冷冻伤性脑水肿的发生机制及尼莫地平治疗作用的实验研究
作者：陈立华 杨于嘉 刘运生 何正文 秦天森 马建荣 陶永光 曹美鸿
单位：陈立华、刘运生 何正文 秦天森 马建荣 曹美鸿 410008 长沙,湖南医科大学附属湘雅医院神经外科；杨于嘉 陶永光 儿科研究室
关键词：冷冻伤；脑水肿；伊文思兰；游离钙离子；尼莫地平；Ca2+-ATP酶
中华创伤杂志980513 【摘要】 目的 研究大鼠冷冻伤性脑水肿不同时间脑组织伊文思兰(EB)、突触体内[Ca2+]i及Ca2+-ATP酶活性变化与脑含水量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制和类型。方法 干湿法测定脑组织水分含量,甲酰胺法测定EB含量,Fura-2/AM荧光标记法测定突触体内[Ca2+]i,微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性。采用尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、[Ca2+]i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。结果 冷冻伤后30分钟即已发生Ca2+超载,伴随Ca2+-ATP酶活性下降及脑组织水分含量及EB含量增加。尼莫地平治疗后EB含量和[Ca2+]i明显下降,而Ca2+-ATP酶活性明显恢复,脑水肿明显减轻。结论 BBB的通透性增加和细胞内钙通道开放,钙离子浓度超载在脑水肿的发生与发展过程中起了重要作用。冷冻伤性脑水肿在早期既有细胞毒性脑水肿,又有血管源性脑水肿,即混合性脑水肿。
, 百拇医药
Experimental Study of Mechanism of Brain Edema and Effects of Nimodipine on Brain Edema Following Freezing Injury CHEN Li-hua, YANG Yu-jia, LIU Yun-sheng, et al. Dept. of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Aim To elucidate the mechanism and types of brain edema induced by freezing injury (FI). Methods [Ca2+]i was determined in calcium fluorescent in Fura-2/AM loaded neuronal synaptosomes by using mono-wavelength spectrofluorophtometer. The Ca2+-ATPase activity was determined by biochemical method. Nimodipine was employed to show its effects on EB and WC of brain tissues, and on the [Ca2+]i in the synaptosomes and alteration of Ca2+-ATPase activity in the mitochondrial. Results Neurons had calcium overload at 30 minutes after FI. The level of WC and EB of brain tissues, and [Ca2+]i significantly increased in the freezing cerebral hemisphere in the FI group as compared with that of the sham-operation group at 30 minutes (P<0.05). In the contrast, the activity of mitochondrial Ca2+-ATPase decreased remarkably after FI (P<0.05). There was close positive relationship between [Ca2+]i and WC. But there was negative correlation between [Ca2+]i and Ca2+-ATPase. Conclusion It is suggested that the changes of the permeability of blood brain barries (BBB), [Ca2+]i and Ca2+-ATPase may participate in the pathogenesis of brain edema. Nimodipine through inhibiting the excess of Ca2+ influx, stimulating the activity of Ca2+-ATPase, and decreasing significantly [Ca2+]i and the permeability of BBB and possess the protective effect on brain edema induced by FI.
, 百拇医药
【Key words】 Freezing injury Brain edema Evan blues Cytosolic free calcium Nimodipine Ca2+-ATPase
