原癌基因K-ras mRNA的体外核酶定点切割
作者：吴国祥 方裕强 许国铭 李兆申 陆德如 龚燕芳
单位：
关键词：mRNA；K-ras基因；核酶；切割
第二军医大学学报980515 摘要 目的：确定人工设计的核酶Rz199对原癌基因K-ras mRNA的体外切割活性，为K-ras特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用DNA重组技术构建K-ras外显子1及核酶 Rz199的体外转录质粒，以T7 RNA聚合酶进行转录获得核酶Rz199及其靶RNA分子K-ras外显子1 mRNA，在含Mg2+溶液中核酶Rz199对其靶RNA分子进行切割。结果：K-ras体外转录体为254 nt的RNA分子，能被核酶Rz199切割成大小分别为90, 164 nt的2个片段。结论：核酶Rz199对K-ras mRNA具有定点切割活性。
中国图书资料分类法分类号 R735.905； Q78
, 百拇医药
Site-specific cleavage of oncogene K-ras mRNA by ribozyme in vitro
Wu Guoxiang, Fang Yuqiang, Xu Guoming, Li Zhaoshen, Lu Deru, Gong Yanfang (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To confirm the cleavage activity of ribozyme Rz199 to oncogene K-ras messenger RNA. Methods: The plasmid for transcription in vitro of ribozyme Rz199 and K-ras exon 1 were constructed by DNA recombinant technique, and ribozyme Rz199 and K-ras exon 1 RNA were obtained by transcription in vitro with T7 RNA polymerase. Results: The transcript of K-ras can be cleaved into two fragments, 90 and 164 nt, respectively. Conclusion: Ribozyme Rz199 can cleave K-ras mRNA in site-specific manner.
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Key words mRNA, K-ras gene; ribozyme; cleavage
ras原癌基因编码产物为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,附于胞膜的胞浆面，主要介导受体酪氨酸激酶与raf1之间的信号传导，参与细胞的生长及分化调控[1]。ras,尤其K-ras的突变激活是人类多种肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一。人胰腺癌K-ras的突变高达95%[2]。因此，阻断ras基因的表达是探索恶性肿瘤治疗的靶向之一。核酶(Ribozyme)是一种具有催化功能的RNA分子，近年来对其结构和功能的深入研究，使得人工设计及合成核酶以阻断有害基因的表达成为可能。核酶对于病毒性疾病的防治、药物耐药性的逆转及恶性肿瘤的治疗等具有潜在的应用价值[3]。本研究设计了K-ras mRNA的特异性锤头状核酶Rz199，以探讨核酶 Rz199对K-ras mRNA的体外切割活性。
1 材料和方法
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1.1 核酶Rz199的设计及合成 依Symons总结的“锤头结构”原理[4]，以人原癌基因K-ras mRNA为靶分子，对其进行核酶切点位置选择，二级结构预测，基因同源性分析等计算机分析，设计了一种能特异性切割K-ras mRNA的核酶,切点位于K-ras mRNA的199位点，为一39 mer的寡聚核糖核苷酸，其与靶分子K-ras mRNA的作用见图1。
用ABI公司的391型合成仪合成Rz199及其两侧的附加酶切位点序列。合成序列如下：正链AGC TTC TAC CAC CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAG TTT ATA TTA TCG ATG；负链：GAT CCA TCG ATA ATA TAA ACT TTC GTC CTC ACG GAC TCA TCA GGT GGT AA。
1.2 人K-ras外显子1的PCR扩增 依据K-ras基因组DNA序列设计合成K-ras外显子1引物，其序列为：P1： CAG AAT TCG GCC TGC TGA AAA TGA CTG A; P2: GAC TGC AGT CCT GCA CCA GTA ATA TCG。常规方法扩增，扩增条件：94℃ 40 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s, 共30个循环。
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图 1 核酶Rz199与靶分子K-ras mRNA作用示意图
