逆转录-聚合酶链反应检测乳腺癌腋淋巴结微转移的研究
作者：张琴 张一楚 顾学范 张眉 林华 钱惠琴
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院普外科(张琴、张一楚、钱惠琴)，中心实验室(顾学范)，儿科研究所(张眉)，病理科(林华)
关键词：乳腺肿瘤；淋巴结；聚合酶链反应；癌基因蛋白类
中华外科杂志/980716 【摘要】 目的 探讨乳腺癌患者淋巴结内癌微转移灶的临床意义。 方法 采用逆转录-聚合酶链反应技术，扩增细胞骨架角蛋白19(CK19)，对15例乳腺癌患者的癌组织及其61个腋窝淋巴结进行检测。 结果 15例患者乳腺癌组织均有CK19 mRNA表达，5个正常淋巴结均无表达。61个淋巴结同时进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及组织学检查，7个淋巴结病理证实有转移，其CK19 mRNA亦都表达阳性；病理未发现转移的54个淋巴结中有12个CK19 mRNA表达阳性。 结论 CK19 RT-PCR方法检测乳腺癌腋淋巴结癌微转移比组织学检查敏感(χ2检验，P<0.01)，特别在筛选组织学检查淋巴结阴性而具有高度复发危险性的患者具有实用价值。
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The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction Zhang Qin,Zhang Yichu,Gu Xuefan,et al.Department of Surgery,Xinhua Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200092.
【Abstract】 Objecitve To detect tumor micrometastases in axillary lymph nodes of breast carcinoma so as to obtain more reliable information about nodes status and its clinical significance. Method The expression of CK19 mRNA was measured in 61 axillary lymph nodes (LNs) of 15 breast carcinomas by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Result CK19 mRNA expression was detected in all 15 breast carcinomas,but not in 5 control LNs.Of 61 axillary LNs analysed by HE staining and CK19 RT-PCR,7 LNs were found to have metastases by histological staining and CK19 RT-PCR.Of the remaining 54 axillary nodes, 12 were found to have metastases by using CK19 RT-PCR method. Conclusion The CK19 RT-PCR method is more sensitive than histologial study for the detection of micrometastases in LNs(P<0.01).This new method is of value in differentiating breast cancer patients at high risk for relapse from those with negative lymph node.
, 百拇医药
【Key words】 Mammary neopusm Lymph nodes Polymerase chain reaction Oncogene proteins
乳腺癌患者腋淋巴结有无癌转移是最有价值的预后因素之一。常规病理组织学检查常低估转移，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术可提高淋巴结内癌微转移的检出率，发现病理检查不能发现的淋巴结内微转移灶[1～4]。我们以细胞角蛋白19(CK19)作为乳腺癌标志物，对15例乳腺癌患者的61个腋淋巴结进行了CK19 mRNA的检测，探索RT-PCR方法检测癌微转移灶的临床应用价值。
资料与方法
1.标本：乳腺癌组织和腋淋巴结标本采自我院1996年1月至1997年4月，15例行乳腺癌根治术的Ⅰ期乳腺癌患者。5枚正常淋巴结取自非肿瘤患者，作为阴性对照。每例标本分成两部分，一部分进行HE染色，另一部分进行RT-PCR。
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2.cDNA合成及PCR扩增：(1)RNA抽提：采用TRI-zol试剂盒。(2)引物设计及合成：CK19引物5′-CGAGCAGAACCGGAAGGATG和5′-AGGCTGCGGTAGGTGGCAAT,按照CK19 cDNA序列设计[5]：管家基因GAPDH的引物序列为5′-CCCATCACCATCTTCCAGG和5′-CATCACGCCACAG
TTTCCC[6]。(3)cDNA合成：逆转录反应体系为20 μl,42℃1小时后合成cDNA。(4)PCR反应：反应体系为50 μl，包括逆转录产物3 μl，寡核苷酸引物各为4 μl(12.5 pmol/μl),dNPT浓度为200 μmol/L，10×Buffer 4 μl,Taq DNA多聚酶1单位。扩增条件：CK19为94.0 ℃变性1分，56.5 ℃退火1分，72.0 ℃延伸1分；GAPDH为94.0 ℃变性1分，51.7 ℃退火1分，72.0 ℃延伸1分，均为40个循环。(5)限制性内切酶分析：将CK19 PCR产物进行Dde Ⅰ酶酶切分析，酶解产物在5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析。
