龈沟液中弹性蛋白酶水平与白细胞数目的关系
作者：和璐 曹采方 沙月琴
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：龈沟液；胰肽酶；中性白细胞；牙周炎
中华口腔医学杂志980608 【摘要】 目的 初步探讨龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中细胞外弹性蛋白酶(elastase in the supernatant, EA-s)、细胞内弹性蛋白酶(elastase in the pellet, EA-p)及中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)间的关系。方法 先用滤纸条法取GCF样本，以底物检测法分别测定其中的EA-s和EA-p水平；24 h 后在同一部位用龈沟灌洗法收集GCF灌洗液，光镜下计数PMN。结果 EA-s与EA-p的总水平和PMN数目三者间均呈正相关(P<0.001)。结论 GCF中弹性蛋白酶水平与PMN数目一致，可以用EA-p的水平代表同一样本中PMN的数量。
, 百拇医药
Relationship between elastase activity and leukocyte counts in gingival crevicular fluid
He Lu, Cao Caifang, Sha Yueqin. School of Stomatology, Beijing Medical University，Beijing 100081
【Abstract】 Objective To determine the relationship among the elastase(EA) activity in the supernatant (EA-s) , and in the pellet (EA-p)after centrifuge, and polymorphonuclear leukocyte (PMN) counts in gingival crevicular fluid. Methods Gingival crevicular fluid (GCF) was sampled with filter paper strips by intra-pocket method to determine EA levels and then with gingival crevicular washings after 24 hours at the same site for PMN counting. The levels of EA-s and EA-p were determined seperately using the subtract Meosuc-ala-ala-val-pro-NA . PMNs at the same site were counted with light microscope. Results The research demonstrated significantly positive correlation among EA-s and EA-p per site and the PMN counts in GCF (P<0.001). Conclusion GCF-EA-p per site could reflect the amount of PMNs collected from the pockets, and EA can be the marker of PMN in GCF.
, 百拇医药
【Key words】 Gingival crevicular fluid Pancreatopeptidase Neutrophils Periodontitis
龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中的弹性蛋白酶(elastase，EA)能够广泛地破坏牙周结缔组织和骨组织，被认为与牙周组织的活动性破坏密切相关，近年来渐成为GCF中日益受到重视的一种酶[1,2]。它主要由中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte , PMN)的嗜天青颗粒释放，理论上推测GCF中的EA水平应与PMN数目一致，但尚无人证实。1994年，Gustafsson等[3]首先提出以往测定的EA水平实际为其总水平，由细胞外EA(EA in the supernatant，EA-s)和细胞内EA(EA in the pellet，EA-p)共同组成。其中，EA-s在取样当时已存在于GCF中，具有活性作用；EA-p是由于检测过程中将取得的PMN破坏而释放出来的，取样当时还在PMN中而尚无活性作用。Gustafsson等[3]和Jin等[4]由此推断EA-p水平可以代表取样当时GCF中的PMN数量，但此推断尚有待证实。EA-s 和EA-p之间有何关系，也未见报道。由于PMN在牙周炎的发生和发展中起着防御和破坏的双重作用，对EA和PMN关系的探讨将有助于认识牙周炎的发病机制。通过本研究，我们初步探讨了GCF中EA-s、EA-p与PMN数目三者间的关系。
