大鼠脊髓损伤后DNA损伤与P53蛋白的表达
作者：侯铁胜 傅 强 鲁凯伍 赵 杰 李 明
单位：
关键词：脱氧核糖核酸损伤；P53蛋白；脊髓损伤
第二军医大学学报980615 摘要 目的: 检测大鼠脊髓损伤后神经细胞的DNA损伤、凋亡及P53蛋白的表达。方法：采用大鼠脊髓急性压迫损伤模型,应用原位末端标记、DNA凝胶电泳、免疫组化等方法,对大鼠损伤脊髓进行检测。结果：脊髓损伤后4 h开始出现凋亡细胞及P53蛋白表达，并在24 h达到高峰。两者阳性细胞形态及分布有相似之处。DNA电泳可见24 h组出现特征性条带。结论：大鼠脊髓损伤后出现大量的DNA损伤和神经细胞凋亡。P53蛋白可能参与了诱导神经细胞凋亡的过程。
中国图书资料分类法分类号 R651.2
DNA damage and P53 protein expression after rat spinal cord injury
, http://www.100md.com
Hou Tiesheng, Fu Qiang , Lu Kaiwu, Zhao Jie, Li Ming (Department of Orthopaedics,Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To determine the DNA damage, neuronal cells apoptosis and the expression of P53 protein in the rat spinal cord after compression injury. Methods: We used terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUPT nick end labeling (TUNEL), DNA gel electrophoresis and immunohistochemistry techniques to detect DNA fragmentation in the injured rat spinal cord. Results: The apoptosic cells and P53 protein presented at 4 h after spinal cord injury, with a maximum presence at 24 h. DNA fragmentation presented typical ladder pattern on agarose gel at 24 h. Conclusion: There are lots of neuronal cells apoptosis and DNA damage in the spinal cord after injury. The P53 protein may be play an important role in induction of neuronal cells to apoptosis.
, 百拇医药
Key words deoxyribonucleases damage; P53 protein; spinal cord injuries
1995年11月在神经疾病及休克国际学术会议上,讨论的中心议题是中枢神经系统损伤后DNA的损伤及修复[1]。此后该领域成为研究热点。目前已发现在脑缺血性和机械性损伤后广泛存在DNA损伤，可表现为神经细胞凋亡、DNA的片段化、转录水平修复、相关基因表达等[2]。但目前对脊髓损伤(SCI)后是否存在DNA损伤及相关基因表达，尚无深入研究。我们采用TUNEL标记、免疫组化、DNA凝胶电泳等技术，检测了SCI后DNA损伤、神经细胞凋亡及P53蛋白的表达。
1 材料和方法
1.1 动物及模型 成年SD大鼠35只(购于BK公司)，雄性，体质量(300±20) g。动物随机分组：对照组(4只)，损伤组分为30 min、2，4，8，24，48和72 h时间组(除24 h组7只大鼠外,余各组4只)。脊髓损伤模型参照
法[2]，致中度损伤。对照组大鼠仅行椎板切除术。
, http://www.100md.com
1.2 取材及切片 动物在各时间点麻醉后，经左心室-主动脉插管灌流，完整取出脊髓组织。先将每一标本切为损伤段(T8～9)、相邻头侧段(T7)和相邻尾侧段(T10),每段长约5 mm。石蜡包埋后，连续切片，片厚10 μm。每个组织块随机取连续切片4张，分别做TUNEL标记、免疫组化、HE和Nissl染色。24 h组中3只动物麻醉后，暴露损伤及相邻脊髓，切取脊髓组织约60 mg，迅速放于-20℃冰箱保存。用相同方法取对照组1只大鼠胸段脊髓60 mg。
1.3 TUNEL标记 采用Boehringer Manheim公司原位末端标记试剂盒，方法同文献[3]。其中TdT酶溶液浓度应适当稀释，以减少假阳性反应。
1.4 免疫组化 采用SABC法：切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加封闭液。滴加抗P53的一抗工作液(武汉博士德公司)，37℃ 2 h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃ 20 min。滴加HIGH-SABC液,37℃ 40 min,以增加敏感性及降低背景。TBS冲洗，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水封片。
, 百拇医药
1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 采用Linnik法[4]，并在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电流40 mA。
