快速进展性牙周炎患者的白细胞趋化功能
作者：刘荣坤 曹采方
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：中性白细胞；趋化性，白细胞；快速进展性牙周炎
中华口腔医学杂志980605 【摘要】 目的 了解我国快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞是否存在趋化功能异常。方法 选择细菌源性的趋化肽和宿主源性的趋化因子(白细胞介素8)作为趋化剂，采用微孔滤膜法(改良的Boyden Chamber法)检测16例快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞的趋化功能，并与14名年龄相当的健康个体进行对照。结果 快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞对细菌源性的趋化肽和白细胞介素8的趋化反应与健康组差异无显著性。结论 中性多形核白细胞趋化功能的异常可能并不是快速进展性牙周炎的主要易感因素。
Chemotactic response of polymorphonuclear neutrophil to FMLP and IL-8 in rapidly progressive periodontitis patients
, 百拇医药
Liu Rongkun, Cao Caifang. School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective It has been reported that 48%～85% of rapidly progressive periodontitis (RPP) are associated with a defect in polymorphonuclear neutrophil (PMN) chemotactic function. However, some reports failed to detect any defect in PMN chemotaxis in RPP patients. Further, the influence of race on neutrophil function has been suggested. The purpose of the present study was to determine the PMN chemotactic function in Chinese RPP patients. Methods Neutrophils were obtained from heparinized peripheral blood of 16 RPP and 14 periodontally healthy control subjects matched for age and sex. Cells were isolated by Percoll discontinuous density gradient centrifugation. Chemotaxis was evaluated using modified Boyden chamber. (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, FMLP) (10-8mol/L) and IL-8 (100μg/L) which is a more specific neutrophil chemokines were used in this study. The results were determined by staining the filters followed by visual counting under microscopy at 600×. Data was analyzed using the Students' t test and the value of RPP was compared with that of control subjects(>mean±2s or
【Key words】 Neutrophils Chemotaxis，leukocyte Rapidly progressive periodontitis
细菌是牙周炎的始发因素。而个体对牙周炎的易感性及牙周组织破坏的严重程度则受宿主反应的影响。快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)以其迅速发展的附着丧失和牙槽骨吸收为特点。有研究显示，中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的趋化功能减弱或缺陷是RPP较为重要的易感因素[1]。然而，也有报道表明RPP并不存在PMN的趋化功能缺陷[2，3]。牙周炎存在种族差异，我国RPP患者的PMN趋化功能尚未见报道。过去对PMN趋化功能的研究集中于传统的趋化物质即细菌源性的趋化肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, FMLP)，而另一种近年来才被发现的、对PMN有相对选择性的趋化因子——白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)与RPP患者 PMN的关系尚未见报道。我们选择16例RPP患者，对其外周血中PMN对FMLP和IL-8的趋化反应进行检测。
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材料与方法
1.病例选择：参考Page 1983年提出的诊断标准，选择16例RPP患者，男6例，女10例，年龄21～36岁，平均28岁。所有患者均为初诊病例，无牙周治疗史,口内无修复体,无明显咬创伤及错畸形,无其它明显的局部刺激因素,并且口内存留牙不少于24颗,有附着丧失的累及牙≥20颗,至少有一个位点的牙周袋≥6mm的牙数不少于16颗。选择全身及牙周健康的14名个体为对照组，女6名，男8名，年龄19～35岁，平均31岁。所有受检者均为汉族，无系统性疾病，近1个月内未服用抗生素及对白细胞有明显毒性的药物或免疫抑制剂，无吸烟史，女性未妊娠且为非月经期。
