-induced activation of the immediate～early gene c-fos in the striatum: possible interaction between serotonin and dopamine. Molecular Brain Research, 1996，37: 105～115.
[8]Watanabe Y, Stone E, Mcewen BS. Induction and habituation of c-fos and zif/286 by acute and repeated stressor. Neuro Report, 1994， 5: 1321～1325.
[9]Imaki T, Shibasaki, Wang XQ, et al. Intracerebroventricular administration of CRF antagonist attenuates c-fos mRNA expression in the paraventricular nucleus after stress. Neuroendocrinol, 1995，61: 445～452.
(收稿日期：1998-07-13), http://www.100md.com
单位：陆林，刘协和，华西医科大学附一院心理卫生研究所，610041；Mednick SA，美国南加利福尼亚大学行为遗传学系；李毅，四川大学图形图像研究所
关键词：应激；c-fos；c-jun；时效性；下丘脑；海马
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【摘要】 目的 研究下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白的表达与应激反应之间的时效关系。方法 采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法，对游泳应激后不同时间点的大鼠下丘脑和海马内fos和jun蛋白阳性神经元的分布进行观察，用图像分析技术对大鼠下丘脑室旁核
(PVN)、视上核(SON)和海马齿状回(DG)内的fos和jun阳性细胞的相对切面面积比和平均目标灰度进行分析。结果 游泳应激结束后3h，室旁核和视上核及齿状区内可见密集深染的c-fos和c-jun阳性细胞，室旁核小细胞部，背内侧核等区域亦有疏密不一的阳性胞体。图像分析结果发现，游泳应激结束后3～8h内下丘脑PVN和SON及海马DG内fos和jun 阳性胞体的相对切面面积比明显高于正常大鼠(P<0.01)，而平均目标灰度则显著降低(P<0.01)。结论 应激可以诱导下丘脑和海马等相关脑区c-fos和c-jun的表达，并且具有很强的时效关系。
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The acute forced swimming stress induces expression of immediate early gene c-fos and c-jun
Lu Lin， Liu Xiehe， Midnick SA, et al. Institute of Mental Health. The First Hospital Affiliated to West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To explore the possible time-effect relationship between stress response and expression of c-fos and c-jun in hypothalamus and hippocampus. Methods The immunohistochemistry was performed to observe the distribution of c-fos and c-jun neurons within hypothalamus and hippocampus, and the computerized image technique was used to analyze the change in grey degree and relative sectional area of fos and jun-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN), the supraoptic nucleus (SON) and hippocampal dentate gyrus. Results A dense accumulation of fos and jun-positive neurons exhibited in the PVN, SON and DG, and some of fos and jun-positive neurons were also present in other hypothalamus and hippocampus areas including parvocellular PVN (pPVN), dorsomedial nucleus and lateral hypothalamic area (LH). With using computerized image analysis, the relative sectional area of fos and jun-positive neurons in PVN, SON and DG at 3～8h after stress were larger than that of normal group (P<0.01), and the grey degree of fos and jun-positive neurons in PVN, SON and DG at 3～8h after stress were significant lower than that of normal group (P<0.01). Conclusion It is suggested that stress can induce the expression of c-fos and c-jun, and there are time-effect relationship between the stress response and expression of c-fos and c-jun.