2 结 果
2.1 HE及Nissl染色 光镜下可见损伤区30 min时即有广泛出血。8 h时灰质结构破坏，前角神经元尚存，但Nissl体减少，部分神经元固缩。24 h后灰质结构紊乱，无明显正常神经元。各节段白质后柱均有破坏。
2.2 TUNEL标记 对照组及30 min、2 h组仅见偶染细胞。4 h后灰白质中均出现大量阳性细胞。灰质中阳性细胞在8 h达高峰，阳性胶质细胞在24 h达高峰。此后48及72 h因损伤区结构破坏严重，阳性细胞数量下降，但相邻节段仍有大量阳性细胞。高倍镜下可见阳性细胞形态有多种形式，其中除典型凋亡细胞(细胞体固缩、染色质浓聚等)外(图1A)，还有部分细胞胞浆、胞核均被标记，阳性物质呈细小颗粒均匀分布，染色质着色浅，此类为坏死细胞。
, http://www.100md.com
2.3 免疫组化 对照组、阴性实验及30 min、2 h组无明显阳性细胞。4 h后各节段灰白质中均有大量阳性细胞，其分布特征与TUNEL阳性细胞分布相似。在24 h时阳性细胞数量最多，72 h仍有表达，但数量减少。高倍镜下，阳性细胞主要分为两种类型：一类细胞阳性信号位于细胞核内，另一类细胞阳性信号主要位于胞浆内。前者细胞形态大多异常，表现为细胞胞体固缩，染色质常呈半月形贴于核膜(图1B)。这类细胞与TUNEL阳性细胞形态相似，后者形态大多比较正常(图1C)，常位于损伤比较轻的区域。白质中有大量阳性胶质细胞，上述两种形态对比明显(图1D)。
图 1 大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和P53蛋白表达
Fig 1 The apoptosic neuronal cells and expression of P53 protein in the rat injured spinal cord
, http://www.100md.com
A: The TUNEL-positive neurons (→) and TUNEL-negative neurons (→) in
the ventral horn of T10 at 4 h (×40); B: P53 protein was expressed in the nucleus of neurons (→) in the T8～9 at 8 h (×100); C: P53 protein was expressed in the cytoplasm of neurons in the L5 at 24 h (×250); D: P53 protein was expressed in the glial cells in the white matter of T7 at 24 h (×100)
, http://www.100md.com
图 2 大鼠损伤脊髓组织DNA凝胶电泳图
Fig 2 Gel electrophoresis of the DNA extracted
from thoracic spinal cord of the rats
Subjected to sham operation (a) and moderate compression followed by 24 h of injury. Bands with a laddering pattern are seen in (b), indicating the presence of nucleosome-sized DNA fragmentation, superimposed on smearlike staining, which is indicative of necrosis.DNA markers are shown in (c)
, 百拇医药
2.4 DNA凝胶电泳 24 h组可见明显的DNA条带(DNA laddering)，其大小为核小体的整数倍。电泳带起始端有片状弥散分布的物质(图2)。
3 讨 论
随着分子生物学的发展，提出了DNA的损伤及修复可能是CNS损伤后一系列病理变化的分子基础。目前主要的研究热点之一是相关基因的表达及其作用[1]。这些工作虽主要在脑损伤模型上开展，但为我们认识SCI损伤的机制提供了新思路。
本实验证实，SCI后也广泛存在DNA损伤和神经细胞凋亡。细胞凋亡的机制就是受损细胞在多种因素作用下，核酸内切酶激活，将DNA链分解成以180～200 bp为基数的多个DNA片断，同时暴露大量3-OH断端，继而出现细胞形态改变，其实质就是DNA损伤的细胞表现形式。TUNEL标记法正是通过标记3-OH断端，在原位检测DNA损伤的一种技术。大量文献报道采用该技术发现神经元损伤后DNA断裂增加，从而形成一种理论：即神经细胞除坏死外，还可以凋亡方式死亡[2，4]。在本实验中，我们发现TUNEL技术不仅可以标记凋亡细胞，还可以标记部分坏死细胞[3]。因此有人怀疑TUNEL法作为最常用的凋亡检测方法的可靠性。这说明TUNEL法是一种敏感性很高的DNA断裂检测方法。这是由于细胞坏死时，也伴有DNA的断裂。但这种断裂具有随意性，特异性3-OH断端数量少，故阳性信号较弱。在光镜下结合细胞形态，可以加以鉴别。这一现象也表明SCI后DNA损伤的形式可以有多种。
, http://www.100md.com
研究表明，P53蛋白在CNS损伤后大量表达，并且可能是诱导神经细胞凋亡的核心物质[5]。本研究采用免疫组化方法证实SCI后P53蛋白大量表达。这种蛋白可能以突变型为主，但目前尚无特异性抗体加以鉴别。本结果表明P53蛋白不仅在核内表达，而且可在胞浆内表达。在核内表达的细胞往往表现为凋亡的形态或结构有损伤而在胞浆内表达的细胞形态较正常。国外学者也有类似发现，并认为核内表达的P53可能与细胞凋亡有密切关系[6]。而体外实验发现p53基因转染的海马神经元以凋亡形式大量死亡[7]。本实验结果还出现了神经细胞凋亡与P53表达时间的一致性，以及在24 h时出现DNA凝胶电泳典型条带。这些都为p53参与了SCI后神经细胞DNA损伤及凋亡提供了证据。