2.PMN的分离与纯化：取空腹前臂静脉血2ml，加于淋巴细胞分层液上，离心20min(1 800 r/min)，取多形核白细胞层，加一定量的Gey＇s液以裂解红细胞，用Hanks液洗细胞2次，用MEM培养液将PMN制成1×103/L的细胞悬液，备用。取部分PMN悬液做锥虫蓝染色，活细胞率达98%以上。
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3.微孔滤膜法检测PMN趋化功能：采用有12孔趋化小室的趋化板(美国Neuro Probe公司)，下室分别加趋化剂: FMLP (10-8mol/ L，Sigma公司)、IL-8(100μg/L，北京医科大学分子免疫室提供)和PBS(阴性对照)；上室加PMN细胞悬液(1×106/L)，上、下室之间隔一聚碳酸酯滤膜(polycarbonate membranes, 25 mm×80 mm，孔径3μm，PVP Free,美国Poretics公司)。趋化剂浓度及PMN细胞悬液浓度均为预实验确认的最佳浓度。所有样本均设复孔。置趋化板于5%CO2、37℃下孵育45 min。取出滤膜，刮去上层细胞，甲醇固定10 min，Giemsa染色30 min，封片，光学显微镜下镜检。每孔随机取5个视野，高倍镜(×600)下计数滤膜下侧面的细胞数，取均值。实验孔细胞数减去阴性孔细胞数，即为该种趋化剂在该趋化浓度下通过滤膜的PMN数。细胞的趋化功能以每高倍视野(high power field, HPF)下的细胞数(PMN/HPF)表示。
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4.结果判定：以两种方式进行判定。①两组均数的比较，差异进行t检验；②以健康组通过滤膜的PMN均数±2倍标准差(
±2s)作为正常范围，患者的PMN数超过此范围即为异常。
结果
1. RPP组和健康对照组的PMN均数进行比较，差异无显著性(P>0.05)，详见表1。
2. 以健康组PMN均数±2倍标准差作为正常范围，RPP组所有个体通过滤膜的PMN数均在此范围内(表2)。
表1 RPP与健康组PMN对FMLP和
IL-8趋化能力的比较(±s，PMN/HPF) 组别
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FMLP(10-8mol/L)
IL-8(100μg/L)
健康对照组(n=14)
19.19±4.25
49.34±7.13
RPP组(n=16)
17.69±3.79
48.85±7.24
注：RPP：快速进展性牙周炎；PMN：中性多形核白细胞；FMLP：细菌源性的趋化肽；IL-8：白细胞介素8；HPF：高倍视野表2 健康组的正常范围(±2s)
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及RPP组的最大和最小值(PMN/HPF) 组别
FMLP(10-8mol/L)
IL-8(100μg/L)
健康组
19.19±8.50
49.34±14.26
RPP组
10.05～19.60
34.40～60.80
注：RPP：快速进展性牙周炎；PMN：中性多形核白细胞；HPF：高倍视野；FMLP：细菌源性趋化肽；IL-8：白细胞介素8
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3.两种方式判定的结果均显示：RPP外周血的PMN对FMLP和IL-8的趋化反应与健康对照组差异无显著性，即PMN无趋化功能的异常。
讨论
有关RPP是否存在PMN趋化功能缺陷，不同的实验室其结果不一。Page等[1]的研究显示，约48%～85%的RPP患者存在PMN的趋化功能缺陷。而另一些学者则报道PMN的趋化功能与健康对照组无差异[4，5]。本组结果也表明，16例RPP患者均无趋化反应异常。
实验结果的不一致可由多方面因素引起。首先，趋化功能检测方法的选择即可影响实验结果。在牙周炎的研究中，用以检测白细胞趋化功能的方法主要有微孔滤膜法(Modified Boyden Chamber)[1，4]、琼脂糖法[2，5]和龈沟趋化法[6]。龈沟趋化法是体内法,应该是一种最理想的方法,但由于实验条件不易控制,未被广泛采用。根据Harris提出的作为一种理想的趋化检测方法所应具备的6个特点[7]，滤膜法应较琼脂糖法敏感。Kinane等[2，8]采用两种方法检测同一患者群的同一指标，发现滤膜法检出有PMN趋化反应增强的患者，用琼脂糖法却未能检出。已往报道PMN趋化异常的学者，多采用滤膜法，而阴性结果者似以琼脂糖法为多。本实验虽采用了滤膜法,但并未发现PMN的趋化功能异常，仍支持Katsuragi等[4]的研究结果。其次，趋化因子的种类也可能影响实验结果。Pedersen[9]检测了青少年牙周炎、慢性成人牙周炎和健康者的PMN趋化功能，用FMLP作趋化剂时，青少年牙周炎组的趋化功能较其他组增强；在改用酪蛋白和细菌作为趋化剂后，三组间的PMN趋化功能无任何差异。我们采用了细菌源性趋化因子的代表——FMLP和宿主源性趋化因子的代表——IL-8作趋化剂，结果均无趋化异常。影响实验结果的另一个重要原因是RPP的诊断标准。RPP的诊断标准至今仍不够明确，Page提出部分患者可有全身症状，而本组实验和其他一些学者的研究则选择了全身健康的RPP患者[5]。研究还表明,早发性牙周炎患者是否有PMN的趋化功能异常,与种族有关[10]。
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综上所述，尽管本实验从方法选择、实验设计等方面尽量排除了可能影响实验结果的因素，但仍未发现PMN趋化功能异常的RPP患者，这提示PMN的趋化功能异常可能并不构成我国快速进展性牙周炎的主要易感因素。PMN是否还以其他方式参与快速进展性牙周炎的炎症反应还有待进一步研究。
高等院校博士学科点专项科研基金资助课题 (9501020)
参考文献
1 Page RC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
2 Kinane DF, Cullen CF, Johnston FA, et al. Neutrophil chemotactic behaviour in patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅱ). Assessment using the under agarose technique. J Clin Periodontol, 1989, 16: 247-251.