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材料和方法
1.病例选择：从我院牙周科选择成人牙周炎患者11例，男4例，女7例，年龄27～58岁(平均43.1岁)。患者符合：①全身健康，无系统性疾病；②1年以上未做过牙周治疗；③3个月内未服用抗生素、非甾体类药物及其他可能影响白细胞的药物；④妇女未妊娠。从每位患者口腔内选不相邻的邻面颊侧牙周炎位点(探诊深度≥4mm)3～8个，根尖片示邻面牙槽骨有不同程度的吸收。对患者不做口腔卫生指导和治疗，3～5天后复诊取GCF样本。
2.收集GCF样本并记录临床指标：参考周爽英等[5]的方法用滤纸条收集GCF并定量、贮存，取样前记录菌斑指数(plaque index, PLI)，取样后记录探诊深度(probing depth, PD)、附着丧失(attachment loss, AL)和出血指数(bleeding index, BI)。
3.GCF中PMN的计数[6]：用滤纸条法取GCF， 24小时后在同一部位用龈沟灌洗法收集10μl GCF灌洗液于Eppendorf 管。每份灌洗液再用生理盐水稀释到50μl ，取稀释后样本10μl于光学显微镜下计数PMN。
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4.全部取样完成后，将贮存的GCF样本集中于某一段时间成批测定其中的EA：①同法[5]收集另5例牙周炎患者的32份GCF样本以形成一个GCF库，再按每一滤纸条用50μl缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.4， 0.15mol/L NaCl，0.1%Tween )稀释，离心提取上清液[5]，分装成4管，于-70℃贮存。待开始测定样本的EA时，取出按上述方法形成的GCF混合液并在室温下解冻，然后用相同缓冲液系列稀释。从不同稀释度的各管GCF混合液中分别取15μl，移入96孔酶标板上设定的相应标准孔，用于做标准曲线。②取出待测样本，室温下解冻后，每管加100μl不含Tween的缓冲液，离心洗提[5]，取上清液至另外标记的Eppendorf管，用于测定EA-s。遗有GCF沉淀物和滤纸条的每一Eppendorf管再加入含Tween的缓冲液100μl，震荡30min，供测定EA-p用。从每一管各取洗提后的样本15μl，加入96孔板上设定的样本孔。 取15μl 不含Tween的缓冲液加入对照孔。最后，在所有孔中加入100μl底物溶液(Meosuc-ala-ala-pro-val-NA，1mmol/L)，即刻置96孔板于湿盒中，在37℃温箱中孵育2 h 。用微板读数仪(Bio-Rad Mode 450型)在405 nm波长下测定吸光度。根据标准曲线计算每一样本的校正吸光度值(A)。同一患者治疗前后的样本在同一块96孔板上测定。
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结果
1.用Spearman等级相关分析GCF中EA-s、EA-p的总量水平和PMN数目三者间的关系，EA-p与PMNs、EA-s与PMNs、EA-p与EA-s间的相关系数分别为0.808、0.802及0.886(P<0.001)，三者间两两呈正相关关系。
2.用Spearman等级相关分析GCF中各生化指标与临床指标间的关系，详见附表。结果表明，每位点的EA-s、EA-p总量水平和PMN数目及EA-s的浓度与各临床指标(AL、PD、BI、PLI、GCF量)呈正相关，但EA-p的浓度和各临床指标均无相关关系。
附表 EA-s、EA-p水平及PMN数目与各临床
指标间的相关系数(r) 临床指标
EA-s
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EA-p
EA-s
浓度
EA-p
浓度
PMN
附着丧失
0.490*
0.490*
0.302**
0.145
0.532*
, 百拇医药
探诊深度
0.758*
0.748*
0.489*
0.125
0.829*
出血指数
0.774*
0.731*
0.588*
0.122
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0.796*
菌斑指数
0.701*
0.717*
0.454*
0.150
0.709*
龈沟液量
0.925*
0.833*
0.626*
, 百拇医药
-0.067
0.822*
n
98
100
89
89
84
注：*P<0.001，**P<0.05，EA-s：细胞外弹性蛋白酶；EA-p：细胞内弹性蛋白酶；PMN：中性多形核白细胞讨论
