鞘膜内注射一氧化氮合酶抑制剂对损伤脊髓血流及功能的影响
作者：周初松 李 明 高建章 赵定麟△
单位：
关键词：脊髓损伤；脊髓血流量；一氧化氮合酶
第二军医大学学报980618 摘要 目的：探讨一氧化氮(NO)在继发性脊髓损伤中的作用。方法：伤前30 min鞘膜内注射不同剂量的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)，观察其对伤段脊髓血流量及神经功能的影响。结果：小剂量的L-NAME降低了伤段脊髓早期局部血流量，但改善了损伤脊髓的神经功能；而大剂量的L-NAME则长时间内严重地减少了伤段脊髓血流量，加重了伤段脊髓神经功能损伤。结论：脊髓损伤早期伤段脊髓NO适度产生有利于神经功能恢复，而其过度产生则加重继发性脊髓损害。
中国图书资料分类法分类号 R651.2
The effect of intrathecal administration of nitric oxide synthase inhibitor on blood flow and function of injurious spinal cord in rats
, 百拇医药
Zhou Chusong, Li Ming, Gao Jianzhang, Zhao Dinglin (Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To explore the effect of nitric oxide (NO) on the secondary spinal cord injury. Methods: The different doses of nitric oxide synthase(NOS) inhibitor, Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), were infused into spinal subarachnoid space 30 min before spinal cord injury( SCI), and spinal cord blood flow( SCBF) at trauma sites was monitored, neurological function was evaluated. Results: The early SCBF was reduced with the small dose of L-NAME, and neurological function was ameliorated; but the large dose of L-NAME resulted in spinal cord ischemia for a long time, and worsened acute spinal cord injury. Conclusion: The moderate production of NO in early damaged spinal cord benefits restore of neurological function, but the significant restriction of NO production can worsen the secondary spinal cord injury.
, 百拇医药
Key words spinal cord injuries; spinal cord blood flow; nitric oxide
一氧化氮(Nitric oxide，NO)作为重要的生物小分子，在体内发挥着广泛的生物学效应，机体内的每一种组织细胞几乎都处于NO的作用之下[1]。在中枢神经系统，NO的主要生理作用是参与信使传递及调节血管张力；而在脑缺血等病理情况下，过量产生的NO具有神经毒性，加重缺血性脑损害[2]。本实验通过给大鼠蛛网膜下腔注射一氧化氮合酶(NOS)抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)来观察NO对急性脊髓损伤早期伤段脊髓血流量及其功能的影响，并探讨其意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 选用健康、封闭群雌性SD大鼠32只，体质量(280±30) g，购自上海计划生育研究所。分为A组：假手术组； B组：生理盐水组； C组：L-NAME 0.15 mg组及D组：L-NAME 1.50 mg组，每组8只。
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1.2 试剂与仪器 L-NAME购自Sigma公司。激光多普勒血流仪(LDF-1)购自上海医用激光仪器厂。
1.3 蛛网膜下腔插管及给药方法 1.0%戊巴比妥钠30 mg/kg大鼠腹腔内注射麻醉后，采用Yaksh等[3]法于蛛网膜下腔插入PE-10导管。在脊髓受压前30 min用微量注射器经PE管给药。A、B 组各注射10 μl生理盐水，C、D组分别注射含有0.15 mg和1.50 mg L-NAME的生理盐水溶液10 μl。
1.4 脊髓压迫方法 切除大鼠T8～10椎板，按Nystrom等[4]方法致伤脊髓(35.0 g，10 min)，压迫装置垫片大小为2.5 mm×5.0 mm，略呈弧形。