, 百拇医药
3 Michel JF, Gagnot G, Mouynet P, et al. Chimiotaxy of PMN cells from patients with early-onset periodontitis. J Dent Res, 1992, 72: 712.
4 Katsuragi Y, Matsuda N, Nakamura M, et al. Neutrophil functions in patients with severe periodontal disease. Adv Dent Res, 1988, 2: 359-363.
5 Mouynet P, Delamaire M, le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis. (Ⅰ). Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
, http://www.100md.com
6 谢华,曹采方,郑麟蕃.牙周组织局部中性多形核白细胞的趋化功能及吞噬功能.中华口腔科杂志，1986，21：343-345.
7 Bignold LP. Measurement of chemotaxis of polymorphonuc lear leukocytes in vitro. The problems of the control of gradients of chemotactic factors, of the control of the cells and of the separation of chemotaxis from chemokinesis. J Immunol Methods, 1988, 108: 1-18.
8 Kinane DF, Cullen CF, Johnston F, et al. Neutrophil chemotactic behaviour in patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅰ). Leading front analysis in Boyden chambers. J Clin Periodontol, 1989, 16: 242-246.
, 百拇医药
9 Pedersen MM. Comparison of two methods for measurement of chemotaxis of neutrophil polymorphonuclear leukocytes in vitro. Acta Path Microbiol Scand [Immunol C], 1987, 95: 189-193.
10 Schenkein HA, Best AM, Gunsolley JC. Influence of race and periodontal clinic status on neutrophil chemotactic response. J Periodontal Res, 1991, 26: 272-275.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-07-10), 百拇医药
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：中性白细胞；趋化性，白细胞；快速进展性牙周炎
中华口腔医学杂志980605 【摘要】 目的 了解我国快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞是否存在趋化功能异常。方法 选择细菌源性的趋化肽和宿主源性的趋化因子(白细胞介素8)作为趋化剂，采用微孔滤膜法(改良的Boyden Chamber法)检测16例快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞的趋化功能，并与14名年龄相当的健康个体进行对照。结果 快速进展性牙周炎患者的外周血中性多形核白细胞对细菌源性的趋化肽和白细胞介素8的趋化反应与健康组差异无显著性。结论 中性多形核白细胞趋化功能的异常可能并不是快速进展性牙周炎的主要易感因素。
Chemotactic response of polymorphonuclear neutrophil to FMLP and IL-8 in rapidly progressive periodontitis patients
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Liu Rongkun, Cao Caifang. School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081
【Abstract】 Objective It has been reported that 48%～85% of rapidly progressive periodontitis (RPP) are associated with a defect in polymorphonuclear neutrophil (PMN) chemotactic function. However, some reports failed to detect any defect in PMN chemotaxis in RPP patients. Further, the influence of race on neutrophil function has been suggested. The purpose of the present study was to determine the PMN chemotactic function in Chinese RPP patients. Methods Neutrophils were obtained from heparinized peripheral blood of 16 RPP and 14 periodontally healthy control subjects matched for age and sex. Cells were isolated by Percoll discontinuous density gradient centrifugation. Chemotaxis was evaluated using modified Boyden chamber. (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, FMLP) (10-8mol/L) and IL-8 (100μg/L) which is a more specific neutrophil chemokines were used in this study. The results were determined by staining the filters followed by visual counting under microscopy at 600×. Data was analyzed using the Students' t test and the value of RPP was compared with that of control subjects(>mean±2s or
