牙龈卟啉菌内毒素对鼠成纤维细胞和人牙龈组织的损害
作者：陈莉丽 严杰 朱仲珍
单位：
关键词：
中华口腔医学杂志980630 我们应用免疫组织化学、免疫胶体金及电镜技术研究了牙龈卟啉菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, Pg-LPS)侵入小鼠成纤维细胞和成年人牙周炎(adult periodontitis, AP)牙龈组织后的定位及超微结构病变。
1.材料与方法：①Pg-LPS的制备：以酚水法提取Pg47A-1株的LPS，用核酸酶消化和超速离心法将其纯化。②细胞株和人牙龈组织样本：所用为3T3小鼠成纤维细胞。按Dunning分类法，采集中度以上AP的牙龈样本25例。以12例健康牙龈组织样本为对照。③免疫组化检测：牙龈组织按常规方法制片。Pg单克隆抗体CY-4为一抗，可与Pg-LPS抗原结合[1]。HRP标记的羊抗鼠Ig为二抗，DAB为显色底物。④Pg-LPS的定位：单层成纤维细胞培养物加入含100 mg/L Pg-LPS的DMEM培养基，37℃下分别培
养5、15、30和60 min，收集细胞并用Hank＇s液洗涤3次。收集的细胞和反复经Hank＇s液洗涤的人牙龈组织均用3%戊二醛固定，常规方法制片。CY-4-单克隆抗体为一抗，胶体金标记的羊抗鼠Ig为二抗。充分洗涤后在电镜下观察。⑤超微结构病变：免疫组化和免疫电镜检测阳性的样本负染后，用扫描电镜观察内质网、核糖体和线粒体等超微结构的变化。
2.结果：①免疫组化检测：14例AP牙龈组织样本(56.0%)呈明显黄棕色，着色范围广；正常牙龈组织样本无一例阳性。②Pg-LPS侵入后的定位：Pg-LPS加入成纤维细胞培养物中，5 min后即可在胞浆中被检出；第60 min后细胞核中出现Pg-LPS。免疫组化检测阳性的AP牙龈组织成纤维细胞的胞浆、核或细胞间隙均可见与Pg-LPS结合的胶体金颗粒。正常牙龈组织未检出Pg-LPS。③超微结构病变：Pg-LPS作用的成纤维细胞及其检测阳性的牙龈组织和成纤维细胞均可出现超微结构病变，如内质网扩张、膜旁核糖体脱落、线粒体膜及嵴模糊甚至消失。
3.讨论：已往的文献中均尚未见有关Pg-LPS能否侵入细胞和人牙周组织并具有毒性的报道。我们的研究结果表明，Pg-LPS能侵入细胞和人牙龈组织并引起内质网、核糖体和线粒体等结构不同程度的病变，提示Pg-LPS对细胞及其细胞器具有非选择性毒性。Pg-LPS可在5 min内侵入成纤维细胞并随作用时间延长，在核膜附近及核中被检出。表明Pg-LPS虽为大分子物质，但易穿过细胞膜和核膜，这种穿膜机理可能与其疏水区有关。由于Pg-LPS作用的鼠成纤维细胞和其检测阳性的AP牙龈组织及成纤维细胞具有十分相似的严重病变，表明LPS是Pg的致病物质之一，可能在AP发病过程中起重要作用。
参考文献
1 陈莉丽，严杰.牙龈类杆菌单克隆抗体的研究.临床口腔医学杂志，1993，9：131-133.
(收稿：1997-02-06 修回：1998-01-20), 百拇医药
单位：
关键词：
中华口腔医学杂志980630 我们应用免疫组织化学、免疫胶体金及电镜技术研究了牙龈卟啉菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, Pg-LPS)侵入小鼠成纤维细胞和成年人牙周炎(adult periodontitis, AP)牙龈组织后的定位及超微结构病变。
1.材料与方法：①Pg-LPS的制备：以酚水法提取Pg47A-1株的LPS，用核酸酶消化和超速离心法将其纯化。②细胞株和人牙龈组织样本：所用为3T3小鼠成纤维细胞。按Dunning分类法，采集中度以上AP的牙龈样本25例。以12例健康牙龈组织样本为对照。③免疫组化检测：牙龈组织按常规方法制片。Pg单克隆抗体CY-4为一抗，可与Pg-LPS抗原结合[1]。HRP标记的羊抗鼠Ig为二抗，DAB为显色底物。④Pg-LPS的定位：单层成纤维细胞培养物加入含100 mg/L Pg-LPS的DMEM培养基，37℃下分别培
养5、15、30和60 min，收集细胞并用Hank＇s液洗涤3次。收集的细胞和反复经Hank＇s液洗涤的人牙龈组织均用3%戊二醛固定，常规方法制片。CY-4-单克隆抗体为一抗，胶体金标记的羊抗鼠Ig为二抗。充分洗涤后在电镜下观察。⑤超微结构病变：免疫组化和免疫电镜检测阳性的样本负染后，用扫描电镜观察内质网、核糖体和线粒体等超微结构的变化。
2.结果：①免疫组化检测：14例AP牙龈组织样本(56.0%)呈明显黄棕色，着色范围广；正常牙龈组织样本无一例阳性。②Pg-LPS侵入后的定位：Pg-LPS加入成纤维细胞培养物中，5 min后即可在胞浆中被检出；第60 min后细胞核中出现Pg-LPS。免疫组化检测阳性的AP牙龈组织成纤维细胞的胞浆、核或细胞间隙均可见与Pg-LPS结合的胶体金颗粒。正常牙龈组织未检出Pg-LPS。③超微结构病变：Pg-LPS作用的成纤维细胞及其检测阳性的牙龈组织和成纤维细胞均可出现超微结构病变，如内质网扩张、膜旁核糖体脱落、线粒体膜及嵴模糊甚至消失。
3.讨论：已往的文献中均尚未见有关Pg-LPS能否侵入细胞和人牙周组织并具有毒性的报道。我们的研究结果表明，Pg-LPS能侵入细胞和人牙龈组织并引起内质网、核糖体和线粒体等结构不同程度的病变，提示Pg-LPS对细胞及其细胞器具有非选择性毒性。Pg-LPS可在5 min内侵入成纤维细胞并随作用时间延长，在核膜附近及核中被检出。表明Pg-LPS虽为大分子物质，但易穿过细胞膜和核膜，这种穿膜机理可能与其疏水区有关。由于Pg-LPS作用的鼠成纤维细胞和其检测阳性的AP牙龈组织及成纤维细胞具有十分相似的严重病变，表明LPS是Pg的致病物质之一，可能在AP发病过程中起重要作用。
参考文献
1 陈莉丽，严杰.牙龈类杆菌单克隆抗体的研究.临床口腔医学杂志，1993，9：131-133.
(收稿：1997-02-06 修回：1998-01-20), 百拇医药