1.5 脊髓血流的监测 在暴露的脊髓两侧中线旁开1.0 mm处各取一点，将激光多普勒血流仪探头贴于硬脊膜上，避免压迫，两点之平均值即为该时相脊髓血流的反应值。各组动物均于注药前、压迫后不同时间进行动态观测。以注药前测量值为基数，各时相以基数的百分比表示该时相脊髓血流的相对值。
, 百拇医药
1.6 神经功能观测 伤后1～4周按统一标准观测大鼠肢体运动功能评分及测定倾斜平面临界角。按如下标准由未知实验细节者进行运动功能评分：0分，完全瘫痪，无肌肉收缩；1分，有肌肉收缩，但肢体不能活动；2分，肢体可活动，但无法站立；3分，可站立，但无法行走；4分，可行走，但严重晃摆；5分，可行走，中度晃摆；6分，可行走，轻度晃摆；7分，正常。倾斜平面临界角度测定采用Rivlin法。
1.7 统计学处理 数据以X±s表示。采用方差分析和t检验进行统计学分析。
2 结 果
2.1 L-NAME对损伤脊髓局部血流量的影响 伤后2 min，C、D两组间伤段脊髓血流量无明显差异，但均明显低于B组(P<0.01)；伤后10 min，C、D两组伤段脊髓血流量均进一步降低，D组尤为明显，仅为基数值的(26.09±6.22)%。之后，C 组血流量缓慢上升，伤后2 h升至B组同时相水平；而D组在伤后3 h内一直处于极低灌注水平(图1)。
, 百拇医药
图 1 L-NAME对大鼠伤段脊髓血流量的影响
Fig 1 Effects of L-NAME on spinal cord blood
flow of spinal cord injury rats
○: Sham; ●: Saline; ■: 0.15 mg L-NAME;
▲: 1.50 mg L-NAME; **P<0.01 vs group B
2.2 L-NAME对损伤脊髓神经功能的影响 L-NAME对损伤脊髓神经功能评分及脊髓倾斜平面角的影响见表1，2。
表 1 L-NAME对损伤脊髓神经功能评分的影响
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Tab 1 Effects of L-NAME on the neurological function score
of spinal card injury rats(X±s) Group
n
Time after injury (t/week)
1
2
3
4
A
8
7.00±0.00
, http://www.100md.com
B
8
2.75±0.46
3.63±0.74
4.25±0.46
4.33±0.52
C
8
3.50±0.76*
4.25±1.28
5.25±0.89*
5.63±0.74**
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D
7
2.57±0.79△
2.86±0.90△
3.71±0.49*△△
3.70±0.47*△△
*P<0.05， **P<0.01 vs group B; △P<0.05， △△P<0.01 vs group C表 2 L-NAME对损伤脊髓倾斜平面角的影响
Tab 2 Effects of L-NAME on the critical angle of in clination flat of injured spinal cord(X±s，α/°) Group
, 百拇医药
n
Time after injury (t/week)
1
2
3
4
A
8
62.50±2.67
62.50±2.67
63.13±2.59
63.75±2.31
, 百拇医药
B
8
35.00±3.78
38.75±2.31
45.63±1.77
45.63±3.20
C
8
40.00±3.78*
43.75±5.18*
50.00±7.56
52.50±5.35**
, 百拇医药
D
7
32.86±4.88△△
35.00±4.08*△△
38.29±3.45**△△
39.29±3.45**△△
*P<0.05， **P<0.01 vs group B; △P<0.05， △△P<0.01 vs group C
结果表明，伤前30 min鞘膜内注射0.15 mg L-NAME使伤后脊髓神经功能恢复的速度和程度均优于损伤对照组；而注射1.50 mg L-NAME使伤后脊髓神经功能恢复缓慢。同时发现大鼠脊髓伤后3周，神经功能不再有明显恢复。
, 百拇医药
3 讨 论
急性脊髓损伤包括原发性损伤及继发性损伤。由于对不可逆的原发性损伤目前尚无有效的治疗方法，加之许多迹象表明，中枢神经损伤后功能丧失主要是由创伤刺激所激发的一系列级联放大的细胞毒过程引起，因而脊髓伤后治疗的主要目的在于阻止或减少继发性损伤的发生，最大限度地保存受伤脊髓的功能。实验研究发现，NOS 广泛存在于包括脊髓在内的中枢神经系统中[5]，由其催化产生的NO与其他许多神经递质释放相关联。因而NO除介导生理调节功能外，尚是病理状态下主要的毒性介质。
本实验通过鞘膜内注射不同剂量的NOS竞争性抑制剂L-NAME后观察发现：伤段脊髓血流量及其神经功能恢复均受到了影响。前期实验结果证明0.15 mg L-NAME有效地抑制了外源性谷氨酸激活的NOS活性，其中0.15 mg L-NAME在伤后短时间内降低了伤段脊髓血流量，但有效地改善了受伤脊髓神经功能。其可能原因：(1)抑制了脊髓伤后早期NO的大量产生，从而避免了早期高灌注所致的再灌注损伤。(2)抑制了兴奋性氨基酸所致的NO释放，从而阻断了兴奋性氨基酸的毒性作用，因为有实验表明，NO介导了谷氨酸的神经毒性[6]。(3)轴突对缺血有一定的耐受性。因而，虽然该剂量抑制剂在短时间内降低了脊髓血流量，但由于部分抑制了NO 的产生，所以避免或降低了NO的毒性作用。而1.50 mg L-NAME由于长时间且程度更强地抑制了NO的产生，导致脊髓持续缺血，故而加重了受伤脊髓功能的损害。
