肾癌组织中细胞凋亡及相关基因bcl-2和bax表达的研究
作者：杨宝龙 顾方六 李宏军 孔祥田 俞莉章
单位：100034 北京医科大学泌尿外科研究所(杨宝龙 现在海军总医院泌尿外科)
关键词：肾肿瘤；基因蛋白质类；基因表达
中华外科杂志/980619 【摘要】 目的 探讨肾癌的发病机制。 方法 采用原位DNA片断末端标记和免疫组织化学方法，检测48例肾癌组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白的表达。 结果 48例肾癌组织中bcl-2蛋白低表达22例，凋亡指数(AI)均值为1.35；高表达26例，AI均值为1.04。两组AI均值间统计学分析差异有显著意义(P<0.05)。bax蛋白低表达34例，AI均值为1.03；高表达14例，AI均值为1.63。两组AI均值间统计学分析差异有非常显著意义(P<0.01)。bcl-2蛋白表达越强，bax蛋白表达越弱，凋亡细胞数就越少。 结论 bcl-2和bax蛋白均参与了肾癌组织中细胞凋亡的调节，并在肾癌的发生和发展中发挥着重要作用。
, 百拇医药
Apoptosis of renal cell carcinoma and apoptotic related genes bcl-2 and bax Yang Baolong, Gu Fangliu, Li Hongjun,et al.Institute of Urology, Beijing Medical University,Beijing 100034.
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of renal cell carcinoma (RCC). Method We detected the apoptotic status and the expression of apoptotic related gene bcl-2 and bax protein in 48 cases of RCC with TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry methods. Result 22 cases showed low expression of bcl-2 protein with an average apoptotic index (AI) of 1.35 and 26 cases had high exprssion of bcl-2 with an AI of 1.04(P<0.05). 34 cases showed low expression of bax protein with average AI of 1.03 and 14 cases had high expression of bax protein with an average AI of 1.63 (P<0.01). The stronger bcl-2 expression,the weaker bax expression and the less number of apoptotic cells. Conclusion both bcl-2 and bax take part in the occurrence and progerssion of RCC.
, 百拇医药
【Key words】 Kidney neoplasms Proteins Gene expression
近年来人们开始注意细胞凋亡(apoptosis)的减少在肿瘤的发生及发展中所起的作用。我们采用原位DNA片断末端标记(TUNEL)和免疫组织化学方法对48例肾癌组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白的表达进行了研究，现报告如下。
资料与方法
1.组织标本来源：肾癌组织为1993年～1995年间北京医科大学泌尿外科研究所手术切除的标本，其中男32例，女16例，年龄12～76岁，平均年龄50.21岁，标本均经病理学检查证实为肾癌。
2.原位DNA片断末端标记：参照Gavrieli的方方法进行TUNEL，并略加改进[1]。
, 百拇医药
凋亡细胞记数：细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例切片计数5～10个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
3.免疫组织化学实验：一抗为鼠抗人bcl-2单克隆抗体(No 887，为DAKO公司产品)、兔抗人bax多克隆抗体(No 20 ，为Santa Cruz公司产品)、生物素标记的兔抗鼠IgG、羊抗兔IgG和链菌素亲生物素蛋白-过氧化物酶连接(LSAB)复合物(为美国Vector生物试剂公司产品)。所有标本均在同一条件下采用LSAB法进行免疫组织化学染色,一抗稀释度均为1∶50；各步间均用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。
结果判断:细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞,切片内阳性细胞率小于50%为弱表达；大于50%为强表达。
结果
1.肾癌组织中bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系：根据bcl-2蛋白在肾癌组织中阳性染色细胞的多少，将48例肾癌分为bcl-2蛋白低表达和高表达两组(表1)。两组AI均值间统计学分析差异有显著性意义(P<0.05)。表明bcl-2蛋白表达越强，凋亡细胞数越少。
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表1 肾癌组织bcl-2蛋白表达与AI对比分析 分 组