GCF中的EA-s总量、EA-p总量和PMN数目之间均呈高度正相关，这首次直接证实了以往的理论推测，即EA水平与PMN数目一致、EA-p可代表取样当时牙周袋内的PMN数量。Cimasoni和Giannopolou[7]曾建议在对溶酶体源的酶进行诊断性研究时，应考虑PMN数量的影响，但迄今研究极少，这主要是由于普通滤纸条上吸附的PMN极难洗提下来[8]，难以同时研究一份GCF样本中酶水平和PMN数目间的关系。本研究则表明用EA-p总量间接反映PMN的数目不失为一种进行这类研究的可行方法。曹剑宁等[9]曾用相似的取样方法，证明GCF中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)水平与PMN数目一致。作者等[6]也已证实未经治疗的牙周袋内第 2天的PMN数目可代表第1天的。但EA-s与EA-p的相关程度略强于各自与PMN数目的直接相关程度，提示对同一份样本内的不同成分进行比较的可靠性更大。GCF中EA-s和EA-p都与PMN数目呈高度正相关，也提示在只能测定EA总水平的情况下，可以用EA作为GCF中PMN的标志物。
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EA 只有在PMN受到激活或破坏时才会被释放，其内源性抑制剂主要是血清来源，在炎症情况下会渗出到组织中。组织中PMN释放的EA在进入GCF以前，大多数会被其抑制剂中和而被清除掉，而GCF中的EA-s和PMN的高度正相关则提示，GCF中EA-s主要是由牙周袋内的PMN产生，组织中的PMN释放的EA很少参与GCF中EA-s的组成。
GCF中EA水平和临床指标间的关系报道很少。本组结果与Cox和Eley[10]的结论相似，这可能因为都是对同一患者治疗前后的样本进行共同分析，而使临床指标的分布范围更广；与Gustafsson等[3]的观点仍略有差别，后者认为EA总水平和EA-s水平与PLI和牙龈指数无明显相关，这可能是后者仅对治疗前的炎症牙位进行分析，临床指标的分布范围相对窄。我们对GCF中EA-s和EA-p与临床指标的相关关系分开讨论，发现EA-p的浓度与各临床指标间无明显相关，以往的研究之所以认为EA浓度与临床指标的相关程度低于其总量与临床指标的相关程度[3,10]，可能与其中EA-p的影响有关。这也进一步提示，EA作为反映牙周组织破坏程度的敏感客观指标，EA-s的能力强于EA-p，建议今后观察GCF中EA水平变化时应测EA-s的水平。
, 百拇医药
参考文献
1 Eley BM, Cox SW. A 2-year longitudinal study of elastase in human gingival crevicular fluid and periodontal attachment loss. J Clin Periodontol，1996，23:681-692.
2 Palcanis KG, Larjava IK, Wells BR, et al. Elastase as an indicator of periodontal disease progression. J Periodontol ，1992，63:237-242.
3 Gustafsson A, Asman B, Bergstrom K. Altered relation between granulocyte elastase and alpha- 2-macroglobulin in gingival crevicular fluid from sites with periodontal destruction. J Clin Periodontol， 1994，21:17-21.
, http://www.100md.com
4 Jin LJ, Soder PO, Asman B, et al. Grannulocyte elastase in gingival crevicular fluid: improved monitoring of the site-specific response to treatment in patients with destructive periodontitis. J Clin Periodontol ，1995，22:240-246.
5 周爽英, 曹采方, 陈智滨 ，等. 牙周炎基础治疗后龈沟液中碱性磷酸酶的纵向观察. 现代口腔医学杂志，1997， 11(专辑): 32-34.
6 和璐, 曹采方, 沙月琴 ，等. 龈沟液中性多形核白细胞数目的重复性研究. 口腔医学纵横, 1998, 14: 92-94.
7 Cimasoni G, Giannopolou C. Can crevicular component analysis assist in diagnosis and monitoring periodontal breakdown? In: Guggenheim B, ed. Periodontology today. Zurich: Karger, Basal, 1988. 260-270.
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8 Andersen E， Cimasoni G. A rapid and simple method for counting crevicular polymorphonuclear leucocytes. J Clin Periodontol ，1993，20: 651-655.
9 曹剑宁, 曹采方, 张雪玲 ，等. 龈沟白细胞数及龈沟液髓过氧化物酶水平与临床指标的相关性. 北京医科大学学报, 1989，21: 45-46.