Fig 1 Schematic diagram of interaction between
ribozyme Rz199 and its target RNA
1.3 体外转录质粒的构建 合成DNA片段的磷酸化、PCR产物纯化、限制性酶切、连接、转化，按常规方法进行[5], PCR产物用pGEM-T载体(Promega)克隆；核酶片段用pGEM-4Z载体(Promega)克隆(构建过程见图2)。
1.4 重组转录质粒的筛选和序列分析 核酶 Rz199在设计合成时由于引入了Cla Ⅰ位点,因此可用Cla Ⅰ酶切鉴定重组质粒。而K-ras外显子1在PCR引物设计合成时两端附加了EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ位点，因而可用EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切鉴定。重组质粒以T7引物进行荧光自动测序。
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1.5 核酶Rz199和K-ras mRNA片段的制备 分别以BamH Ⅰ、SaI Ⅰ线性化重组质粒pGEM-4Z-Rz199及pGEM-T-RAS(M)，以T7 RNA聚合酶进行体外转录,所有体外转录试剂购于Promega公司,转录反应参照说明书进行。在K-ras mRNA的制备过程中加入α-32P-UTP(中国同位素公司产品)产生标记的转录物。
1.6 体外切割反应 核素标记的K-ras mRNA片段与Rz199按一定比例混合,10 μl反应体积中含20 mmol/L MgCl2, 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),2 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaCl,37℃孵育2 h，产物以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图 2 重组转录质粒的构建示意图
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Fig 2 Construction of pGEM-4Z-Rz199
H：Hind Ⅲ； C：Cla Ⅰ； B: BamH Ⅰ
2 结 果
2.1 重组转录质粒的构建 Nde Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切重组质粒pGEM-4Z-Rz199及序列分析结果均证实核酶 Rz199已成功地克隆进pGEM-4Z载体T7启动子下游，而以EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切重组质粒pGEM-T-RAS(M)及序列分析均表明已成功地构建了K-ras外显子1的体外转录质粒。
2.2 体外切割 体外转录的K-ras mRNA长度为254 nt，在Mg2+的存在下,核酶Rz199能将其靶RNA分子K-ras mRNA定点切割成2个片段，长度分别为164,90 nt(图3)。
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图 3 靶分子K-ras mRNA的体外切割结果
Fig 3 Cleavage of K-ras mRNA by ribozyme Rz199
1: Ribozyme Rz199 not added; 2: Ribozyme added
3 讨 论
原癌基因的编码产物通常参与调控细胞的生长和分化,其突变激活或异常表达可导致异常的细胞增殖及分化，因此,癌基因自然成为肿瘤治疗的主要靶分子。ras突变激活所导致的异常信号途径是人肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一，也是某些肿瘤细胞恶性转化的始动原因[6]。人类ras包括H-ras, K-ras和N-ras，其中K-ras与肿瘤的发生关系最为密切，人类约有10%～20%的肿瘤与K-ras的异常激活有关。因此，寻找有效的ras基因阻断方法对恶性肿瘤的治疗具有重要的意义。为了阻断ras的功能，人们尝试了ras蛋白C端修饰抑制剂及反义核酸等措施，并取得了一定的效果[7]。80年代初核酶的发现使得在RNA水平上特异性地阻断ras基因的表达成为可能。核酶是一种具有催化功能的小分子RNA，它的发现改变了传统的只有蛋白质才是酶的观点,同时为生物领域基因功能的研究及基因治疗提供了新的途径。目前已发现至少存在7种核酶，其中“锤头状”核酶是结构最简单、也是研究得最透彻的一种，其特点是具有催化功能及位点特异性切割作用[8]。由于核酶具备催化功能而使其阻断某一特定基因表达的能力优于一般的反义RNA分子，而核酶的序列特异性作用又使其可避免蛋白药物的非特异性作用。RNA分子无论在胞外还是胞内都以一定的空间结构存在,只有那些位于靶RNA分子茎环(Stem-loop)结构的环(Loop)部位的UH(H为A,C,或U)序列才能被核酶识别和作用。本研究利用计算机对K-ras mRNA的二级结构进行预测，结果显示K-ras mRNA 199位点5端3个碱基为CUU, 且位于环上(图1),同时该位点邻近翻译起始密码,是基因的重要功能区,因此K-ras mRNA 199位点被选为核酶的切点。判断核酶的活性有体外切割反应直接检测切割产物，或将核酶导入胞内观测细胞的生物学行为变化等方法,本实验利用体外转录及切割反应证实了Rz199能对原癌基因K-ras mRNA实施定点切割。因此，该核酶可用于体内K-ras mRNA的切割，以阻断K-ras基因的表达从而改变肿瘤的恶性表型。