例 数
AI(
±s)
bcl-2低表达组
22
1.3481±0.7060
bcl-2高表达组
26
1.0386±0.4276
2.肾癌组织bax蛋白表达与细胞凋亡的关系：根据bax蛋白在肾癌组织中阳性染色细胞的多少，将48例肾癌分为bax蛋白低表达和高表达两组(表2)。两组AI均值间统计学分析差异有非常显著性意义(P<0.01)。表明bax蛋白表达越强，凋亡细胞数就越多。
, 百拇医药
表2 肾癌组织bax蛋白表达与AI对比分析 分 组
例 数
AI(±s)
bax低表达组
34
1.0324±0.5072
bax高表达组
14
1.6286±0.6456
讨论
肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势。有关肾癌的发病机制目前还不十分清楚。在肿瘤形成过程中，细胞数目的增加是其突出的特点，这可能是由于细胞增殖的增加或细胞死亡的减少或两者兼有。细胞死亡有两种基本类型，即细胞坏死和细胞凋亡。近年的研究认为，细胞凋亡的减少是肿瘤发生和发展的重要因素[2，3]。有关细胞凋亡的发生机制非常复杂,受多种促进和抑制因素的影响。目前已发现有二类细胞凋亡相关基因，即促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。这些基因主要来自昆虫、哺乳动物和病毒的研究结果。按照基因的性质划分，可以分为原癌基因、抑癌基因、病毒基因、生长因子及其抑制因子基因、细胞的受体基因和蛋白激酶基因等。多种癌基因如P53、bcl-2、c-myc和生长因子如TGF-β均参与细胞凋亡的调控[4，5]。尤其是bcl-2和近年新发现的bax基因被认为与细胞凋亡的调控关系密切。bcl-2基因在凋亡中所起作用的研究较多,但关于bax基因在肿瘤组织凋亡中所起作用的研究甚少。对bcl-2和bax基因的进一步深入研究，有望为探讨肾癌凋亡的发生机制以及在肾癌发生和发展中所起的作用提供理论依据。
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bcl-2基因是80年代初在某些淋巴瘤患者B细胞中发现的，是t(14,18)染色体易位断点处的一种癌基因，bcl-2蛋白位于线粒体内膜、核膜和内质网。现已知bcl-2蛋白在多种上皮性肿瘤均有异常表达,如胃癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌[6～8]。Chiou等[9]将bcl-2基因转入幼鼠肾细胞后能抑制野生型p53诱导的凋亡。早年人们认为bcl-2也是一种致癌基因，随着研究的不断深入，发现bcl-2基因产物并不象典型的致癌基因那样加速细胞分裂、细胞增殖，而是促进细胞生存，延长细胞寿命。目前，已发现多种与bcl-2同源的基因，如BHRF1、HMW5-HL、bcl-2、bax、bak、bad和Mcl-1基因等。这些基因构成了bcl-2基因家族。在体内bcl-2基因家族的成员可以具有两种截然不同的功能，尚有待进一步研究[10]。bax基因是近年来新发现的一种凋亡促进基因，属bcl-2同一家族。bax蛋白的氨基酸序列有21%与bcl-2同源，有三种不同的编码蛋白bax-α、β和γ。bax基因具有拮抗bcl-2抑制凋亡作用[11]。bcl-2和bax是一对正负凋亡调节基因，Oltvai等[12]等认为，bcl-2由一个相关蛋白bax来调节。bcl-2及bax蛋白都是均一的二聚体，反应时需一个分子bcl-2及一个分子bax结合，形成异二聚体，结合后的蛋白才具有调节凋亡功能。bax/bcl-2的比值，对于决定细胞接受刺激信号后存活与否起关键性的作用。bcl-2过量表达(bcl-2-bcl-2)，细胞存活；bax过量表达(bax-bax)细胞死亡。
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参考文献
1Gavrieli Y, Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992, 119:493-501.
2Tsujitani S, Shirai H, Tatebes T, et al. Apoptosis cell death and its relationship to carcinogenesis in colorectal carcinoma. Cancer, 1996,77:1711-1716.
3Kerr JF,Winterford CM, Biol ADR, et al. Apoptosis:its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994, 73:2013-2026.
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4Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
5Sell C, Baserga R, Rubin R. Insulin-like growth factor I(IGF-I) and the IGF-I receptor prevent etoposide-induced apoptosis. Cancer Res, 1995,55:303-306.
6Gregory Y, Lauwers MD,Gregory V, et al. Immunohistochemical evaluation of bcl-2 protein exprexssion in gastric adenocarcinomas. Cancer, 1995, 75:2209-2213.