【Key words】 Neutrophils Chemotaxis，leukocyte Rapidly progressive periodontitis
细菌是牙周炎的始发因素。而个体对牙周炎的易感性及牙周组织破坏的严重程度则受宿主反应的影响。快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis, RPP)以其迅速发展的附着丧失和牙槽骨吸收为特点。有研究显示，中性多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的趋化功能减弱或缺陷是RPP较为重要的易感因素[1]。然而，也有报道表明RPP并不存在PMN的趋化功能缺陷[2，3]。牙周炎存在种族差异，我国RPP患者的PMN趋化功能尚未见报道。过去对PMN趋化功能的研究集中于传统的趋化物质即细菌源性的趋化肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, FMLP)，而另一种近年来才被发现的、对PMN有相对选择性的趋化因子——白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)与RPP患者 PMN的关系尚未见报道。我们选择16例RPP患者，对其外周血中PMN对FMLP和IL-8的趋化反应进行检测。
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材料与方法
1.病例选择：参考Page 1983年提出的诊断标准，选择16例RPP患者，男6例，女10例，年龄21～36岁，平均28岁。所有患者均为初诊病例，无牙周治疗史,口内无修复体,无明显咬创伤及错畸形,无其它明显的局部刺激因素,并且口内存留牙不少于24颗,有附着丧失的累及牙≥20颗,至少有一个位点的牙周袋≥6mm的牙数不少于16颗。选择全身及牙周健康的14名个体为对照组，女6名，男8名，年龄19～35岁，平均31岁。所有受检者均为汉族，无系统性疾病，近1个月内未服用抗生素及对白细胞有明显毒性的药物或免疫抑制剂，无吸烟史，女性未妊娠且为非月经期。
2.PMN的分离与纯化：取空腹前臂静脉血2ml，加于淋巴细胞分层液上，离心20min(1 800 r/min)，取多形核白细胞层，加一定量的Gey＇s液以裂解红细胞，用Hanks液洗细胞2次，用MEM培养液将PMN制成1×103/L的细胞悬液，备用。取部分PMN悬液做锥虫蓝染色，活细胞率达98%以上。
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3.微孔滤膜法检测PMN趋化功能：采用有12孔趋化小室的趋化板(美国Neuro Probe公司)，下室分别加趋化剂: FMLP (10-8mol/ L，Sigma公司)、IL-8(100μg/L，北京医科大学分子免疫室提供)和PBS(阴性对照)；上室加PMN细胞悬液(1×106/L)，上、下室之间隔一聚碳酸酯滤膜(polycarbonate membranes, 25 mm×80 mm，孔径3μm，PVP Free,美国Poretics公司)。趋化剂浓度及PMN细胞悬液浓度均为预实验确认的最佳浓度。所有样本均设复孔。置趋化板于5%CO2、37℃下孵育45 min。取出滤膜，刮去上层细胞，甲醇固定10 min，Giemsa染色30 min，封片，光学显微镜下镜检。每孔随机取5个视野，高倍镜(×600)下计数滤膜下侧面的细胞数，取均值。实验孔细胞数减去阴性孔细胞数，即为该种趋化剂在该趋化浓度下通过滤膜的PMN数。细胞的趋化功能以每高倍视野(high power field, HPF)下的细胞数(PMN/HPF)表示。
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4.结果判定：以两种方式进行判定。①两组均数的比较，差异进行t检验；②以健康组通过滤膜的PMN均数±2倍标准差(
±2s)作为正常范围，患者的PMN数超过此范围即为异常。结果
1. RPP组和健康对照组的PMN均数进行比较，差异无显著性(P>0.05)，详见表1。
2. 以健康组PMN均数±2倍标准差作为正常范围，RPP组所有个体通过滤膜的PMN数均在此范围内(表2)。
表1 RPP与健康组PMN对FMLP和
IL-8趋化能力的比较(
±s，PMN/HPF) 组别, http://www.100md.com
FMLP(10-8mol/L)
IL-8(100μg/L)
健康对照组(n=14)
19.19±4.25
49.34±7.13
RPP组(n=16)
17.69±3.79
48.85±7.24
注：RPP：快速进展性牙周炎；PMN：中性多形核白细胞；FMLP：细菌源性的趋化肽；IL-8：白细胞介素8；HPF：高倍视野表2 健康组的正常范围(
±2s), http://www.100md.com
及RPP组的最大和最小值(PMN/HPF) 组别
FMLP(10-8mol/L)
IL-8(100μg/L)
健康组
19.19±8.50
49.34±14.26
RPP组
10.05～19.60
34.40～60.80
注：RPP：快速进展性牙周炎；PMN：中性多形核白细胞；HPF：高倍视野；FMLP：细菌源性趋化肽；IL-8：白细胞介素8
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3.两种方式判定的结果均显示：RPP外周血的PMN对FMLP和IL-8的趋化反应与健康对照组差异无显著性，即PMN无趋化功能的异常。