脑水肿的发生机制尚不完全清楚,关于脑水肿发生的学说众多,较为公认的有兴奋性氨基酸和钙离子内流学说。笔者采用大鼠冷冻伤性脑水肿模型,分别测定该脑水肿模型不同时间含水量和伊文思兰(EB)含量的变化,观察脑水肿发生的时间过程和血脑屏障(BBB)通透性改变及二者之间的相互关系;荧光标记法检测突触体内[Ca2+]i及微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性变化的时相规律及与脑组织水分含量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制并明确其类型。在此基础上,采用L-型钙离子通道阻滞剂尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、[Ca2+]i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。
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材料与方法
一、动物分组及模型制作
健康SD大鼠,共68只,雌雄不分,体重(210±30)g。随机分为:(1)空白对照组(Nor,鼠数=8),不作任何处理。(2)假冷冻伤组(Sham,鼠数=15),左顶开颅,硬膜外37℃假冷冻5秒钟。(3)冷冻伤组
(FI,鼠数=24),左顶开颅,硬膜外-50℃单点冷冻5秒钟。(4)尼莫地平治疗组(Nim,鼠数=21),-50℃硬膜外冷冻5秒钟后,于5分钟内经腹腔注射尼莫地平(德国Bayer公司提供,0.25mg/kg)。24小时Nim治疗组于冷冻伤后每8小时重复注射相同剂量的尼莫地平(共3次)。除空白组外,每1组又分为30分钟、4,24小时3个时间亚组。
二、实验方法
1.脑组织水分含量及伊文思兰(EB)含量测定:大鼠观察至规定时间后断头处死,干湿法测定脑组织含水量,按Ellit公式计算:脑含水量(WC,%)=(湿重-干重)/湿重×100%。EB含量测定采用甲酰胺法,具体操作步骤见文献[1]。
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2.突触体和线粒体的制备:以不同浓度蔗糖梯度差速离心法分离出脑突触体和线粒体。突触体和线粒体的制备是本研究的关键步骤,因为它们的好坏直接影响测定结果,具体步骤和方法,见文献[2，3]。突触体和线粒体制备后须经透射电镜检测其存活程度和纯度,要求其纯度在85%以上。
3.突触体[Ca2+]i和线粒体Ca2+-ATP酶活性测定:线粒体Ca2+-ATP酶活性测定采用微量定磷法[2]。采用日立-850型荧光分光光度计测定突触体的荧光强度[3]。根据下式计算出[Ca2+]i
[4]。
[Ca2+]i=Kd×[F(F-Fmin)/(Fmax-F)]
式中Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数,Kd=224nm。
, 百拇医药
三、统计学分析
测定值用均数±标准差(
±s)表示,均数比较采用方差分析和直线回归相关分析。全部资料用SPSS软件在计算机上分析。
结 果
一、冷冻伤后脑组织含水量与EB含量变化
FI各时间亚组脑含水量及EB含量均明显高于相应时间Sham组,差异有显著性(P<0.05)。FI组脑含水量与EB含量呈正相关关系,二者具有高度的相关性(r≥0.85,P<0.05)。见表1。应用尼莫地平治疗后,脑含水量及EB含量均明显降低(P<0.05)。
表1 大鼠冷冻伤后脑组织含水量及EB含量的变化(±s) 组别
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伤后时间
鼠数
含水量(%)
EB(μg/g)
r(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
1.22±0.22
0.97(<0.01)
假冷冻伤组
30min
, 百拇医药 5
78.32±0.46
1.24±0.31
0.94(<0.05)
4h
5
78.53±0.72
1.85±0.67
0.90(<0.05)
24h
5
78.67±0.68
, 百拇医药
1.89±0.45
0.89(<0.05)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
4.56±1.04*△
0.92(<0.05)
4h
9
81.64±0.58*△
, http://www.100md.com
8.48±2.56*△
0.85(<0.05)
24h
8
82.09±0.45*△
8.66±2.45*△
0.93(<0.01)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
, 百拇医药
2.76±0.85▲
0.68(<0.05)
4h
7
78.68±0.95▲
2.15±0.98▲
0.91(<0.05)
24h
7
78.79±0.46▲
2.13±0.48▲
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0.51(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r:含水量与EB相关系数
二、冷冻伤后突触体内[Ca2+]i的变化及尼莫地平对[Ca2+]i的影响
FI组与Sham组相比较,冷冻后30分钟,突触体[Ca2+]i即已明显升高;冷冻后4,24小时[Ca2+]i持续进行性升高,伴随脑组织水分含量进行性增高,差别均有显著性意义(P<0.05)。突触体[Ca2+]i与脑组织水分含量呈正相关关系(r≥0.88,P<0.05)。见表2。经用尼莫地平治疗后突触体内[Ca2+]i显著降低,伴随脑含水量明显下降(P<0.05),以4小时尼莫地平治疗组[Ca2+]i降低最明显。表2 冷冻伤后脑组织含水量与突触体内[Ca2+]i的变化(±s) 组别
, 百拇医药
伤后时间
鼠数
含水量(%)
[Ca2+]i(nmol/L)
r(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
128.13±7.29