, 百拇医药
总之，脊髓伤后NO的过度释放会导致脊髓继发性损害；同样，其过度抑制则由于导致伤段脊髓血液循环障碍，从而也加重了脊髓损伤。表明NO既有改善伤段脊髓血流量，有利于损伤脊髓神经功能恢复的作用，又有加重脊髓损害的毒性，因而其在脊髓伤后继发性损伤中具有双重作用。
参 考 文 献
1 Schmidt HW, Walter U. NO at work. Cell, 1994, 78(9):919
2 Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 1994, 298(1):249
3 Yaksh TL, Ruda TA. Chronic catheterization of the spinal su- barachnoid.Physiol Behav, 1976, 17(5):1031
, 百拇医药
4 Nystrom B, Berglund JE. Spinal cord restitution following com- pression injuries in rats. Acta Neurol Scand, 1988, 78(3):467
5 Barjavel MJ, Bhargava HN. Nitric oxide synthase activity in brain regions and spinal cord of mice and rats: kinetic analysis. Pharmacology, 1995, 50(3):168
6 Kashii S, Mandai M, Kikuchi M, et al. Dual actions of nitric oxide in N-methyl-D-aspartate receptor-mediated neurotoxicity in cultured retinal neurons. Brain Res, 1996, 711(1～2):93
(1998-05-25收稿， 1998-06-05修回), 百拇医药
单位：
关键词：脊髓损伤；脊髓血流量；一氧化氮合酶
第二军医大学学报980618 摘要 目的：探讨一氧化氮(NO)在继发性脊髓损伤中的作用。方法：伤前30 min鞘膜内注射不同剂量的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)，观察其对伤段脊髓血流量及神经功能的影响。结果：小剂量的L-NAME降低了伤段脊髓早期局部血流量，但改善了损伤脊髓的神经功能；而大剂量的L-NAME则长时间内严重地减少了伤段脊髓血流量，加重了伤段脊髓神经功能损伤。结论：脊髓损伤早期伤段脊髓NO适度产生有利于神经功能恢复，而其过度产生则加重继发性脊髓损害。
中国图书资料分类法分类号 R651.2
The effect of intrathecal administration of nitric oxide synthase inhibitor on blood flow and function of injurious spinal cord in rats
, 百拇医药
Zhou Chusong, Li Ming, Gao Jianzhang, Zhao Dinglin (Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To explore the effect of nitric oxide (NO) on the secondary spinal cord injury. Methods: The different doses of nitric oxide synthase(NOS) inhibitor, Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), were infused into spinal subarachnoid space 30 min before spinal cord injury( SCI), and spinal cord blood flow( SCBF) at trauma sites was monitored, neurological function was evaluated. Results: The early SCBF was reduced with the small dose of L-NAME, and neurological function was ameliorated; but the large dose of L-NAME resulted in spinal cord ischemia for a long time, and worsened acute spinal cord injury. Conclusion: The moderate production of NO in early damaged spinal cord benefits restore of neurological function, but the significant restriction of NO production can worsen the secondary spinal cord injury.