讨论
有关RPP是否存在PMN趋化功能缺陷，不同的实验室其结果不一。Page等[1]的研究显示，约48%～85%的RPP患者存在PMN的趋化功能缺陷。而另一些学者则报道PMN的趋化功能与健康对照组无差异[4，5]。本组结果也表明，16例RPP患者均无趋化反应异常。
实验结果的不一致可由多方面因素引起。首先，趋化功能检测方法的选择即可影响实验结果。在牙周炎的研究中，用以检测白细胞趋化功能的方法主要有微孔滤膜法(Modified Boyden Chamber)[1，4]、琼脂糖法[2，5]和龈沟趋化法[6]。龈沟趋化法是体内法,应该是一种最理想的方法,但由于实验条件不易控制,未被广泛采用。根据Harris提出的作为一种理想的趋化检测方法所应具备的6个特点[7]，滤膜法应较琼脂糖法敏感。Kinane等[2，8]采用两种方法检测同一患者群的同一指标，发现滤膜法检出有PMN趋化反应增强的患者，用琼脂糖法却未能检出。已往报道PMN趋化异常的学者，多采用滤膜法，而阴性结果者似以琼脂糖法为多。本实验虽采用了滤膜法,但并未发现PMN的趋化功能异常，仍支持Katsuragi等[4]的研究结果。其次，趋化因子的种类也可能影响实验结果。Pedersen[9]检测了青少年牙周炎、慢性成人牙周炎和健康者的PMN趋化功能，用FMLP作趋化剂时，青少年牙周炎组的趋化功能较其他组增强；在改用酪蛋白和细菌作为趋化剂后，三组间的PMN趋化功能无任何差异。我们采用了细菌源性趋化因子的代表——FMLP和宿主源性趋化因子的代表——IL-8作趋化剂，结果均无趋化异常。影响实验结果的另一个重要原因是RPP的诊断标准。RPP的诊断标准至今仍不够明确，Page提出部分患者可有全身症状，而本组实验和其他一些学者的研究则选择了全身健康的RPP患者[5]。研究还表明,早发性牙周炎患者是否有PMN的趋化功能异常,与种族有关[10]。
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综上所述，尽管本实验从方法选择、实验设计等方面尽量排除了可能影响实验结果的因素，但仍未发现PMN趋化功能异常的RPP患者，这提示PMN的趋化功能异常可能并不构成我国快速进展性牙周炎的主要易感因素。PMN是否还以其他方式参与快速进展性牙周炎的炎症反应还有待进一步研究。
高等院校博士学科点专项科研基金资助课题 (9501020)
参考文献
1 Page RC, Sims TJ, Geissler F, et al. Defective neutrophil and monocyte motility in patients with early onset periodontitis. Infect Immun, 1985, 47: 169-175.
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3 Michel JF, Gagnot G, Mouynet P, et al. Chimiotaxy of PMN cells from patients with early-onset periodontitis. J Dent Res, 1992, 72: 712.
4 Katsuragi Y, Matsuda N, Nakamura M, et al. Neutrophil functions in patients with severe periodontal disease. Adv Dent Res, 1988, 2: 359-363.
5 Mouynet P, Delamaire M, le Goff MC, et al. Ex vivo studies of polymorphonuclear neutrophils from patients with early-onset forms of periodontitis. (Ⅰ). Chemotactic assessment using the under agarose method. J Clin Periodontol, 1994, 21: 177-183.
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6 谢华,曹采方,郑麟蕃.牙周组织局部中性多形核白细胞的趋化功能及吞噬功能.中华口腔科杂志，1986，21：343-345.
7 Bignold LP. Measurement of chemotaxis of polymorphonuc lear leukocytes in vitro. The problems of the control of gradients of chemotactic factors, of the control of the cells and of the separation of chemotaxis from chemokinesis. J Immunol Methods, 1988, 108: 1-18.
8 Kinane DF, Cullen CF, Johnston F, et al. Neutrophil chemotactic behaviour in patients with early-onset forms of periodontitis (Ⅰ). Leading front analysis in Boyden chambers. J Clin Periodontol, 1989, 16: 242-246.
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9 Pedersen MM. Comparison of two methods for measurement of chemotaxis of neutrophil polymorphonuclear leukocytes in vitro. Acta Path Microbiol Scand [Immunol C], 1987, 95: 189-193.
10 Schenkein HA, Best AM, Gunsolley JC. Influence of race and periodontal clinic status on neutrophil chemotactic response. J Periodontal Res, 1991, 26: 272-275.
(收稿：1998-05-08 修回：1998-07-10), 百拇医药