0.96(<0.01)
假冷冻伤组
30min
, http://www.100md.com
5
78.32±0.46
131.34±14.46
0.91(<0.01)
4h
5
78.53±0.72
154.77±15.85
0.97(<0.01)
24h
5
78.67±0.68
, 百拇医药
177.66±23.21
0.99(<0.01)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
296.76±12.56*△
0.93(<0.01)
4h
7
81.64±0.58*△
, http://www.100md.com
353.72±21.32*△
0.88(<0.05)
24h
7
82.09±0.35*△
430.64±48.05*△
0.97(<0.01)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
, http://www.100md.com
182.27±11.84*△▲
0.84(<0.05)
4h
7
78.68±0.95▲
166.37±23.10*▲
0.93(<0.01)
24h
7
78.79±0.46▲
214.81±21.91*△▲
, http://www.100md.com
0.74(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r:含水量与[Ca2+]i相关系数
三、线粒体Ca2+-ATP酶活性变化及尼莫地平对其影响
FI各时间亚组较Sham相应时间组Ca2+-ATP酶活性均明显下降(P<0.05),随冷冻时间的
延长,Ca2+-ATP酶活性持续进行性下降。应用尼莫地平治疗后,Ca2+-ATP酶活性明显恢复(P<0.05)。见表3。表3 冷冻伤后脑组织含水量与线粒体Ca2+-ATP酶活性变化(±s) 组别
, 百拇医药
伤后时间
鼠数
含水量(%)
Ca2+-ATPase(μmol.g-1.h-1)
r1(P值)
r2(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
1.31±0.07
-0.96(<0.05)
, 百拇医药
-0.92(<0.05)
假冷冻伤组
30min
5
78.32±0.46
1.27±0.12
-0.82(<0.05)
-0.88(<0.05)
4h
5
78.53±0.72
1.21±0.12
, 百拇医药
-0.87(<0.05)
-0.93(<0.05)
24h
5
78.67±0.68
1.18±0.10
-0.99(<0.05)
-0.98(<0.05)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
, 百拇医药
0.52±0.08*△
-0.85(<0.05)
-0.83(<0.05)
4h
7
81.64±0.58*△
0.32±0.11*△
-0.84(<0.05)
-0.87(<0.05)
24h
7
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82.09±0.35*△
0.18±0.08*△
-0.86(<0.05)
-0.94(<0.05)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
0.74±0.21*△▲
-0.84(<0.05)
-0.89(<0.05)
, 百拇医药
4h
7
78.68±0.95▲
0.69±0.10*△▲
-0.86(<0.05)
-0.90(<0.05)
24h
7
78.79±0.46▲
0.56±0.16*△▲
-0.99(<0.05)
, 百拇医药
-0.86(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r1:[Ca2+]i与Ca2+-ATP酶活性的相关系数; r2:含水量与Ca2+-ATP酶活性的相关系数
讨 论
一、冷冻伤性脑水肿脑组织水分含量和EB含量变化及尼莫地平对其影响
Klatzo将脑水肿分为血管源性和细胞毒性脑水肿两大类:血管源性脑水肿主要是BBB受损,血浆成分渗出到细胞外间隙;细胞毒性脑水肿主要特点是细胞膜上的离子泵受损,造成细胞内水钠潴留。EB进入血液与血浆蛋白结合后不能通过BBB,只有当BBB破坏时,才能通过受损的BBB进入脑组织,使BBB受损区出现蓝染,是常用的脑血管通透性变化的指示剂,观察脑组织蓝染范围和深度及测定脑组织EB含量,可反映脑组织BBB通透性开放程度。本组实验采用甲酰胺测定EB的含量,以此反映BBB的破坏程度。在Nor组和Sham组EB含量无明显差别,Sham组脑组织EB含量高于Nor组,可能与手术创伤有关,但其差别无显著性(P>0.05),表明假冷冻伤并不引起BBB通透性的改变。冷冻伤后30分钟、4,24小时3个时间亚组冷冻侧脑组织水分含量和EB含量均明显高于Nor组和Sham组(P<0.05);脑组织含水量从30分钟Sham组的78.32%升高到FI组的79.98%,二者比较有显著性差异(P<0.05);EB含量从30分钟Sham组的1.24μg/g升高到FI组的4.56μg/g,明显高于Nor组和Sham组,二组比较亦有显著性差异(P<0.05)。随冷冻伤后时间的延长,脑含水量和EB含量增加,且脑含水量与EB含量之间具有高度的正相关关系(P<0.01)。见表1。说明BBB受损血管通透性增高是引起脑组织含水量增高的重要原因,即冷冻伤性脑水肿模型在早期即已发生BBB破坏,引起BBB通透性明显增高,EB含量升高,产生血管源性脑水肿(即细胞外水肿)。应用尼莫地平治疗后,脑组织含水量及EB含量均明显下降,说明尼莫地平能有效地改善BBB的通透性,从而减轻脑水肿。
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二、冷冻伤性脑水肿突触体[Ca2+]i变化及尼莫地平的治疗作用