, 百拇医药
7Baretton GB, Diebold J,Christoforis G, et al. Apoptosis and immunohistochemical bcl-2 expressionin in colorectal adenomas and carcinomas.Cancer, 1996,77:255-264.
8King ED, Matteson J, Jacobs SC, et al. Incidence of apoptosis,cell proliferation and bcl-2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder association with turmor progression. J Urol,1996,155:316-320.
9Chiou SK, Rao L, White E. Bcl-2 blocks p53 -dependent apoptosis. Mol Cell Biol, 1994,14:2556-2563.
, http://www.100md.com
10White E. Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes Dev, 1996,10:11-15.
11Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A, et al. Immunohistochemical determination of in vivo distribution of bax, adominant inhibitor of bcl-2. Am J Pathol, 1994,145:1323-1336.
12Oltvai IN. bcl-2/bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death.Semin Cancer Biol, 1993,4:327-332., http://www.100md.com
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关键词：肾肿瘤；基因蛋白质类；基因表达
中华外科杂志/980619 【摘要】 目的 探讨肾癌的发病机制。 方法 采用原位DNA片断末端标记和免疫组织化学方法，检测48例肾癌组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白的表达。 结果 48例肾癌组织中bcl-2蛋白低表达22例，凋亡指数(AI)均值为1.35；高表达26例，AI均值为1.04。两组AI均值间统计学分析差异有显著意义(P<0.05)。bax蛋白低表达34例，AI均值为1.03；高表达14例，AI均值为1.63。两组AI均值间统计学分析差异有非常显著意义(P<0.01)。bcl-2蛋白表达越强，bax蛋白表达越弱，凋亡细胞数就越少。 结论 bcl-2和bax蛋白均参与了肾癌组织中细胞凋亡的调节，并在肾癌的发生和发展中发挥着重要作用。
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Apoptosis of renal cell carcinoma and apoptotic related genes bcl-2 and bax Yang Baolong, Gu Fangliu, Li Hongjun,et al.Institute of Urology, Beijing Medical University,Beijing 100034.
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of renal cell carcinoma (RCC). Method We detected the apoptotic status and the expression of apoptotic related gene bcl-2 and bax protein in 48 cases of RCC with TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry methods. Result 22 cases showed low expression of bcl-2 protein with an average apoptotic index (AI) of 1.35 and 26 cases had high exprssion of bcl-2 with an AI of 1.04(P<0.05). 34 cases showed low expression of bax protein with average AI of 1.03 and 14 cases had high expression of bax protein with an average AI of 1.63 (P<0.01). The stronger bcl-2 expression,the weaker bax expression and the less number of apoptotic cells. Conclusion both bcl-2 and bax take part in the occurrence and progerssion of RCC.
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【Key words】 Kidney neoplasms Proteins Gene expression
近年来人们开始注意细胞凋亡(apoptosis)的减少在肿瘤的发生及发展中所起的作用。我们采用原位DNA片断末端标记(TUNEL)和免疫组织化学方法对48例肾癌组织细胞凋亡状态及凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白的表达进行了研究，现报告如下。