10 Cox SW, Eley BM . Cathepsin B/L- , elastase- ,tryptase-, trypsin- and dipeptidyl peptidase IV-like activities in gingival crevicular fluid.A comparison of levels before and after basic periodontal treatment of chronic periodontitis patients. J Clin Periodontol ，1992， 19: 333-339.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-07-21), http://www.100md.com
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：龈沟液；胰肽酶；中性白细胞；牙周炎
中华口腔医学杂志980608 【摘要】 目的 初步探讨龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中细胞外弹性蛋白酶(elastase in the supernatant, EA-s)、细胞内弹性蛋白酶(elastase in the pellet, EA-p)及中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)间的关系。方法 先用滤纸条法取GCF样本，以底物检测法分别测定其中的EA-s和EA-p水平；24 h 后在同一部位用龈沟灌洗法收集GCF灌洗液，光镜下计数PMN。结果 EA-s与EA-p的总水平和PMN数目三者间均呈正相关(P<0.001)。结论 GCF中弹性蛋白酶水平与PMN数目一致，可以用EA-p的水平代表同一样本中PMN的数量。
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Relationship between elastase activity and leukocyte counts in gingival crevicular fluid
He Lu, Cao Caifang, Sha Yueqin. School of Stomatology, Beijing Medical University，Beijing 100081
【Abstract】 Objective To determine the relationship among the elastase(EA) activity in the supernatant (EA-s) , and in the pellet (EA-p)after centrifuge, and polymorphonuclear leukocyte (PMN) counts in gingival crevicular fluid. Methods Gingival crevicular fluid (GCF) was sampled with filter paper strips by intra-pocket method to determine EA levels and then with gingival crevicular washings after 24 hours at the same site for PMN counting. The levels of EA-s and EA-p were determined seperately using the subtract Meosuc-ala-ala-val-pro-NA . PMNs at the same site were counted with light microscope. Results The research demonstrated significantly positive correlation among EA-s and EA-p per site and the PMN counts in GCF (P<0.001). Conclusion GCF-EA-p per site could reflect the amount of PMNs collected from the pockets, and EA can be the marker of PMN in GCF.
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【Key words】 Gingival crevicular fluid Pancreatopeptidase Neutrophils Periodontitis
龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中的弹性蛋白酶(elastase，EA)能够广泛地破坏牙周结缔组织和骨组织，被认为与牙周组织的活动性破坏密切相关，近年来渐成为GCF中日益受到重视的一种酶[1,2]。它主要由中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte , PMN)的嗜天青颗粒释放，理论上推测GCF中的EA水平应与PMN数目一致，但尚无人证实。1994年，Gustafsson等[3]首先提出以往测定的EA水平实际为其总水平，由细胞外EA(EA in the supernatant，EA-s)和细胞内EA(EA in the pellet，EA-p)共同组成。其中，EA-s在取样当时已存在于GCF中，具有活性作用；EA-p是由于检测过程中将取得的PMN破坏而释放出来的，取样当时还在PMN中而尚无活性作用。Gustafsson等[3]和Jin等[4]由此推断EA-p水平可以代表取样当时GCF中的PMN数量，但此推断尚有待证实。EA-s 和EA-p之间有何关系，也未见报道。由于PMN在牙周炎的发生和发展中起着防御和破坏的双重作用，对EA和PMN关系的探讨将有助于认识牙周炎的发病机制。通过本研究，我们初步探讨了GCF中EA-s、EA-p与PMN数目三者间的关系。