细胞内钙离子超载是导致细胞死亡的“最后共同途径”。测定细胞内[Ca2+]i对于了解正常细胞功能及与Ca2+有关疾病的发生机制均有重要意义。本组研究结果表明:30分钟FI组突触体内[Ca2+]i随冷冻伤后时间的延长而持续进行性增高,脑组织含水量随[Ca2+]i的升高而增加。经直线相关分析表明,突触体[Ca2+]i与脑组织含水量变化相一致,两者之间存在高度的正相关关系
(r≥0.88,P<0.05)。提示冷冻伤性脑水肿的发生和发展与神经细胞内Ca2+超载有着密切的关系。应用尼莫地平治疗后,其各个时间组突触体[Ca2+]i明显下降,伴随脑组织水分含量明显下降,与FI组相比,其差别均有显著性意义(P<0.05)。提示尼莫地平通过降低冷冻伤性脑水肿脑突触体内
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[Ca2+]i,缓解细胞内钙离子超载,具有减轻脑水肿作用。根据实验结果可以推测神经细胞钙通道开放是导致脑水肿的主要因素之一,细胞内Ca2+超载对脑水肿的发生与发展起了重要的作用。Shapira等[5]检测大鼠闭合性脑损伤脑组织总Ca2+含量,提示脑损伤的早期脑组织总Ca2+含量增高,同时伴有脑水肿,且与脑水肿的严重程度呈正相关关系(r=0.65,P<0.01),故认为脑细胞内Ca2+聚积是脑水肿发生发展的主要原因。由此可见,神经细胞内钙在脑水肿的发生和发展中起着重要的作用,细胞内Ca2+超载对神经细胞的损伤是多方面的,这些机制协同作用既可引起细胞毒性脑水肿,又可导致血管源性脑水肿,最终导致神经元不可逆性损害。
三、尼莫地平对线粒体Ca2+-ATP酶活性的影响
线粒体富含Ca2+-ATP酶,也称钙泵,是维持细胞内钙稳态平衡的主要细胞器。故本实验利用线粒体测定其Ca2+-ATP酶活性来反映细胞内Ca2+-ATP酶活性。冷冻伤后30分钟神经元线粒体Ca2+-ATP酶活性显著下降,冷冻伤后4小时和24小时Ca2+-ATP酶活性持续降低,随冷冻后时间的延长而递降。采用相关回归分析发现,FI组冷冻侧细胞突触体[Ca2+]i与线粒体Ca2+-ATP酶活性之间的变化呈负相关关系(r≤-0.84,P<0.05)。Ca2+-ATP酶活性下降,钙泵排出Ca2+的能力下降,其差异有显著性意义。这充分论证了冷冻伤后神经元Ca2+通道发生了变化,并揭示了Ca2+通道开放与神经细胞内Ca2+超载和线粒体内Ca2+-ATP酶活性下降存在着内在的密切联系。尼莫地平是一种选择性较强的、非极性第二代二氢吡啶类有机钙拮抗剂,血浆蛋白结合率98%以上,易于透过血脑屏障。它与细胞膜上L-型钙通道的α1亚单位有非常高的亲和力,当与胞膜上受体识别位点结合后,引起L型电压依赖性钙通道构型改变,特异性阻断细胞膜上Ca2+通道,抑制细胞外Ca2+内流,防止细胞内Ca2+超载,阻断细胞损害的病理过程。同时,尼莫地平还直接刺激神经细胞Ca2+-ATP酶,使其活性增高[2]。一方面促进胞浆内Ca2+外排,另一方面,增强线粒体等Ca2+库摄取和储存Ca2+的能力,缓解细胞内Ca2+超载。从根本上阻断Ca2+超载所诱发的一系列病理变化,从而保护脑组织、恢复神经功能。
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从本研究结果来看,神经细胞浆内[Ca2+]i升高的机制,可能与以下两方面有关:(1)细胞膜上Ca2+通道开放,使细胞外液大量Ca2+内流。(2)脑缺血引起能量代谢障碍,ATP分解增加而合成减少,引起细胞ATP缺乏,其胞质膜上的Ca2+-ATP酶活性降低,线粒体Ca2+库储存Ca2+的能力下降,从而加重细胞内Ca2+超载。Ca2+-ATP酶活性随冷冻后时间延长而递减,且与[Ca2+]i呈负相关关系,从而也证明Ca2+-ATP酶活性下降在神经细胞胞浆内[Ca2+]i升高的机制中起着重要的作用。这已被本实验应用Ca2+通道阻滞剂尼莫地平治疗后,突触体[Ca2+]i明显下降而Ca2+-ATP酶活性明显升高所证实。
以上结果表明脑水肿的发生及发展与神经元细胞内钙离子的聚集有密切关系。冷冻伤性脑水肿早期(冷冻后30分钟)既发生了BBB通透性改变,引起血管源性脑水肿(细胞外水肿);又发生了神经细胞内Ca2+超载,引起细胞毒性脑水肿(细胞内水肿)。即冷冻伤性脑水肿(局灶性脑水肿),在早期既是血管源性脑水肿,又是细胞毒性脑水肿,细胞外水肿与细胞内水肿同步发展。尼莫地平通过改善BBB的通透性,降低神经细胞内[Ca2+]i,直接刺激神经细胞Ca2+-ATP酶,使其活性增高,既减轻血管源性脑水肿,又减轻细胞毒性脑水肿,即对血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿均有治疗作用。
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参考文献
[1]陈立华,曹美鸿,杨于嘉,等.尼莫地平对感染性脑水肿的脑保护作用.湖南医科大学学报,1997, 22∶393-396.
[2]陈立华,曹美鸿,马建荣,等.冷冻伤性脑水肿钙-ATP酶活性变化与脑水肿的关系.中华创伤杂志, 1997,13∶158-160.
[3]陈立华,曹美鸿,刘运生,等.Fura-2荧光标记法测定突触体内游离Ca2+浓度的原理及方法.临床神经科学,1997,5∶71-74.
[4]Cobbold Ph, Rink TJ. Fluorescence and bioluminesecen measurement of cytoplasmic free calcium. J Biochem, 1987, 248∶313-328.
[5]Shapira Y, Yadid G, Lotev S. Accumulation of calcium in the following head trauma.Neurol Res, 1989, 11∶169-172.