资料与方法
1.组织标本来源：肾癌组织为1993年～1995年间北京医科大学泌尿外科研究所手术切除的标本，其中男32例，女16例，年龄12～76岁，平均年龄50.21岁，标本均经病理学检查证实为肾癌。
2.原位DNA片断末端标记：参照Gavrieli的方方法进行TUNEL，并略加改进[1]。
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凋亡细胞记数：细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例切片计数5～10个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
3.免疫组织化学实验：一抗为鼠抗人bcl-2单克隆抗体(No 887，为DAKO公司产品)、兔抗人bax多克隆抗体(No 20 ，为Santa Cruz公司产品)、生物素标记的兔抗鼠IgG、羊抗兔IgG和链菌素亲生物素蛋白-过氧化物酶连接(LSAB)复合物(为美国Vector生物试剂公司产品)。所有标本均在同一条件下采用LSAB法进行免疫组织化学染色,一抗稀释度均为1∶50；各步间均用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。
结果判断:细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞,切片内阳性细胞率小于50%为弱表达；大于50%为强表达。
结果
1.肾癌组织中bcl-2蛋白表达与细胞凋亡的关系：根据bcl-2蛋白在肾癌组织中阳性染色细胞的多少，将48例肾癌分为bcl-2蛋白低表达和高表达两组(表1)。两组AI均值间统计学分析差异有显著性意义(P<0.05)。表明bcl-2蛋白表达越强，凋亡细胞数越少。
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表1 肾癌组织bcl-2蛋白表达与AI对比分析 分 组
例 数
AI(
±s)bcl-2低表达组
22
1.3481±0.7060
bcl-2高表达组
26
1.0386±0.4276
2.肾癌组织bax蛋白表达与细胞凋亡的关系：根据bax蛋白在肾癌组织中阳性染色细胞的多少，将48例肾癌分为bax蛋白低表达和高表达两组(表2)。两组AI均值间统计学分析差异有非常显著性意义(P<0.01)。表明bax蛋白表达越强，凋亡细胞数就越多。
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表2 肾癌组织bax蛋白表达与AI对比分析 分 组
例 数
AI(
±s)bax低表达组
34
1.0324±0.5072
bax高表达组
14
1.6286±0.6456
讨论
肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势。有关肾癌的发病机制目前还不十分清楚。在肿瘤形成过程中，细胞数目的增加是其突出的特点，这可能是由于细胞增殖的增加或细胞死亡的减少或两者兼有。细胞死亡有两种基本类型，即细胞坏死和细胞凋亡。近年的研究认为，细胞凋亡的减少是肿瘤发生和发展的重要因素[2，3]。有关细胞凋亡的发生机制非常复杂,受多种促进和抑制因素的影响。目前已发现有二类细胞凋亡相关基因，即促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。这些基因主要来自昆虫、哺乳动物和病毒的研究结果。按照基因的性质划分，可以分为原癌基因、抑癌基因、病毒基因、生长因子及其抑制因子基因、细胞的受体基因和蛋白激酶基因等。多种癌基因如P53、bcl-2、c-myc和生长因子如TGF-β均参与细胞凋亡的调控[4，5]。尤其是bcl-2和近年新发现的bax基因被认为与细胞凋亡的调控关系密切。bcl-2基因在凋亡中所起作用的研究较多,但关于bax基因在肿瘤组织凋亡中所起作用的研究甚少。对bcl-2和bax基因的进一步深入研究，有望为探讨肾癌凋亡的发生机制以及在肾癌发生和发展中所起的作用提供理论依据。
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bcl-2基因是80年代初在某些淋巴瘤患者B细胞中发现的，是t(14,18)染色体易位断点处的一种癌基因，bcl-2蛋白位于线粒体内膜、核膜和内质网。现已知bcl-2蛋白在多种上皮性肿瘤均有异常表达,如胃癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌[6～8]。Chiou等[9]将bcl-2基因转入幼鼠肾细胞后能抑制野生型p53诱导的凋亡。早年人们认为bcl-2也是一种致癌基因，随着研究的不断深入，发现bcl-2基因产物并不象典型的致癌基因那样加速细胞分裂、细胞增殖，而是促进细胞生存，延长细胞寿命。目前，已发现多种与bcl-2同源的基因，如BHRF1、HMW5-HL、bcl-2、bax、bak、bad和Mcl-1基因等。这些基因构成了bcl-2基因家族。在体内bcl-2基因家族的成员可以具有两种截然不同的功能，尚有待进一步研究[10]。bax基因是近年来新发现的一种凋亡促进基因，属bcl-2同一家族。bax蛋白的氨基酸序列有21%与bcl-2同源，有三种不同的编码蛋白bax-α、β和γ。bax基因具有拮抗bcl-2抑制凋亡作用[11]。bcl-2和bax是一对正负凋亡调节基因，Oltvai等[12]等认为，bcl-2由一个相关蛋白bax来调节。bcl-2及bax蛋白都是均一的二聚体，反应时需一个分子bcl-2及一个分子bax结合，形成异二聚体，结合后的蛋白才具有调节凋亡功能。bax/bcl-2的比值，对于决定细胞接受刺激信号后存活与否起关键性的作用。bcl-2过量表达(bcl-2-bcl-2)，细胞存活；bax过量表达(bax-bax)细胞死亡。
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