综上所述，可以推测SCI后广泛存在DNA损伤，并诱发P53在神经细胞中高表达。因此从DNA损伤角度来看，细胞凋亡及坏死并非截然分开的两种死亡方式，可能仅仅是DNA损伤不同发展阶段在细胞形态上的不同表现而已。故我们认为SCI后前24 h是治疗的关键，可考虑施行损伤DNA的修复、P53蛋白的拮抗及凋亡过程的阻断等治疗。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Chopp M, Chan PH, Hsu CY, et al. DNA damage and repair in central nervous system injury: national institute of neurological disorders and stroke workshop summary. Stroke, 1996, 27(3):363
2 Andreas R, Fung KM, John Q, et al. Evidence of apoptosic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat. Am J Pathol, 1995, 147(6):1575
3 傅 强，侯铁胜，刘善荣，等. 大鼠脊髓压迫性损伤后神经细胞的死亡方式. 第二军医大学学报, 1997, 18(6)：557
, 百拇医药
4 Linnik M, Zobrist RH, Hatfield MD. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rat. Stroke, 1993, 24(12):2002
5 Wood KA, Youle RJ. The role of free radicals and P53 in neuron apoptosis in vivo. J Neurosci, 1995, 15(18):5851
6 Manev H, Kharlamov A, Armstrong DM. Photochemical brain injury in rat triggers DNA fragmentation, P53 and hsp72. Neuroreport, 1994, 5(18):2661
7 Xiang H, Hochman DW, Saya H, et al. Evidence for P53-mediated modulation of neuronal viability. J Neurosci, 1996, 16(21):6753
(1998-06-13收稿， 1998-10-13修回), 百拇医药
单位：
关键词：脱氧核糖核酸损伤；P53蛋白；脊髓损伤
第二军医大学学报980615 摘要 目的: 检测大鼠脊髓损伤后神经细胞的DNA损伤、凋亡及P53蛋白的表达。方法：采用大鼠脊髓急性压迫损伤模型,应用原位末端标记、DNA凝胶电泳、免疫组化等方法,对大鼠损伤脊髓进行检测。结果：脊髓损伤后4 h开始出现凋亡细胞及P53蛋白表达，并在24 h达到高峰。两者阳性细胞形态及分布有相似之处。DNA电泳可见24 h组出现特征性条带。结论：大鼠脊髓损伤后出现大量的DNA损伤和神经细胞凋亡。P53蛋白可能参与了诱导神经细胞凋亡的过程。
中国图书资料分类法分类号 R651.2
DNA damage and P53 protein expression after rat spinal cord injury
, http://www.100md.com
Hou Tiesheng, Fu Qiang , Lu Kaiwu, Zhao Jie, Li Ming (Department of Orthopaedics,Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To determine the DNA damage, neuronal cells apoptosis and the expression of P53 protein in the rat spinal cord after compression injury. Methods: We used terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUPT nick end labeling (TUNEL), DNA gel electrophoresis and immunohistochemistry techniques to detect DNA fragmentation in the injured rat spinal cord. Results: The apoptosic cells and P53 protein presented at 4 h after spinal cord injury, with a maximum presence at 24 h. DNA fragmentation presented typical ladder pattern on agarose gel at 24 h. Conclusion: There are lots of neuronal cells apoptosis and DNA damage in the spinal cord after injury. The P53 protein may be play an important role in induction of neuronal cells to apoptosis.