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结果
1.CK19 mRNA在乳腺癌组织、正常淋巴结中的表达：15例进行CK19 RT-PCR检测的乳腺癌患者，癌组织均有CK19 mRNA表达；5枚正常淋巴结均无CK19 mRNA表达。RT-PCR扩增GAPDH基因，排除RNA降解。
2.组织学检查和CK19 RT-PCR检测腋淋巴结微转移的比较：本组患者的61个淋巴结中，7个经组织学证实有肿瘤浸润，54个无肿瘤浸润。应用CK19及GAPDH引物对乳腺癌患者的淋巴结进行RT-PCR检测，7个组织学检查发现有肿瘤转移的淋巴结出现了369 bp CK19产物；54个组织学检查阴性的淋巴结中12个经40次PCR循环后检测到CK19表达，表明这12个淋巴结中存在癌的微转移灶，但未能为常规组织学方法所检出。CK19 RT-PCR检测淋巴结微转移率达31.3 %，组织学检查为11.5 %，常规病理组织学检查与RT-PCR方法比较，后者敏感性提高19.6 %(附表)。两者差异有显著性意义(χ2检验，P<0.01)。
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附表 两种检测乳腺癌腋淋巴结微转移方法的比较 CK19 RT-PCR
淋巴结总数
组织学检查
(+)
(-)
阳性
19
7
12
阴性
42
0
42
, 百拇医药
3.CK19 扩增产物经DdeⅠ酶切鉴定：CK19 PCR扩增产物为369 bp,酶解后为208 bp和161 bp。 讨论
在乳腺癌的诊治、预后判断及术后处理方面，目前已不仅仅满足于现有的一些指标，而是需要有新的方法以检出常规组织学方法不能发现的淋巴结微转移灶，从而筛选出具有高度复发危险的患者，并予适当的辅助治疗，以提高治愈率。淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发、预后的判断及术后综合治疗措施的选择具有极其重要的指导意义。
RT-PCR是当前检测淋巴结中癌微转移灶较为敏感的方法，能检测出常规组织学方法不能发现的微转移灶。文献报道此方法的检出率达28 %[1，4]，且具有较高的特异性[5～7]。我们的研究结果：15例患者乳腺癌组织均有CK19 mRNA表达，5个正常淋巴结均无表达。RT-PCR检测乳腺癌淋巴结微转移的目标mRNA要求仅在乳腺癌组织表达而不在正常淋巴结表达。患者的61个淋巴结中，7个组织学检查转移灶阳性，其CK19 RT-PCR均为阳性。其余54个组织学检查阴性的淋巴结中，12个CK19 RT-PCR检测为阳性(31.1%)。表明CK19 RT-PCR能检测出组织学检查不能发现的癌微转移，提高淋巴结微转移的检出率。
, 百拇医药
CK19是一组织特异性基因，仅在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中表达，不在正常外周血细胞、骨髓细胞和淋巴结细胞表达，因此可以作为乳腺癌的标志物进行微转移灶的检测[2]。乳腺癌具有易发生血行转移的生物学特性。临床资料表明，乳腺癌患者初次就诊时，约半数以上患者已经发生血行转移，所以对于患者外周血、骨髓微转移灶的检出，同样具有重要意义。CK19 RT-PCR不但可用于淋巴结微转移的检测，还可用于外周血、骨髓微转移灶的检测，这有助于临床医师对乳腺癌患者的术后疗效作出正确的评估及制订正确的辅助治疗措施。
参考文献
1Noguchi S,Aihara T,Nakamori S,et al.The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse-transcriptase polymerase chain reaction.Cancer,1994,74:1595-1600.
, 百拇医药
2Datta YH,Adams PT,Drobyski WR,et al.Sensitive detectin of occult breast cancer by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.J Clin Oncol,1994,12:475-482.
3Mori M,Mimori K,Inoue H,et al.Detecion of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Cancer Res,1995,55:3417-3420.
4Schoenfeld A,Luqmani Y,Smith D,et al.Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction.Cancer Res,1994,54:2986-2990.
, 百拇医药
5Stasiak PC,Purkis PE,Leigh IM,et al.Keratin 19:predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins. J Invest Dermatol,1989,92:707-716.
6Arcari P,Martinelli R，Salvatore F.The complete sequence of a full length cDNA for human liver glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase:evidence for multiple mRNA species.Nucleic Acids Res,1984,12:9179-9189.