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参 考 文 献
1 Mulcahy LS, Smith MR, Stacey DW. Requirement for ras protooncogene function during serum-stimulated growth of NIH 3T3 cells. Nature,1985, 313(5999):241
2 Almoguera C, Shibata D, Forrester K, et al. Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant C-K-ras genes. Cell, 1988, 53(4):549
3 Christoffersen RE, Marr J. Ribozyme as human therapeutic agents. J Med Chem,1995, 38(12):2023
, http://www.100md.com
4 Symons R. Self-cleavage of RNA in the replication of small pathogens of plants and animals. TIBS, 1989, 14(11):445
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 5～93
6 Leone KS, Wessner LL, McEntee MF, et al. K-ras mutations are an early event and correlate with tumor stage in transplacentally-induced murine lung tumors. Carcinogenesis, 1997, 18(6):1163
, 百拇医药
7 Gibbs JB, Kohl NE, Koblan KS, et al. Farnesyltransferase inhibitors and anti-ras therapy. Breast Cancer Res Treat, 1996, 38(1):75
8 Haseloff J, Gerlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activity. Nature, 1988, 334(6183):585
(1998-04-10收稿， 1998-08-27修回)
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关键词：mRNA；K-ras基因；核酶；切割
第二军医大学学报980515 摘要 目的：确定人工设计的核酶Rz199对原癌基因K-ras mRNA的体外切割活性，为K-ras特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用DNA重组技术构建K-ras外显子1及核酶 Rz199的体外转录质粒，以T7 RNA聚合酶进行转录获得核酶Rz199及其靶RNA分子K-ras外显子1 mRNA，在含Mg2+溶液中核酶Rz199对其靶RNA分子进行切割。结果：K-ras体外转录体为254 nt的RNA分子，能被核酶Rz199切割成大小分别为90, 164 nt的2个片段。结论：核酶Rz199对K-ras mRNA具有定点切割活性。
中国图书资料分类法分类号 R735.905； Q78
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Site-specific cleavage of oncogene K-ras mRNA by ribozyme in vitro
Wu Guoxiang, Fang Yuqiang, Xu Guoming, Li Zhaoshen, Lu Deru, Gong Yanfang (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To confirm the cleavage activity of ribozyme Rz199 to oncogene K-ras messenger RNA. Methods: The plasmid for transcription in vitro of ribozyme Rz199 and K-ras exon 1 were constructed by DNA recombinant technique, and ribozyme Rz199 and K-ras exon 1 RNA were obtained by transcription in vitro with T7 RNA polymerase. Results: The transcript of K-ras can be cleaved into two fragments, 90 and 164 nt, respectively. Conclusion: Ribozyme Rz199 can cleave K-ras mRNA in site-specific manner.