(收稿:1997-11-21 修回:1998-07-15), 百拇医药
单位：陈立华、刘运生 何正文 秦天森 马建荣 曹美鸿 410008 长沙,湖南医科大学附属湘雅医院神经外科；杨于嘉 陶永光 儿科研究室
关键词：冷冻伤；脑水肿；伊文思兰；游离钙离子；尼莫地平；Ca2+-ATP酶
中华创伤杂志980513 【摘要】 目的 研究大鼠冷冻伤性脑水肿不同时间脑组织伊文思兰(EB)、突触体内[Ca2+]i及Ca2+-ATP酶活性变化与脑含水量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制和类型。方法 干湿法测定脑组织水分含量,甲酰胺法测定EB含量,Fura-2/AM荧光标记法测定突触体内[Ca2+]i,微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性。采用尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、[Ca2+]i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。结果 冷冻伤后30分钟即已发生Ca2+超载,伴随Ca2+-ATP酶活性下降及脑组织水分含量及EB含量增加。尼莫地平治疗后EB含量和[Ca2+]i明显下降,而Ca2+-ATP酶活性明显恢复,脑水肿明显减轻。结论 BBB的通透性增加和细胞内钙通道开放,钙离子浓度超载在脑水肿的发生与发展过程中起了重要作用。冷冻伤性脑水肿在早期既有细胞毒性脑水肿,又有血管源性脑水肿,即混合性脑水肿。
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Experimental Study of Mechanism of Brain Edema and Effects of Nimodipine on Brain Edema Following Freezing Injury CHEN Li-hua, YANG Yu-jia, LIU Yun-sheng, et al. Dept. of Neurosurgery, Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Aim To elucidate the mechanism and types of brain edema induced by freezing injury (FI). Methods [Ca2+]i was determined in calcium fluorescent in Fura-2/AM loaded neuronal synaptosomes by using mono-wavelength spectrofluorophtometer. The Ca2+-ATPase activity was determined by biochemical method. Nimodipine was employed to show its effects on EB and WC of brain tissues, and on the [Ca2+]i in the synaptosomes and alteration of Ca2+-ATPase activity in the mitochondrial. Results Neurons had calcium overload at 30 minutes after FI. The level of WC and EB of brain tissues, and [Ca2+]i significantly increased in the freezing cerebral hemisphere in the FI group as compared with that of the sham-operation group at 30 minutes (P<0.05). In the contrast, the activity of mitochondrial Ca2+-ATPase decreased remarkably after FI (P<0.05). There was close positive relationship between [Ca2+]i and WC. But there was negative correlation between [Ca2+]i and Ca2+-ATPase. Conclusion It is suggested that the changes of the permeability of blood brain barries (BBB), [Ca2+]i and Ca2+-ATPase may participate in the pathogenesis of brain edema. Nimodipine through inhibiting the excess of Ca2+ influx, stimulating the activity of Ca2+-ATPase, and decreasing significantly [Ca2+]i and the permeability of BBB and possess the protective effect on brain edema induced by FI.
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【Key words】 Freezing injury Brain edema Evan blues Cytosolic free calcium Nimodipine Ca2+-ATPase