7Smith B,Selby P,Southgate J,et al.Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chian reaction.Lancet,1991,338:1227-1229.
8Mattano LAJR,Moss TJ,Emerson SG.Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by the reverse transcriptase polymerse chain reaction. Cancer Res,1992,52:4701-4705.
9Moreno JG,Croce CM,Fischer R,et al.Detection of hematogenous micrometastasis in patients with prostate cancer. Cancer Res,1992,52:6100-6112., 百拇医药
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院普外科(张琴、张一楚、钱惠琴)，中心实验室(顾学范)，儿科研究所(张眉)，病理科(林华)
关键词：乳腺肿瘤；淋巴结；聚合酶链反应；癌基因蛋白类
中华外科杂志/980716 【摘要】 目的 探讨乳腺癌患者淋巴结内癌微转移灶的临床意义。 方法 采用逆转录-聚合酶链反应技术，扩增细胞骨架角蛋白19(CK19)，对15例乳腺癌患者的癌组织及其61个腋窝淋巴结进行检测。 结果 15例患者乳腺癌组织均有CK19 mRNA表达，5个正常淋巴结均无表达。61个淋巴结同时进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及组织学检查，7个淋巴结病理证实有转移，其CK19 mRNA亦都表达阳性；病理未发现转移的54个淋巴结中有12个CK19 mRNA表达阳性。 结论 CK19 RT-PCR方法检测乳腺癌腋淋巴结癌微转移比组织学检查敏感(χ2检验，P<0.01)，特别在筛选组织学检查淋巴结阴性而具有高度复发危险性的患者具有实用价值。
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The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction Zhang Qin,Zhang Yichu,Gu Xuefan,et al.Department of Surgery,Xinhua Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200092.
【Abstract】 Objecitve To detect tumor micrometastases in axillary lymph nodes of breast carcinoma so as to obtain more reliable information about nodes status and its clinical significance. Method The expression of CK19 mRNA was measured in 61 axillary lymph nodes (LNs) of 15 breast carcinomas by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Result CK19 mRNA expression was detected in all 15 breast carcinomas,but not in 5 control LNs.Of 61 axillary LNs analysed by HE staining and CK19 RT-PCR,7 LNs were found to have metastases by histological staining and CK19 RT-PCR.Of the remaining 54 axillary nodes, 12 were found to have metastases by using CK19 RT-PCR method. Conclusion The CK19 RT-PCR method is more sensitive than histologial study for the detection of micrometastases in LNs(P<0.01).This new method is of value in differentiating breast cancer patients at high risk for relapse from those with negative lymph node.
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乳腺癌患者腋淋巴结有无癌转移是最有价值的预后因素之一。常规病理组织学检查常低估转移，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术可提高淋巴结内癌微转移的检出率，发现病理检查不能发现的淋巴结内微转移灶[1～4]。我们以细胞角蛋白19(CK19)作为乳腺癌标志物，对15例乳腺癌患者的61个腋淋巴结进行了CK19 mRNA的检测，探索RT-PCR方法检测癌微转移灶的临床应用价值。
资料与方法
1.标本：乳腺癌组织和腋淋巴结标本采自我院1996年1月至1997年4月，15例行乳腺癌根治术的Ⅰ期乳腺癌患者。5枚正常淋巴结取自非肿瘤患者，作为阴性对照。每例标本分成两部分，一部分进行HE染色，另一部分进行RT-PCR。
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2.cDNA合成及PCR扩增：(1)RNA抽提：采用TRI-zol试剂盒。(2)引物设计及合成：CK19引物5′-CGAGCAGAACCGGAAGGATG和5′-AGGCTGCGGTAGGTGGCAAT,按照CK19 cDNA序列设计[5]：管家基因GAPDH的引物序列为5′-CCCATCACCATCTTCCAGG和5′-CATCACGCCACAG