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Key words mRNA, K-ras gene; ribozyme; cleavage
ras原癌基因编码产物为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,附于胞膜的胞浆面，主要介导受体酪氨酸激酶与raf1之间的信号传导，参与细胞的生长及分化调控[1]。ras,尤其K-ras的突变激活是人类多种肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一。人胰腺癌K-ras的突变高达95%[2]。因此，阻断ras基因的表达是探索恶性肿瘤治疗的靶向之一。核酶(Ribozyme)是一种具有催化功能的RNA分子，近年来对其结构和功能的深入研究，使得人工设计及合成核酶以阻断有害基因的表达成为可能。核酶对于病毒性疾病的防治、药物耐药性的逆转及恶性肿瘤的治疗等具有潜在的应用价值[3]。本研究设计了K-ras mRNA的特异性锤头状核酶Rz199，以探讨核酶 Rz199对K-ras mRNA的体外切割活性。
1 材料和方法
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1.1 核酶Rz199的设计及合成 依Symons总结的“锤头结构”原理[4]，以人原癌基因K-ras mRNA为靶分子，对其进行核酶切点位置选择，二级结构预测，基因同源性分析等计算机分析，设计了一种能特异性切割K-ras mRNA的核酶,切点位于K-ras mRNA的199位点，为一39 mer的寡聚核糖核苷酸，其与靶分子K-ras mRNA的作用见图1。
用ABI公司的391型合成仪合成Rz199及其两侧的附加酶切位点序列。合成序列如下：正链AGC TTC TAC CAC CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAG TTT ATA TTA TCG ATG；负链：GAT CCA TCG ATA ATA TAA ACT TTC GTC CTC ACG GAC TCA TCA GGT GGT AA。
1.2 人K-ras外显子1的PCR扩增 依据K-ras基因组DNA序列设计合成K-ras外显子1引物，其序列为：P1： CAG AAT TCG GCC TGC TGA AAA TGA CTG A; P2: GAC TGC AGT CCT GCA CCA GTA ATA TCG。常规方法扩增，扩增条件：94℃ 40 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s, 共30个循环。
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图 1 核酶Rz199与靶分子K-ras mRNA作用示意图
Fig 1 Schematic diagram of interaction between
ribozyme Rz199 and its target RNA
1.3 体外转录质粒的构建 合成DNA片段的磷酸化、PCR产物纯化、限制性酶切、连接、转化，按常规方法进行[5], PCR产物用pGEM-T载体(Promega)克隆；核酶片段用pGEM-4Z载体(Promega)克隆(构建过程见图2)。
1.4 重组转录质粒的筛选和序列分析 核酶 Rz199在设计合成时由于引入了Cla Ⅰ位点,因此可用Cla Ⅰ酶切鉴定重组质粒。而K-ras外显子1在PCR引物设计合成时两端附加了EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ位点，因而可用EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切鉴定。重组质粒以T7引物进行荧光自动测序。
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1.5 核酶Rz199和K-ras mRNA片段的制备 分别以BamH Ⅰ、SaI Ⅰ线性化重组质粒pGEM-4Z-Rz199及pGEM-T-RAS(M)，以T7 RNA聚合酶进行体外转录,所有体外转录试剂购于Promega公司,转录反应参照说明书进行。在K-ras mRNA的制备过程中加入α-32P-UTP(中国同位素公司产品)产生标记的转录物。
1.6 体外切割反应 核素标记的K-ras mRNA片段与Rz199按一定比例混合,10 μl反应体积中含20 mmol/L MgCl2, 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),2 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaCl,37℃孵育2 h，产物以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图 2 重组转录质粒的构建示意图
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Fig 2 Construction of pGEM-4Z-Rz199
H：Hind Ⅲ； C：Cla Ⅰ； B: BamH Ⅰ
2 结 果
2.1 重组转录质粒的构建 Nde Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切重组质粒pGEM-4Z-Rz199及序列分析结果均证实核酶 Rz199已成功地克隆进pGEM-4Z载体T7启动子下游，而以EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切重组质粒pGEM-T-RAS(M)及序列分析均表明已成功地构建了K-ras外显子1的体外转录质粒。