, 百拇医药
Key words deoxyribonucleases damage; P53 protein; spinal cord injuries
1995年11月在神经疾病及休克国际学术会议上,讨论的中心议题是中枢神经系统损伤后DNA的损伤及修复[1]。此后该领域成为研究热点。目前已发现在脑缺血性和机械性损伤后广泛存在DNA损伤，可表现为神经细胞凋亡、DNA的片段化、转录水平修复、相关基因表达等[2]。但目前对脊髓损伤(SCI)后是否存在DNA损伤及相关基因表达，尚无深入研究。我们采用TUNEL标记、免疫组化、DNA凝胶电泳等技术，检测了SCI后DNA损伤、神经细胞凋亡及P53蛋白的表达。
1 材料和方法
1.1 动物及模型 成年SD大鼠35只(购于BK公司)，雄性，体质量(300±20) g。动物随机分组：对照组(4只)，损伤组分为30 min、2，4，8，24，48和72 h时间组(除24 h组7只大鼠外,余各组4只)。脊髓损伤模型参照
法[2]，致中度损伤。对照组大鼠仅行椎板切除术。, http://www.100md.com
1.2 取材及切片 动物在各时间点麻醉后，经左心室-主动脉插管灌流，完整取出脊髓组织。先将每一标本切为损伤段(T8～9)、相邻头侧段(T7)和相邻尾侧段(T10),每段长约5 mm。石蜡包埋后，连续切片，片厚10 μm。每个组织块随机取连续切片4张，分别做TUNEL标记、免疫组化、HE和Nissl染色。24 h组中3只动物麻醉后，暴露损伤及相邻脊髓，切取脊髓组织约60 mg，迅速放于-20℃冰箱保存。用相同方法取对照组1只大鼠胸段脊髓60 mg。
1.3 TUNEL标记 采用Boehringer Manheim公司原位末端标记试剂盒，方法同文献[3]。其中TdT酶溶液浓度应适当稀释，以减少假阳性反应。
1.4 免疫组化 采用SABC法：切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加封闭液。滴加抗P53的一抗工作液(武汉博士德公司)，37℃ 2 h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃ 20 min。滴加HIGH-SABC液,37℃ 40 min,以增加敏感性及降低背景。TBS冲洗，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水封片。
, 百拇医药
1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 采用Linnik法[4]，并在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电流40 mA。
2 结 果
2.1 HE及Nissl染色 光镜下可见损伤区30 min时即有广泛出血。8 h时灰质结构破坏，前角神经元尚存，但Nissl体减少，部分神经元固缩。24 h后灰质结构紊乱，无明显正常神经元。各节段白质后柱均有破坏。
2.2 TUNEL标记 对照组及30 min、2 h组仅见偶染细胞。4 h后灰白质中均出现大量阳性细胞。灰质中阳性细胞在8 h达高峰，阳性胶质细胞在24 h达高峰。此后48及72 h因损伤区结构破坏严重，阳性细胞数量下降，但相邻节段仍有大量阳性细胞。高倍镜下可见阳性细胞形态有多种形式，其中除典型凋亡细胞(细胞体固缩、染色质浓聚等)外(图1A)，还有部分细胞胞浆、胞核均被标记，阳性物质呈细小颗粒均匀分布，染色质着色浅，此类为坏死细胞。
, http://www.100md.com
2.3 免疫组化 对照组、阴性实验及30 min、2 h组无明显阳性细胞。4 h后各节段灰白质中均有大量阳性细胞，其分布特征与TUNEL阳性细胞分布相似。在24 h时阳性细胞数量最多，72 h仍有表达，但数量减少。高倍镜下，阳性细胞主要分为两种类型：一类细胞阳性信号位于细胞核内，另一类细胞阳性信号主要位于胞浆内。前者细胞形态大多异常，表现为细胞胞体固缩，染色质常呈半月形贴于核膜(图1B)。这类细胞与TUNEL阳性细胞形态相似，后者形态大多比较正常(图1C)，常位于损伤比较轻的区域。白质中有大量阳性胶质细胞，上述两种形态对比明显(图1D)。
图 1 大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和P53蛋白表达
Fig 1 The apoptosic neuronal cells and expression of P53 protein in the rat injured spinal cord
, http://www.100md.com
A: The TUNEL-positive neurons (→) and TUNEL-negative neurons (→) in
the ventral horn of T10 at 4 h (×40); B: P53 protein was expressed in the nucleus of neurons (→) in the T8～9 at 8 h (×100); C: P53 protein was expressed in the cytoplasm of neurons in the L5 at 24 h (×250); D: P53 protein was expressed in the glial cells in the white matter of T7 at 24 h (×100)
, http://www.100md.com
图 2 大鼠损伤脊髓组织DNA凝胶电泳图
Fig 2 Gel electrophoresis of the DNA extracted