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【Key words】 Stress c-fos c-jun Hypothalamus Hippocampus Time-effect
原癌基因(proto-oncogene)又称快反应基因或即刻早期基因(immediate early gene, IEG)，在神经和行为科学中的应用，始于80年代后期，该基因家族有包括c-fos和c-jun在内的近百个成员，正常情况下c-fos和c-jun等IEG参与细胞的生长、分化、神经功能可塑性改变、学习和记忆等多种生理和行为过程。IEG的一大特点是对细胞外刺激的快速诱导性，应激、针刺或给予神经肽等不同生理、心理刺激均可诱导IEG的表达[1～3]，但c-fos和c-jun等IEG在神经细胞中的表达规律及其生理学、行为学意义，目前仍不完全清楚。本文通过采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法检测c-fos和c-jun蛋白，来探索大鼠应激后不同时间相关脑区c-fos和c-jun的表达规律。
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材料与方法一、实验动物 采用成年雄性Spraqui Dawlay大鼠45只，体重200～250g，随机分为对照组5只，实验1～8组各5只，实验前均在安静的室温下适应性饲养1周以上，自由进食、饮水，自然昼夜节律光照。
二、应激模型的建立 实验组动物均在15:00～16:00之间于水深25cm，水温恒定在36℃的玻璃水缸中接受强迫游泳30min，游泳结束后，分别于15min、30min、1h、3h、5h、8h、12h、24h等不同时间点处死，每次处死5只。强迫动物游泳过程中，操作轻柔，避免对动物用力挤、捏、抓、压等。
三、灌注和切片 所有大鼠均给于戊巴比妥钠深麻醉(55mg/kg)，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水250ml，继之灌注4℃ 4%多聚甲醛(用PBS配制，PH=7.4)200～250ml，持续0.5～1h，然后剥离鼠脑修块，置同样浓度的多聚甲醛固定液中24h以上，经石腊包埋后，连续冠状切片，片厚约5um，用涂有APES胶的载玻片捞片。
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四、c-fos和c-jun蛋白免疫组化法：①上述石腊切片常规脱蜡至水，用3%H2O2-甲醇溶液37℃孵育30min，0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min，2%BSA(小牛血清白蛋白)37℃孵育2h。②滴加免抗多克隆fos抗体(sigma)(稀释度1:200)或免抗多克隆jun抗体(sigma)
(稀释度为1:200)，37℃孵育2h或4℃过夜。③滴加生物素标记的单抗兔IgG(Zymed公司)，稀释度1:100，37℃孵育30min。④滴加辣根酶标记的链霉卵白素(Zymed公司)，稀释度为1:100，37℃孵育15min。⑤DAB显色，显微镜下控制显色时间3～5min，自来水冲洗，终止显色反应，最后脱水透明和封片，上述各步骤之间均用0.01mol/L PBS冲洗3×5min。
五、图像分析 对正常组和游泳应激各组的每只动物各取具有下丘脑的室旁核(PVN)、视止核(SON)和海马的齿状回(DG)切片10±1张在计算机图像分析系统(MIAS～2000)上分别测量下丘脑和海马内fos和jun阳性细胞相对切面面积比(阳性细胞面积总和占视场面积的百分比)和平均目标灰度值(所测阳性细胞的平均灰度)，灰度单位分为256个等级，免疫反应的强弱与灰度值呈反比关系，对每只动物所测量的切片得出的数据取平均值，结果采用两样比均数比较的t检验。
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表1 游泳应激后不同时间的大鼠下丘脑PVN和SON及海马DG内c-fos阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值
分 组
DG
PVN
SON
面积比 灰度值
面积比 灰度值
面积比 灰度值
对照组
0.75±0.02
176.31±3.15
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0.59±0.11
178.5±7.61
0.54±0.03
173.17±10.3
应激后15min
0.72±0.01
178.51±4.10
0.67±0.12
175.68±8.11
0.56±0.02
167.50±9.45
, 百拇医药 30min
0.92±0.13
172.11±3.73
0.78±0.17
160.46±7.21
0.67±0.02
158.71±9.35
1h
1.77±0.27*
158.73±3.92
1.16±0.23
174.08±8.10
, 百拇医药
1.47±0.10*
160.54±8.41
3h
2.49±0.20**
129.65±2.45**
2.28±0.47*
135.84±6.10*
2.28±0.16**
135.84±6.4**
5h
, 百拇医药
3.80±0.52**
121.22±2.16**
4.06±0.39**
125.22±5.61**
4.61±0.19**
124.22±5.53**
8h
2.28±0.41**
137.02±2.51*
, 百拇医药
3.54±0.35**
137.02±5.14*
2.28±0.17**
131.02±5.10*
12h
1.87±0.24*
130.75±2.84*
2.44±0.37*
164.15±7.20
1.18±0.09
, 百拇医药
158.27±7.31
24h
1.21±0.19
160.75±3.6
1.16±0.09
172.37±8.31
1.16±0.07
160.46±7.62
注：与对照组相比 * P<0.05 ** P<0.01
表 2 游泳应激后不同时间点大鼠下丘脑PVN和SON及海马DG内c-jun阳性细胞相对切面面积比和平均灰度值 分 组
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DG
PVN
SON
面积比 灰度值
面积比 灰度值
面积比 灰度值
对照组
1.12±0.74
183.11±7.84
0.98±0.04
194.22±8.71
0.94±0.05