2.2 体外切割 体外转录的K-ras mRNA长度为254 nt，在Mg2+的存在下,核酶Rz199能将其靶RNA分子K-ras mRNA定点切割成2个片段，长度分别为164,90 nt(图3)。
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图 3 靶分子K-ras mRNA的体外切割结果
Fig 3 Cleavage of K-ras mRNA by ribozyme Rz199
1: Ribozyme Rz199 not added; 2: Ribozyme added
3 讨 论
原癌基因的编码产物通常参与调控细胞的生长和分化,其突变激活或异常表达可导致异常的细胞增殖及分化，因此,癌基因自然成为肿瘤治疗的主要靶分子。ras突变激活所导致的异常信号途径是人肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一，也是某些肿瘤细胞恶性转化的始动原因[6]。人类ras包括H-ras, K-ras和N-ras，其中K-ras与肿瘤的发生关系最为密切，人类约有10%～20%的肿瘤与K-ras的异常激活有关。因此，寻找有效的ras基因阻断方法对恶性肿瘤的治疗具有重要的意义。为了阻断ras的功能，人们尝试了ras蛋白C端修饰抑制剂及反义核酸等措施，并取得了一定的效果[7]。80年代初核酶的发现使得在RNA水平上特异性地阻断ras基因的表达成为可能。核酶是一种具有催化功能的小分子RNA，它的发现改变了传统的只有蛋白质才是酶的观点,同时为生物领域基因功能的研究及基因治疗提供了新的途径。目前已发现至少存在7种核酶，其中“锤头状”核酶是结构最简单、也是研究得最透彻的一种，其特点是具有催化功能及位点特异性切割作用[8]。由于核酶具备催化功能而使其阻断某一特定基因表达的能力优于一般的反义RNA分子，而核酶的序列特异性作用又使其可避免蛋白药物的非特异性作用。RNA分子无论在胞外还是胞内都以一定的空间结构存在,只有那些位于靶RNA分子茎环(Stem-loop)结构的环(Loop)部位的UH(H为A,C,或U)序列才能被核酶识别和作用。本研究利用计算机对K-ras mRNA的二级结构进行预测，结果显示K-ras mRNA 199位点5端3个碱基为CUU, 且位于环上(图1),同时该位点邻近翻译起始密码,是基因的重要功能区,因此K-ras mRNA 199位点被选为核酶的切点。判断核酶的活性有体外切割反应直接检测切割产物，或将核酶导入胞内观测细胞的生物学行为变化等方法,本实验利用体外转录及切割反应证实了Rz199能对原癌基因K-ras mRNA实施定点切割。因此，该核酶可用于体内K-ras mRNA的切割，以阻断K-ras基因的表达从而改变肿瘤的恶性表型。
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参 考 文 献
1 Mulcahy LS, Smith MR, Stacey DW. Requirement for ras protooncogene function during serum-stimulated growth of NIH 3T3 cells. Nature,1985, 313(5999):241
2 Almoguera C, Shibata D, Forrester K, et al. Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant C-K-ras genes. Cell, 1988, 53(4):549
3 Christoffersen RE, Marr J. Ribozyme as human therapeutic agents. J Med Chem,1995, 38(12):2023
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4 Symons R. Self-cleavage of RNA in the replication of small pathogens of plants and animals. TIBS, 1989, 14(11):445
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 5～93
6 Leone KS, Wessner LL, McEntee MF, et al. K-ras mutations are an early event and correlate with tumor stage in transplacentally-induced murine lung tumors. Carcinogenesis, 1997, 18(6):1163
, 百拇医药
7 Gibbs JB, Kohl NE, Koblan KS, et al. Farnesyltransferase inhibitors and anti-ras therapy. Breast Cancer Res Treat, 1996, 38(1):75
8 Haseloff J, Gerlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activity. Nature, 1988, 334(6183):585
(1998-04-10收稿， 1998-08-27修回)
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