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材料和方法
1.病例选择：从我院牙周科选择成人牙周炎患者11例，男4例，女7例，年龄27～58岁(平均43.1岁)。患者符合：①全身健康，无系统性疾病；②1年以上未做过牙周治疗；③3个月内未服用抗生素、非甾体类药物及其他可能影响白细胞的药物；④妇女未妊娠。从每位患者口腔内选不相邻的邻面颊侧牙周炎位点(探诊深度≥4mm)3～8个，根尖片示邻面牙槽骨有不同程度的吸收。对患者不做口腔卫生指导和治疗，3～5天后复诊取GCF样本。
2.收集GCF样本并记录临床指标：参考周爽英等[5]的方法用滤纸条收集GCF并定量、贮存，取样前记录菌斑指数(plaque index, PLI)，取样后记录探诊深度(probing depth, PD)、附着丧失(attachment loss, AL)和出血指数(bleeding index, BI)。
3.GCF中PMN的计数[6]：用滤纸条法取GCF， 24小时后在同一部位用龈沟灌洗法收集10μl GCF灌洗液于Eppendorf 管。每份灌洗液再用生理盐水稀释到50μl ，取稀释后样本10μl于光学显微镜下计数PMN。
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4.全部取样完成后，将贮存的GCF样本集中于某一段时间成批测定其中的EA：①同法[5]收集另5例牙周炎患者的32份GCF样本以形成一个GCF库，再按每一滤纸条用50μl缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl，pH 7.4， 0.15mol/L NaCl，0.1%Tween )稀释，离心提取上清液[5]，分装成4管，于-70℃贮存。待开始测定样本的EA时，取出按上述方法形成的GCF混合液并在室温下解冻，然后用相同缓冲液系列稀释。从不同稀释度的各管GCF混合液中分别取15μl，移入96孔酶标板上设定的相应标准孔，用于做标准曲线。②取出待测样本，室温下解冻后，每管加100μl不含Tween的缓冲液，离心洗提[5]，取上清液至另外标记的Eppendorf管，用于测定EA-s。遗有GCF沉淀物和滤纸条的每一Eppendorf管再加入含Tween的缓冲液100μl，震荡30min，供测定EA-p用。从每一管各取洗提后的样本15μl，加入96孔板上设定的样本孔。 取15μl 不含Tween的缓冲液加入对照孔。最后，在所有孔中加入100μl底物溶液(Meosuc-ala-ala-pro-val-NA，1mmol/L)，即刻置96孔板于湿盒中，在37℃温箱中孵育2 h 。用微板读数仪(Bio-Rad Mode 450型)在405 nm波长下测定吸光度。根据标准曲线计算每一样本的校正吸光度值(A)。同一患者治疗前后的样本在同一块96孔板上测定。
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结果
1.用Spearman等级相关分析GCF中EA-s、EA-p的总量水平和PMN数目三者间的关系，EA-p与PMNs、EA-s与PMNs、EA-p与EA-s间的相关系数分别为0.808、0.802及0.886(P<0.001)，三者间两两呈正相关关系。
2.用Spearman等级相关分析GCF中各生化指标与临床指标间的关系，详见附表。结果表明，每位点的EA-s、EA-p总量水平和PMN数目及EA-s的浓度与各临床指标(AL、PD、BI、PLI、GCF量)呈正相关，但EA-p的浓度和各临床指标均无相关关系。
附表 EA-s、EA-p水平及PMN数目与各临床
指标间的相关系数(r) 临床指标
EA-s
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EA-p
EA-s
浓度
EA-p
浓度
PMN
附着丧失
0.490*
0.490*
0.302**
0.145
0.532*
, 百拇医药
探诊深度
0.758*
0.748*
0.489*
0.125
0.829*
出血指数
0.774*
0.731*
0.588*
0.122
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0.796*
菌斑指数
0.701*
0.717*
0.454*
0.150
0.709*
龈沟液量
0.925*
0.833*
0.626*
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-0.067
0.822*
n
98
100
89
89
84
注：*P<0.001，**P<0.05，EA-s：细胞外弹性蛋白酶；EA-p：细胞内弹性蛋白酶；PMN：中性多形核白细胞讨论
GCF中的EA-s总量、EA-p总量和PMN数目之间均呈高度正相关，这首次直接证实了以往的理论推测，即EA水平与PMN数目一致、EA-p可代表取样当时牙周袋内的PMN数量。Cimasoni和Giannopolou[7]曾建议在对溶酶体源的酶进行诊断性研究时，应考虑PMN数量的影响，但迄今研究极少，这主要是由于普通滤纸条上吸附的PMN极难洗提下来[8]，难以同时研究一份GCF样本中酶水平和PMN数目间的关系。本研究则表明用EA-p总量间接反映PMN的数目不失为一种进行这类研究的可行方法。曹剑宁等[9]曾用相似的取样方法，证明GCF中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)水平与PMN数目一致。作者等[6]也已证实未经治疗的牙周袋内第 2天的PMN数目可代表第1天的。但EA-s与EA-p的相关程度略强于各自与PMN数目的直接相关程度，提示对同一份样本内的不同成分进行比较的可靠性更大。GCF中EA-s和EA-p都与PMN数目呈高度正相关，也提示在只能测定EA总水平的情况下，可以用EA作为GCF中PMN的标志物。