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173.12±7.45
应激后15min
1.16±0.71
189.78±7.63
1.54±0.06
185.27±8.31
1.42±0.07
177.12±7.81
30min
1.87±0.72
174.54±6.84
, 百拇医药 1.89±0.12
160.46±7.56
1.78±0.09
160.71±6.75
1h
2.49±0.75*
158.73±6.92
2.02±0.12*
155.12±6.18
2.34±0.13*
145.51±6.18
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3h
3.80±0.82*
150.11±5.45*
3.54±0.13**
139.65±4.19*
4.61±0.19**
131.21±5.10*
5h
5.01±1.12**
135.84±5.29*
, 百拇医药
3.11±0.15**
125.12±4.65**
3.21±0.13**
139.11±4.61*
8h
4.61±0.97**
137.21±5.28*
2.48±0.08*
131.18±5.45*
, http://www.100md.com
2.25±0.09*
148.75±4.71
12h
2.20±0.86*
172.27±6.83
1.47±0.06
174.21±5.08
1.89±0.07*
158.28±4.80
24h
1.77±0.81
, 百拇医药
175.50±6.09
1.35±0.07
178.08±5.46
1.45±0.05
160.21±7.21
注：与对照组相比，* P<0.05 ** P<0.01
结 果
一、下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白的表达和分布光镜下观察，游泳应激后3h动物的c-fos和c-jun蛋白免疫反应物质呈棕黄色颗粒状，位于神经细胞核内，c-fos蛋白的表达以PVN和SON最为密集，且主要集中于室旁核小细胞部(pPVN)，c-jun的表达主要集中于视上核、背内侧核(DMN)和结节内核核(Mt)，下丘脑的外侧区亦有较强的c-fos和c-jun蛋白表达，但与上述部位相比染色较弱，海马内CA1～CA3和DG等部位均有c-fos和c-jun蛋白表达，c-fos蛋白以CA1区最为密集，c-jun的表达以DG染色最强。正常对照组动物在上述脑区偶见零星的c-fos和c-jun表达，但染色较弱。
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二、下丘脑和海马内c-fos和c-jun蛋白表达的时效性光镜下观察，游泳应激结束后从1h开始，大鼠下丘脑和海马内c-fos和c-jun阳性细胞密度和染色强度均高于正常对照组，经计算机图像分析后，结果见表1，表2。
以对照组的平均灰度值为基线作图 ，平均灰度越低，细胞染色越深，c-fos和c-jun蛋白表达越强。
图1 应激后c-fos蛋白表达的时效性
图2 应激后c-jun蛋白表达的时效性
讨 论 IEG是一组非特异的转录调控因子，其中有一些基因(如NGFI)编码的调控蛋白，具有两个锌指结构(Zinc finger)，锌指I的P盒与DNA上激素反应元件(HER)特异的结合，调节基因的转录，而c-fos蛋白具有亮氨酸拉链结构，与Jun蛋白形成同源或异源二聚体，改变自身与DNA结合的特异性，增加AP-1结合活性[4～6]，参与信号传递系统各效应酶的转录过程，调控其它多种基因的表达和靶蛋白的合成。一般认为，c-fos mRNA的表达在应激后15min开始，30～60min达到高峰，而c-fos 蛋白的表达在应激后1h左右开始，4～6h达到高峰。本研究中c-fos蛋白的表达于应激30min～1h开始，至3～5h表达最强，8～12h仍有一定程度的表达，24h基本降到正常水平。c-jun mRNA的表达一般稍晚于c-fos[7,8]，在本文中，c-jun蛋白表达的时效性与c-fos差异不明显。
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应激通过机体的感知引起神经元的兴奋而释放神经递质(或激素)，这些神经递质作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，激活胞内第二信使，如cAMP、cGMP、甘油二脂(DG)和Ca2+等，它们参与特定的生理反应，同时也可以诱导IEG的转录和表达。已有研究证实[9]，下丘脑释放的促皮质激素释放激素(CRF)可以刺激PVN神经元中c-fos表达，而注射CRF拮抗剂α-helical CRF则能显著减少下丘脑PVN神经细胞c-fos表达，说明应激是通过CRF的释放或HPA轴活性改变来诱导c-fos的表达，而c-fos蛋白又可能调控CRF基因和其它靶基因的活性，从而调节相关递质(或激素)的合成，而发挥第三信使作用。在本研究中，PVN中c-fos蛋白染色最强，表达最多，而PVN亦正是CRF的分泌和释放的重要部位，在PVN中已发现有丰富的CRF免疫活性纤维和高亲和力结合位点[9]。另外，fos蛋白与HPA轴活性维持有关，如微量注射CRF在诱导c-fos表达同时，亦可使促上腺皮质激素(ACTH)的释放增加，在肾上腺皮质，ACTH和c-fos成正相关，c-fos表达减少，ACTH的释放亦有下降。
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作为学习和记忆的重要神经解剖部位的海马DG，在应激后发挥的作用机制，目前仍不完全清楚[8]。在本研究中，应激后1h左右开始，DG区的c-fos和c-jun蛋白表达均明显增强，可能与应激过程中海马神经元的适应性和可塑性有关，其详细机制值得进一步研究。
国家自然科学启动基金题(960179)及美国南加利福尼亚大学全作项目的部分支助。
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[9]Imaki T, Shibasaki, Wang XQ, et al. Intracerebroventricular administration of CRF antagonist attenuates c-fos mRNA expression in the paraventricular nucleus after stress. Neuroendocrinol, 1995，61: 445～452.
(收稿日期：1998-07-13), http://www.100md.com