TTTCCC[6]。(3)cDNA合成：逆转录反应体系为20 μl,42℃1小时后合成cDNA。(4)PCR反应：反应体系为50 μl，包括逆转录产物3 μl，寡核苷酸引物各为4 μl(12.5 pmol/μl),dNPT浓度为200 μmol/L，10×Buffer 4 μl,Taq DNA多聚酶1单位。扩增条件：CK19为94.0 ℃变性1分，56.5 ℃退火1分，72.0 ℃延伸1分；GAPDH为94.0 ℃变性1分，51.7 ℃退火1分，72.0 ℃延伸1分，均为40个循环。(5)限制性内切酶分析：将CK19 PCR产物进行Dde Ⅰ酶酶切分析，酶解产物在5 %聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析。
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结果
1.CK19 mRNA在乳腺癌组织、正常淋巴结中的表达：15例进行CK19 RT-PCR检测的乳腺癌患者，癌组织均有CK19 mRNA表达；5枚正常淋巴结均无CK19 mRNA表达。RT-PCR扩增GAPDH基因，排除RNA降解。
2.组织学检查和CK19 RT-PCR检测腋淋巴结微转移的比较：本组患者的61个淋巴结中，7个经组织学证实有肿瘤浸润，54个无肿瘤浸润。应用CK19及GAPDH引物对乳腺癌患者的淋巴结进行RT-PCR检测，7个组织学检查发现有肿瘤转移的淋巴结出现了369 bp CK19产物；54个组织学检查阴性的淋巴结中12个经40次PCR循环后检测到CK19表达，表明这12个淋巴结中存在癌的微转移灶，但未能为常规组织学方法所检出。CK19 RT-PCR检测淋巴结微转移率达31.3 %，组织学检查为11.5 %，常规病理组织学检查与RT-PCR方法比较，后者敏感性提高19.6 %(附表)。两者差异有显著性意义(χ2检验，P<0.01)。
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附表 两种检测乳腺癌腋淋巴结微转移方法的比较 CK19 RT-PCR
淋巴结总数
组织学检查
(+)
(-)
阳性
19
7
12
阴性
42
0
42
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3.CK19 扩增产物经DdeⅠ酶切鉴定：CK19 PCR扩增产物为369 bp,酶解后为208 bp和161 bp。 讨论
在乳腺癌的诊治、预后判断及术后处理方面，目前已不仅仅满足于现有的一些指标，而是需要有新的方法以检出常规组织学方法不能发现的淋巴结微转移灶，从而筛选出具有高度复发危险的患者，并予适当的辅助治疗，以提高治愈率。淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发、预后的判断及术后综合治疗措施的选择具有极其重要的指导意义。
RT-PCR是当前检测淋巴结中癌微转移灶较为敏感的方法，能检测出常规组织学方法不能发现的微转移灶。文献报道此方法的检出率达28 %[1，4]，且具有较高的特异性[5～7]。我们的研究结果：15例患者乳腺癌组织均有CK19 mRNA表达，5个正常淋巴结均无表达。RT-PCR检测乳腺癌淋巴结微转移的目标mRNA要求仅在乳腺癌组织表达而不在正常淋巴结表达。患者的61个淋巴结中，7个组织学检查转移灶阳性，其CK19 RT-PCR均为阳性。其余54个组织学检查阴性的淋巴结中，12个CK19 RT-PCR检测为阳性(31.1%)。表明CK19 RT-PCR能检测出组织学检查不能发现的癌微转移，提高淋巴结微转移的检出率。
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CK19是一组织特异性基因，仅在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中表达，不在正常外周血细胞、骨髓细胞和淋巴结细胞表达，因此可以作为乳腺癌的标志物进行微转移灶的检测[2]。乳腺癌具有易发生血行转移的生物学特性。临床资料表明，乳腺癌患者初次就诊时，约半数以上患者已经发生血行转移，所以对于患者外周血、骨髓微转移灶的检出，同样具有重要意义。CK19 RT-PCR不但可用于淋巴结微转移的检测，还可用于外周血、骨髓微转移灶的检测，这有助于临床医师对乳腺癌患者的术后疗效作出正确的评估及制订正确的辅助治疗措施。
参考文献
1Noguchi S,Aihara T,Nakamori S,et al.The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse-transcriptase polymerase chain reaction.Cancer,1994,74:1595-1600.
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5Stasiak PC,Purkis PE,Leigh IM,et al.Keratin 19:predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins. J Invest Dermatol,1989,92:707-716.
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8Mattano LAJR,Moss TJ,Emerson SG.Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by the reverse transcriptase polymerse chain reaction. Cancer Res,1992,52:4701-4705.
9Moreno JG,Croce CM,Fischer R,et al.Detection of hematogenous micrometastasis in patients with prostate cancer. Cancer Res,1992,52:6100-6112., 百拇医药