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EA 只有在PMN受到激活或破坏时才会被释放，其内源性抑制剂主要是血清来源，在炎症情况下会渗出到组织中。组织中PMN释放的EA在进入GCF以前，大多数会被其抑制剂中和而被清除掉，而GCF中的EA-s和PMN的高度正相关则提示，GCF中EA-s主要是由牙周袋内的PMN产生，组织中的PMN释放的EA很少参与GCF中EA-s的组成。
GCF中EA水平和临床指标间的关系报道很少。本组结果与Cox和Eley[10]的结论相似，这可能因为都是对同一患者治疗前后的样本进行共同分析，而使临床指标的分布范围更广；与Gustafsson等[3]的观点仍略有差别，后者认为EA总水平和EA-s水平与PLI和牙龈指数无明显相关，这可能是后者仅对治疗前的炎症牙位进行分析，临床指标的分布范围相对窄。我们对GCF中EA-s和EA-p与临床指标的相关关系分开讨论，发现EA-p的浓度与各临床指标间无明显相关，以往的研究之所以认为EA浓度与临床指标的相关程度低于其总量与临床指标的相关程度[3,10]，可能与其中EA-p的影响有关。这也进一步提示，EA作为反映牙周组织破坏程度的敏感客观指标，EA-s的能力强于EA-p，建议今后观察GCF中EA水平变化时应测EA-s的水平。
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参考文献
1 Eley BM, Cox SW. A 2-year longitudinal study of elastase in human gingival crevicular fluid and periodontal attachment loss. J Clin Periodontol，1996，23:681-692.
2 Palcanis KG, Larjava IK, Wells BR, et al. Elastase as an indicator of periodontal disease progression. J Periodontol ，1992，63:237-242.
3 Gustafsson A, Asman B, Bergstrom K. Altered relation between granulocyte elastase and alpha- 2-macroglobulin in gingival crevicular fluid from sites with periodontal destruction. J Clin Periodontol， 1994，21:17-21.
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4 Jin LJ, Soder PO, Asman B, et al. Grannulocyte elastase in gingival crevicular fluid: improved monitoring of the site-specific response to treatment in patients with destructive periodontitis. J Clin Periodontol ，1995，22:240-246.
5 周爽英, 曹采方, 陈智滨 ，等. 牙周炎基础治疗后龈沟液中碱性磷酸酶的纵向观察. 现代口腔医学杂志，1997， 11(专辑): 32-34.
6 和璐, 曹采方, 沙月琴 ，等. 龈沟液中性多形核白细胞数目的重复性研究. 口腔医学纵横, 1998, 14: 92-94.
7 Cimasoni G, Giannopolou C. Can crevicular component analysis assist in diagnosis and monitoring periodontal breakdown? In: Guggenheim B, ed. Periodontology today. Zurich: Karger, Basal, 1988. 260-270.
, http://www.100md.com
8 Andersen E， Cimasoni G. A rapid and simple method for counting crevicular polymorphonuclear leucocytes. J Clin Periodontol ，1993，20: 651-655.
9 曹剑宁, 曹采方, 张雪玲 ，等. 龈沟白细胞数及龈沟液髓过氧化物酶水平与临床指标的相关性. 北京医科大学学报, 1989，21: 45-46.
10 Cox SW, Eley BM . Cathepsin B/L- , elastase- ,tryptase-, trypsin- and dipeptidyl peptidase IV-like activities in gingival crevicular fluid.A comparison of levels before and after basic periodontal treatment of chronic periodontitis patients. J Clin Periodontol ，1992， 19: 333-339.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-07-21), http://www.100md.com