脑水肿的发生机制尚不完全清楚,关于脑水肿发生的学说众多,较为公认的有兴奋性氨基酸和钙离子内流学说。笔者采用大鼠冷冻伤性脑水肿模型,分别测定该脑水肿模型不同时间含水量和伊文思兰(EB)含量的变化,观察脑水肿发生的时间过程和血脑屏障(BBB)通透性改变及二者之间的相互关系;荧光标记法检测突触体内[Ca2+]i及微量定磷法测定线粒体Ca2+-ATP酶活性变化的时相规律及与脑组织水分含量变化之间的规律,以探讨冷冻伤性脑水肿的发生机制并明确其类型。在此基础上,采用L-型钙离子通道阻滞剂尼莫地平进行治疗,研究其对EB含量、[Ca2+]i、Ca2+-ATP酶活性和脑水肿的影响。
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材料与方法
一、动物分组及模型制作
健康SD大鼠,共68只,雌雄不分,体重(210±30)g。随机分为:(1)空白对照组(Nor,鼠数=8),不作任何处理。(2)假冷冻伤组(Sham,鼠数=15),左顶开颅,硬膜外37℃假冷冻5秒钟。(3)冷冻伤组
(FI,鼠数=24),左顶开颅,硬膜外-50℃单点冷冻5秒钟。(4)尼莫地平治疗组(Nim,鼠数=21),-50℃硬膜外冷冻5秒钟后,于5分钟内经腹腔注射尼莫地平(德国Bayer公司提供,0.25mg/kg)。24小时Nim治疗组于冷冻伤后每8小时重复注射相同剂量的尼莫地平(共3次)。除空白组外,每1组又分为30分钟、4,24小时3个时间亚组。
二、实验方法
1.脑组织水分含量及伊文思兰(EB)含量测定:大鼠观察至规定时间后断头处死,干湿法测定脑组织含水量,按Ellit公式计算:脑含水量(WC,%)=(湿重-干重)/湿重×100%。EB含量测定采用甲酰胺法,具体操作步骤见文献[1]。
, 百拇医药
2.突触体和线粒体的制备:以不同浓度蔗糖梯度差速离心法分离出脑突触体和线粒体。突触体和线粒体的制备是本研究的关键步骤,因为它们的好坏直接影响测定结果,具体步骤和方法,见文献[2，3]。突触体和线粒体制备后须经透射电镜检测其存活程度和纯度,要求其纯度在85%以上。
3.突触体[Ca2+]i和线粒体Ca2+-ATP酶活性测定:线粒体Ca2+-ATP酶活性测定采用微量定磷法[2]。采用日立-850型荧光分光光度计测定突触体的荧光强度[3]。根据下式计算出[Ca2+]i
[4]。
[Ca2+]i=Kd×[F(F-Fmin)/(Fmax-F)]
式中Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数,Kd=224nm。
, 百拇医药
三、统计学分析
测定值用均数±标准差(
±s)表示,均数比较采用方差分析和直线回归相关分析。全部资料用SPSS软件在计算机上分析。结 果
一、冷冻伤后脑组织含水量与EB含量变化
FI各时间亚组脑含水量及EB含量均明显高于相应时间Sham组,差异有显著性(P<0.05)。FI组脑含水量与EB含量呈正相关关系,二者具有高度的相关性(r≥0.85,P<0.05)。见表1。应用尼莫地平治疗后,脑含水量及EB含量均明显降低(P<0.05)。
表1 大鼠冷冻伤后脑组织含水量及EB含量的变化(
±s) 组别, http://www.100md.com
伤后时间
鼠数
含水量(%)
EB(μg/g)
r(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
1.22±0.22
0.97(<0.01)
假冷冻伤组
30min
, 百拇医药 5
78.32±0.46
1.24±0.31
0.94(<0.05)
4h
5
78.53±0.72
1.85±0.67
0.90(<0.05)
24h
5
78.67±0.68
, 百拇医药
1.89±0.45
0.89(<0.05)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
4.56±1.04*△
0.92(<0.05)
4h
9
81.64±0.58*△
, http://www.100md.com
8.48±2.56*△
0.85(<0.05)
24h
8
82.09±0.45*△
8.66±2.45*△
0.93(<0.01)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
, 百拇医药
2.76±0.85▲
0.68(<0.05)
4h
7
78.68±0.95▲
2.15±0.98▲
0.91(<0.05)
24h
7
78.79±0.46▲
2.13±0.48▲
, http://www.100md.com
0.51(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r:含水量与EB相关系数
二、冷冻伤后突触体内[Ca2+]i的变化及尼莫地平对[Ca2+]i的影响
FI组与Sham组相比较,冷冻后30分钟,突触体[Ca2+]i即已明显升高;冷冻后4,24小时[Ca2+]i持续进行性升高,伴随脑组织水分含量进行性增高,差别均有显著性意义(P<0.05)。突触体[Ca2+]i与脑组织水分含量呈正相关关系(r≥0.88,P<0.05)。见表2。经用尼莫地平治疗后突触体内[Ca2+]i显著降低,伴随脑含水量明显下降(P<0.05),以4小时尼莫地平治疗组[Ca2+]i降低最明显。表2 冷冻伤后脑组织含水量与突触体内[Ca2+]i的变化(
±s) 组别, 百拇医药
伤后时间
鼠数
含水量(%)
[Ca2+]i(nmol/L)
r(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
128.13±7.29
0.96(<0.01)
假冷冻伤组
30min
, http://www.100md.com