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Key words spinal cord injuries; spinal cord blood flow; nitric oxide
一氧化氮(Nitric oxide，NO)作为重要的生物小分子，在体内发挥着广泛的生物学效应，机体内的每一种组织细胞几乎都处于NO的作用之下[1]。在中枢神经系统，NO的主要生理作用是参与信使传递及调节血管张力；而在脑缺血等病理情况下，过量产生的NO具有神经毒性，加重缺血性脑损害[2]。本实验通过给大鼠蛛网膜下腔注射一氧化氮合酶(NOS)抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)来观察NO对急性脊髓损伤早期伤段脊髓血流量及其功能的影响，并探讨其意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 选用健康、封闭群雌性SD大鼠32只，体质量(280±30) g，购自上海计划生育研究所。分为A组：假手术组； B组：生理盐水组； C组：L-NAME 0.15 mg组及D组：L-NAME 1.50 mg组，每组8只。
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1.2 试剂与仪器 L-NAME购自Sigma公司。激光多普勒血流仪(LDF-1)购自上海医用激光仪器厂。
1.3 蛛网膜下腔插管及给药方法 1.0%戊巴比妥钠30 mg/kg大鼠腹腔内注射麻醉后，采用Yaksh等[3]法于蛛网膜下腔插入PE-10导管。在脊髓受压前30 min用微量注射器经PE管给药。A、B 组各注射10 μl生理盐水，C、D组分别注射含有0.15 mg和1.50 mg L-NAME的生理盐水溶液10 μl。
1.4 脊髓压迫方法 切除大鼠T8～10椎板，按Nystrom等[4]方法致伤脊髓(35.0 g，10 min)，压迫装置垫片大小为2.5 mm×5.0 mm，略呈弧形。
1.5 脊髓血流的监测 在暴露的脊髓两侧中线旁开1.0 mm处各取一点，将激光多普勒血流仪探头贴于硬脊膜上，避免压迫，两点之平均值即为该时相脊髓血流的反应值。各组动物均于注药前、压迫后不同时间进行动态观测。以注药前测量值为基数，各时相以基数的百分比表示该时相脊髓血流的相对值。
, 百拇医药
1.6 神经功能观测 伤后1～4周按统一标准观测大鼠肢体运动功能评分及测定倾斜平面临界角。按如下标准由未知实验细节者进行运动功能评分：0分，完全瘫痪，无肌肉收缩；1分，有肌肉收缩，但肢体不能活动；2分，肢体可活动，但无法站立；3分，可站立，但无法行走；4分，可行走，但严重晃摆；5分，可行走，中度晃摆；6分，可行走，轻度晃摆；7分，正常。倾斜平面临界角度测定采用Rivlin法。
1.7 统计学处理 数据以X±s表示。采用方差分析和t检验进行统计学分析。
2 结 果
2.1 L-NAME对损伤脊髓局部血流量的影响 伤后2 min，C、D两组间伤段脊髓血流量无明显差异，但均明显低于B组(P<0.01)；伤后10 min，C、D两组伤段脊髓血流量均进一步降低，D组尤为明显，仅为基数值的(26.09±6.22)%。之后，C 组血流量缓慢上升，伤后2 h升至B组同时相水平；而D组在伤后3 h内一直处于极低灌注水平(图1)。
, 百拇医药
图 1 L-NAME对大鼠伤段脊髓血流量的影响
Fig 1 Effects of L-NAME on spinal cord blood
flow of spinal cord injury rats
○: Sham; ●: Saline; ■: 0.15 mg L-NAME;
▲: 1.50 mg L-NAME; **P<0.01 vs group B
2.2 L-NAME对损伤脊髓神经功能的影响 L-NAME对损伤脊髓神经功能评分及脊髓倾斜平面角的影响见表1，2。
表 1 L-NAME对损伤脊髓神经功能评分的影响
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Tab 1 Effects of L-NAME on the neurological function score
of spinal card injury rats(X±s) Group
n
Time after injury (t/week)
1
2
3
4
A
8
7.00±0.00
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B
8
2.75±0.46
3.63±0.74
4.25±0.46
4.33±0.52
C
8
3.50±0.76*
4.25±1.28
5.25±0.89*
5.63±0.74**
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D
7
2.57±0.79△
2.86±0.90△
3.71±0.49*△△
3.70±0.47*△△