from thoracic spinal cord of the rats
Subjected to sham operation (a) and moderate compression followed by 24 h of injury. Bands with a laddering pattern are seen in (b), indicating the presence of nucleosome-sized DNA fragmentation, superimposed on smearlike staining, which is indicative of necrosis.DNA markers are shown in (c)
, 百拇医药
2.4 DNA凝胶电泳 24 h组可见明显的DNA条带(DNA laddering)，其大小为核小体的整数倍。电泳带起始端有片状弥散分布的物质(图2)。
3 讨 论
随着分子生物学的发展，提出了DNA的损伤及修复可能是CNS损伤后一系列病理变化的分子基础。目前主要的研究热点之一是相关基因的表达及其作用[1]。这些工作虽主要在脑损伤模型上开展，但为我们认识SCI损伤的机制提供了新思路。
本实验证实，SCI后也广泛存在DNA损伤和神经细胞凋亡。细胞凋亡的机制就是受损细胞在多种因素作用下，核酸内切酶激活，将DNA链分解成以180～200 bp为基数的多个DNA片断，同时暴露大量3-OH断端，继而出现细胞形态改变，其实质就是DNA损伤的细胞表现形式。TUNEL标记法正是通过标记3-OH断端，在原位检测DNA损伤的一种技术。大量文献报道采用该技术发现神经元损伤后DNA断裂增加，从而形成一种理论：即神经细胞除坏死外，还可以凋亡方式死亡[2，4]。在本实验中，我们发现TUNEL技术不仅可以标记凋亡细胞，还可以标记部分坏死细胞[3]。因此有人怀疑TUNEL法作为最常用的凋亡检测方法的可靠性。这说明TUNEL法是一种敏感性很高的DNA断裂检测方法。这是由于细胞坏死时，也伴有DNA的断裂。但这种断裂具有随意性，特异性3-OH断端数量少，故阳性信号较弱。在光镜下结合细胞形态，可以加以鉴别。这一现象也表明SCI后DNA损伤的形式可以有多种。
, http://www.100md.com
研究表明，P53蛋白在CNS损伤后大量表达，并且可能是诱导神经细胞凋亡的核心物质[5]。本研究采用免疫组化方法证实SCI后P53蛋白大量表达。这种蛋白可能以突变型为主，但目前尚无特异性抗体加以鉴别。本结果表明P53蛋白不仅在核内表达，而且可在胞浆内表达。在核内表达的细胞往往表现为凋亡的形态或结构有损伤而在胞浆内表达的细胞形态较正常。国外学者也有类似发现，并认为核内表达的P53可能与细胞凋亡有密切关系[6]。而体外实验发现p53基因转染的海马神经元以凋亡形式大量死亡[7]。本实验结果还出现了神经细胞凋亡与P53表达时间的一致性，以及在24 h时出现DNA凝胶电泳典型条带。这些都为p53参与了SCI后神经细胞DNA损伤及凋亡提供了证据。
综上所述，可以推测SCI后广泛存在DNA损伤，并诱发P53在神经细胞中高表达。因此从DNA损伤角度来看，细胞凋亡及坏死并非截然分开的两种死亡方式，可能仅仅是DNA损伤不同发展阶段在细胞形态上的不同表现而已。故我们认为SCI后前24 h是治疗的关键，可考虑施行损伤DNA的修复、P53蛋白的拮抗及凋亡过程的阻断等治疗。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Chopp M, Chan PH, Hsu CY, et al. DNA damage and repair in central nervous system injury: national institute of neurological disorders and stroke workshop summary. Stroke, 1996, 27(3):363
2 Andreas R, Fung KM, John Q, et al. Evidence of apoptosic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat. Am J Pathol, 1995, 147(6):1575
3 傅 强，侯铁胜，刘善荣，等. 大鼠脊髓压迫性损伤后神经细胞的死亡方式. 第二军医大学学报, 1997, 18(6)：557
, 百拇医药
4 Linnik M, Zobrist RH, Hatfield MD. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rat. Stroke, 1993, 24(12):2002
5 Wood KA, Youle RJ. The role of free radicals and P53 in neuron apoptosis in vivo. J Neurosci, 1995, 15(18):5851
6 Manev H, Kharlamov A, Armstrong DM. Photochemical brain injury in rat triggers DNA fragmentation, P53 and hsp72. Neuroreport, 1994, 5(18):2661
7 Xiang H, Hochman DW, Saya H, et al. Evidence for P53-mediated modulation of neuronal viability. J Neurosci, 1996, 16(21):6753
(1998-06-13收稿， 1998-10-13修回), 百拇医药