5
78.32±0.46
131.34±14.46
0.91(<0.01)
4h
5
78.53±0.72
154.77±15.85
0.97(<0.01)
24h
5
78.67±0.68
, 百拇医药
177.66±23.21
0.99(<0.01)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
296.76±12.56*△
0.93(<0.01)
4h
7
81.64±0.58*△
, http://www.100md.com
353.72±21.32*△
0.88(<0.05)
24h
7
82.09±0.35*△
430.64±48.05*△
0.97(<0.01)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
, http://www.100md.com
182.27±11.84*△▲
0.84(<0.05)
4h
7
78.68±0.95▲
166.37±23.10*▲
0.93(<0.01)
24h
7
78.79±0.46▲
214.81±21.91*△▲
, http://www.100md.com
0.74(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r:含水量与[Ca2+]i相关系数
三、线粒体Ca2+-ATP酶活性变化及尼莫地平对其影响
FI各时间亚组较Sham相应时间组Ca2+-ATP酶活性均明显下降(P<0.05),随冷冻时间的
延长,Ca2+-ATP酶活性持续进行性下降。应用尼莫地平治疗后,Ca2+-ATP酶活性明显恢复(P<0.05)。见表3。表3 冷冻伤后脑组织含水量与线粒体Ca2+-ATP酶活性变化(
±s) 组别, 百拇医药
伤后时间
鼠数
含水量(%)
Ca2+-ATPase(μmol.g-1.h-1)
r1(P值)
r2(P值)
正常对照组
8
78.28±0.34
1.31±0.07
-0.96(<0.05)
, 百拇医药
-0.92(<0.05)
假冷冻伤组
30min
5
78.32±0.46
1.27±0.12
-0.82(<0.05)
-0.88(<0.05)
4h
5
78.53±0.72
1.21±0.12
, 百拇医药
-0.87(<0.05)
-0.93(<0.05)
24h
5
78.67±0.68
1.18±0.10
-0.99(<0.05)
-0.98(<0.05)
冷冻伤组
30min
7
79.98±0.48*△
, 百拇医药
0.52±0.08*△
-0.85(<0.05)
-0.83(<0.05)
4h
7
81.64±0.58*△
0.32±0.11*△
-0.84(<0.05)
-0.87(<0.05)
24h
7
, http://www.100md.com
82.09±0.35*△
0.18±0.08*△
-0.86(<0.05)
-0.94(<0.05)
Nim治疗组
30min
7
78.62±0.53▲
0.74±0.21*△▲
-0.84(<0.05)
-0.89(<0.05)
, 百拇医药
4h
7
78.68±0.95▲
0.69±0.10*△▲
-0.86(<0.05)
-0.90(<0.05)
24h
7
78.79±0.46▲
0.56±0.16*△▲
-0.99(<0.05)
, 百拇医药
-0.86(<0.05)
与正常对照组比较 *P<0.05; 与假冷冻伤组比较 △P<0.05; 与冷冻伤组比较 ▲P<0.05; r1:[Ca2+]i与Ca2+-ATP酶活性的相关系数; r2:含水量与Ca2+-ATP酶活性的相关系数
讨 论
一、冷冻伤性脑水肿脑组织水分含量和EB含量变化及尼莫地平对其影响
Klatzo将脑水肿分为血管源性和细胞毒性脑水肿两大类:血管源性脑水肿主要是BBB受损,血浆成分渗出到细胞外间隙;细胞毒性脑水肿主要特点是细胞膜上的离子泵受损,造成细胞内水钠潴留。EB进入血液与血浆蛋白结合后不能通过BBB,只有当BBB破坏时,才能通过受损的BBB进入脑组织,使BBB受损区出现蓝染,是常用的脑血管通透性变化的指示剂,观察脑组织蓝染范围和深度及测定脑组织EB含量,可反映脑组织BBB通透性开放程度。本组实验采用甲酰胺测定EB的含量,以此反映BBB的破坏程度。在Nor组和Sham组EB含量无明显差别,Sham组脑组织EB含量高于Nor组,可能与手术创伤有关,但其差别无显著性(P>0.05),表明假冷冻伤并不引起BBB通透性的改变。冷冻伤后30分钟、4,24小时3个时间亚组冷冻侧脑组织水分含量和EB含量均明显高于Nor组和Sham组(P<0.05);脑组织含水量从30分钟Sham组的78.32%升高到FI组的79.98%,二者比较有显著性差异(P<0.05);EB含量从30分钟Sham组的1.24μg/g升高到FI组的4.56μg/g,明显高于Nor组和Sham组,二组比较亦有显著性差异(P<0.05)。随冷冻伤后时间的延长,脑含水量和EB含量增加,且脑含水量与EB含量之间具有高度的正相关关系(P<0.01)。见表1。说明BBB受损血管通透性增高是引起脑组织含水量增高的重要原因,即冷冻伤性脑水肿模型在早期即已发生BBB破坏,引起BBB通透性明显增高,EB含量升高,产生血管源性脑水肿(即细胞外水肿)。应用尼莫地平治疗后,脑组织含水量及EB含量均明显下降,说明尼莫地平能有效地改善BBB的通透性,从而减轻脑水肿。
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二、冷冻伤性脑水肿突触体[Ca2+]i变化及尼莫地平的治疗作用