*P<0.05， **P<0.01 vs group B; △P<0.05， △△P<0.01 vs group C表 2 L-NAME对损伤脊髓倾斜平面角的影响
Tab 2 Effects of L-NAME on the critical angle of in clination flat of injured spinal cord(X±s，α/°) Group
, 百拇医药
n
Time after injury (t/week)
1
2
3
4
A
8
62.50±2.67
62.50±2.67
63.13±2.59
63.75±2.31
, 百拇医药
B
8
35.00±3.78
38.75±2.31
45.63±1.77
45.63±3.20
C
8
40.00±3.78*
43.75±5.18*
50.00±7.56
52.50±5.35**
, 百拇医药
D
7
32.86±4.88△△
35.00±4.08*△△
38.29±3.45**△△
39.29±3.45**△△
*P<0.05， **P<0.01 vs group B; △P<0.05， △△P<0.01 vs group C
结果表明，伤前30 min鞘膜内注射0.15 mg L-NAME使伤后脊髓神经功能恢复的速度和程度均优于损伤对照组；而注射1.50 mg L-NAME使伤后脊髓神经功能恢复缓慢。同时发现大鼠脊髓伤后3周，神经功能不再有明显恢复。
, 百拇医药
3 讨 论
急性脊髓损伤包括原发性损伤及继发性损伤。由于对不可逆的原发性损伤目前尚无有效的治疗方法，加之许多迹象表明，中枢神经损伤后功能丧失主要是由创伤刺激所激发的一系列级联放大的细胞毒过程引起，因而脊髓伤后治疗的主要目的在于阻止或减少继发性损伤的发生，最大限度地保存受伤脊髓的功能。实验研究发现，NOS 广泛存在于包括脊髓在内的中枢神经系统中[5]，由其催化产生的NO与其他许多神经递质释放相关联。因而NO除介导生理调节功能外，尚是病理状态下主要的毒性介质。
本实验通过鞘膜内注射不同剂量的NOS竞争性抑制剂L-NAME后观察发现：伤段脊髓血流量及其神经功能恢复均受到了影响。前期实验结果证明0.15 mg L-NAME有效地抑制了外源性谷氨酸激活的NOS活性，其中0.15 mg L-NAME在伤后短时间内降低了伤段脊髓血流量，但有效地改善了受伤脊髓神经功能。其可能原因：(1)抑制了脊髓伤后早期NO的大量产生，从而避免了早期高灌注所致的再灌注损伤。(2)抑制了兴奋性氨基酸所致的NO释放，从而阻断了兴奋性氨基酸的毒性作用，因为有实验表明，NO介导了谷氨酸的神经毒性[6]。(3)轴突对缺血有一定的耐受性。因而，虽然该剂量抑制剂在短时间内降低了脊髓血流量，但由于部分抑制了NO 的产生，所以避免或降低了NO的毒性作用。而1.50 mg L-NAME由于长时间且程度更强地抑制了NO的产生，导致脊髓持续缺血，故而加重了受伤脊髓功能的损害。
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总之，脊髓伤后NO的过度释放会导致脊髓继发性损害；同样，其过度抑制则由于导致伤段脊髓血液循环障碍，从而也加重了脊髓损伤。表明NO既有改善伤段脊髓血流量，有利于损伤脊髓神经功能恢复的作用，又有加重脊髓损害的毒性，因而其在脊髓伤后继发性损伤中具有双重作用。
参 考 文 献
1 Schmidt HW, Walter U. NO at work. Cell, 1994, 78(9):919
2 Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 1994, 298(1):249
3 Yaksh TL, Ruda TA. Chronic catheterization of the spinal su- barachnoid.Physiol Behav, 1976, 17(5):1031
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4 Nystrom B, Berglund JE. Spinal cord restitution following com- pression injuries in rats. Acta Neurol Scand, 1988, 78(3):467
5 Barjavel MJ, Bhargava HN. Nitric oxide synthase activity in brain regions and spinal cord of mice and rats: kinetic analysis. Pharmacology, 1995, 50(3):168
6 Kashii S, Mandai M, Kikuchi M, et al. Dual actions of nitric oxide in N-methyl-D-aspartate receptor-mediated neurotoxicity in cultured retinal neurons. Brain Res, 1996, 711(1～2):93
(1998-05-25收稿， 1998-06-05修回), 百拇医药