细胞内钙离子超载是导致细胞死亡的“最后共同途径”。测定细胞内[Ca2+]i对于了解正常细胞功能及与Ca2+有关疾病的发生机制均有重要意义。本组研究结果表明:30分钟FI组突触体内[Ca2+]i随冷冻伤后时间的延长而持续进行性增高,脑组织含水量随[Ca2+]i的升高而增加。经直线相关分析表明,突触体[Ca2+]i与脑组织含水量变化相一致,两者之间存在高度的正相关关系
(r≥0.88,P<0.05)。提示冷冻伤性脑水肿的发生和发展与神经细胞内Ca2+超载有着密切的关系。应用尼莫地平治疗后,其各个时间组突触体[Ca2+]i明显下降,伴随脑组织水分含量明显下降,与FI组相比,其差别均有显著性意义(P<0.05)。提示尼莫地平通过降低冷冻伤性脑水肿脑突触体内
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[Ca2+]i,缓解细胞内钙离子超载,具有减轻脑水肿作用。根据实验结果可以推测神经细胞钙通道开放是导致脑水肿的主要因素之一,细胞内Ca2+超载对脑水肿的发生与发展起了重要的作用。Shapira等[5]检测大鼠闭合性脑损伤脑组织总Ca2+含量,提示脑损伤的早期脑组织总Ca2+含量增高,同时伴有脑水肿,且与脑水肿的严重程度呈正相关关系(r=0.65,P<0.01),故认为脑细胞内Ca2+聚积是脑水肿发生发展的主要原因。由此可见,神经细胞内钙在脑水肿的发生和发展中起着重要的作用,细胞内Ca2+超载对神经细胞的损伤是多方面的,这些机制协同作用既可引起细胞毒性脑水肿,又可导致血管源性脑水肿,最终导致神经元不可逆性损害。
三、尼莫地平对线粒体Ca2+-ATP酶活性的影响
线粒体富含Ca2+-ATP酶,也称钙泵,是维持细胞内钙稳态平衡的主要细胞器。故本实验利用线粒体测定其Ca2+-ATP酶活性来反映细胞内Ca2+-ATP酶活性。冷冻伤后30分钟神经元线粒体Ca2+-ATP酶活性显著下降,冷冻伤后4小时和24小时Ca2+-ATP酶活性持续降低,随冷冻后时间的延长而递降。采用相关回归分析发现,FI组冷冻侧细胞突触体[Ca2+]i与线粒体Ca2+-ATP酶活性之间的变化呈负相关关系(r≤-0.84,P<0.05)。Ca2+-ATP酶活性下降,钙泵排出Ca2+的能力下降,其差异有显著性意义。这充分论证了冷冻伤后神经元Ca2+通道发生了变化,并揭示了Ca2+通道开放与神经细胞内Ca2+超载和线粒体内Ca2+-ATP酶活性下降存在着内在的密切联系。尼莫地平是一种选择性较强的、非极性第二代二氢吡啶类有机钙拮抗剂,血浆蛋白结合率98%以上,易于透过血脑屏障。它与细胞膜上L-型钙通道的α1亚单位有非常高的亲和力,当与胞膜上受体识别位点结合后,引起L型电压依赖性钙通道构型改变,特异性阻断细胞膜上Ca2+通道,抑制细胞外Ca2+内流,防止细胞内Ca2+超载,阻断细胞损害的病理过程。同时,尼莫地平还直接刺激神经细胞Ca2+-ATP酶,使其活性增高[2]。一方面促进胞浆内Ca2+外排,另一方面,增强线粒体等Ca2+库摄取和储存Ca2+的能力,缓解细胞内Ca2+超载。从根本上阻断Ca2+超载所诱发的一系列病理变化,从而保护脑组织、恢复神经功能。
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从本研究结果来看,神经细胞浆内[Ca2+]i升高的机制,可能与以下两方面有关:(1)细胞膜上Ca2+通道开放,使细胞外液大量Ca2+内流。(2)脑缺血引起能量代谢障碍,ATP分解增加而合成减少,引起细胞ATP缺乏,其胞质膜上的Ca2+-ATP酶活性降低,线粒体Ca2+库储存Ca2+的能力下降,从而加重细胞内Ca2+超载。Ca2+-ATP酶活性随冷冻后时间延长而递减,且与[Ca2+]i呈负相关关系,从而也证明Ca2+-ATP酶活性下降在神经细胞胞浆内[Ca2+]i升高的机制中起着重要的作用。这已被本实验应用Ca2+通道阻滞剂尼莫地平治疗后,突触体[Ca2+]i明显下降而Ca2+-ATP酶活性明显升高所证实。
以上结果表明脑水肿的发生及发展与神经元细胞内钙离子的聚集有密切关系。冷冻伤性脑水肿早期(冷冻后30分钟)既发生了BBB通透性改变,引起血管源性脑水肿(细胞外水肿);又发生了神经细胞内Ca2+超载,引起细胞毒性脑水肿(细胞内水肿)。即冷冻伤性脑水肿(局灶性脑水肿),在早期既是血管源性脑水肿,又是细胞毒性脑水肿,细胞外水肿与细胞内水肿同步发展。尼莫地平通过改善BBB的通透性,降低神经细胞内[Ca2+]i,直接刺激神经细胞Ca2+-ATP酶,使其活性增高,既减轻血管源性脑水肿,又减轻细胞毒性脑水肿,即对血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿均有治疗作用。
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参考文献
[1]陈立华,曹美鸿,杨于嘉,等.尼莫地平对感染性脑水肿的脑保护作用.湖南医科大学学报,1997, 22∶393-396.
[2]陈立华,曹美鸿,马建荣,等.冷冻伤性脑水肿钙-ATP酶活性变化与脑水肿的关系.中华创伤杂志, 1997,13∶158-160.
[3]陈立华,曹美鸿,刘运生,等.Fura-2荧光标记法测定突触体内游离Ca2+浓度的原理及方法.临床神经科学,1997,5∶71-74.
[4]Cobbold Ph, Rink TJ. Fluorescence and bioluminesecen measurement of cytoplasmic free calcium. J Biochem, 1987, 248∶313-328.
[5]Shapira Y, Yadid G, Lotev S. Accumulation of calcium in the following head trauma.Neurol Res, 1989, 11∶169-172.
(收稿:1997-11-21 修回:1998-07-15), 百拇医药