胰腺癌组织微卫星DNA不稳定与肿瘤临床特征的相关性研究
作者：李伟 王殿昌 李卫东 王秀琴 郝希山 战忠利 吴
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所[李伟、王殿昌、李卫东、战忠利(现在天津医科大学附属肿瘤医院，300070)、王秀琴、郝希山、吴]
关键词：
中华医学杂志980716 DNA中微卫星序列的不稳定(MI) 是发生在多种肿瘤细胞基因组中的分子事件之一[1]。我们选择消化道肿瘤尤其是胰腺癌相关基因附近的多态性位点，以PCR方法扩增肿瘤及非瘤组织细胞基因组中9个位点的微卫星DNA序列，并将电泳结果会同临床和随访资料综合分析，探讨肿瘤组织微卫星DNA不稳定与临床病理指标和疾病预后的关系。
一、对象与方法
1.对象：45例标本来自天津肿瘤医院1986～1995年胰腺癌患者存档石蜡标本。男∶女为2.21∶1，年龄37～72岁。胰腺导管腺癌42例，粘液腺癌为3例，胰头癌22例，胰体癌9例，胰尾癌2例，全胰癌12例。组织学高分化16例，中分化5例，低分化24例。45例患者中，4例有恶性肿瘤家族史，18例嗜烟酒。
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2.45例患者中获得完整随访者40例，有5例未随访到。
3.石蜡组织切片经镜下显微切割分离，提取肿瘤细胞及用于对照的非瘤组织细胞DNA，制备PCR模板[2]。
4.PCR反应：10 μl PCR 反应体系中加入3中制备的PCR模板2 μl，上、下游引物(research genetics inc. & sagon)各5 pmol/L，10×PCR缓冲液1 μl， 2.5 mmol/LMgCl2 1 μl，50～200 μmol/L 4×dNTPs，0.5U Taq DNA 聚合酶(PE)。经94℃50秒，50～62℃ 60秒，72℃ 60秒反应35个循环，72℃延伸5分钟，4℃保温。结果观察：PCR反应产物与6 μl加样缓冲液混合，变性后上样，经电泳、银染、观察结果。若肿瘤与非瘤组织相比出现等位基因条带的增多和大小的改变等记为MI。出现MI的病例经再次PCR扩增证实。
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5.统计学分析：采用SAS Version 6.02 统计学软件包及POMS Version 2.00 软件包，在VAX及IBM 586/100 计算机上完成，所有统计学数据分析均按α=0.05(双侧)水平进行假设检验，MI 与临床病理学指标的比较分别采用F及F′检验、列联表χ2检验、生存分析等。
二、结果
1.胰腺癌组织中的MI：29例标本经检测存在MI(64.4%)，6例标本在3个及以上位点存在MI，在2个位点出现MI的有12例，另11例仅在一个位点检测到MI。除此之外，我们观察到MI的发生存在位点特异性(图1)，在D18S46(28.6%)、D18S474(22.5%)明显频发，而在D9S176(14.3%)、D3S1234(12.5%)、D3S1481(14.6%)、D7S486(14.3%)和D3S1289(13.2%)位点MI的发生率相差不大，D3S587(10.2%)和D5S365(9.7%)两位点较少发生MI(图2)。
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2.生存分析：我们按MI(-)，仅一个位点存在MI[MI(+)*]、2个以上位点存在MI[MI(+)**]，将患者生存期分组，并调用SAS软件中的LIFETEST过程，以极限乘法计算生存分布函数，3组患者的50%生存期分别为：MI(-)：8.0
图1 部分标本在D3S129、D3S587、D9S176
位点的MI情况
图2 组织学低分化肿瘤多位点频发MI(6例)
个月；MI(+)*：3.7个月；MI(+)**：2.6个月(χ2=16.95，P<0.05)。
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三、讨论
频发的遗传改变是肿瘤细胞的特征，新近人们发现微卫星序列在多种肿瘤细胞中存在广泛的遗传不稳定性， MI的产生多被认为与基因组复制过程中的错配修复障碍有关，如在遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC)中的MI达86%[3]，Han等[4]指出胰腺癌中MI的发生率为67%， 但其仅观察9例患者，缺乏代表性。本组病例MI发生率(64.4%)属较高水平，但9个位点MI频率不尽相同，D18S46和D18S474的MI率超出其它位点一倍多，这种呈位点特异性的非随机化分布方式，为今后临床上对于某一肿瘤选择“敏感”位点进行筛查提供方便。
虽然胰腺癌的发病有明显的性别差异(男：女为2～4∶1)[5]，但本组患者MI的发生没有性别差异(χ2=2.88，P≥0.05 )。与其它肿瘤不同，本结果亦没有提示MI的发生与患者的年龄有关(F=0.181，P≥0.05)。吸烟和饮酒是已被肯定的胰腺癌诱发因素，有烟酒史较不嗜烟酒者，胰腺癌的发生率高2～2.5倍，年龄提前10～15年[5]，本研究中，我们将癌组织MI的情况与患者的烟酒史作了对比发现，二者呈相关关系(χ2=6.29，P<0.05)。
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该组病例MI的发生与胰腺原发癌灶的解剖部位无关(χ2=3.14，P≥0.05)，但其原发癌灶体积，存在组间的差异，MI(+)**组平均瘤灶径线最大(11.00±4.70 cm；F=12.75，P<0.05)，结合病理特征分析，发现MI(+)的胰腺癌(特别是有两个以上多态性位点出现MI者)组织学上多表现为低分化(χ2=6.73，P<0.05)，易于累及区域淋巴结(χ2=7.80，P<0.05)，并且多为远隔转移的病例(χ2=12.02，P<0.05)。另外，本组病例中3例粘液腺癌均为MI(+)。我们推论，表现出MI的胰腺癌分化程度较低，具有较强的侵袭转移能力。
还应提到，本组病例中有4例存在恶性肿瘤家族史的患者，均表现为MI(+)，目前，已经发现至少有6种遗传性疾病的发生与核苷酸重复序列的扩增有关[6]，这些疾病的微卫星序列的变化与肿瘤细胞中的MI是否具有相同的遗传学基础，有待于进一步探讨。
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本研究结果提示，存在MI的胰腺癌患者，特别是在染色体多个相关位点出现MI的患者，其术后生存期明显短于MI(-)者。因而，在本组病例中，MI是患者预后险恶的标志。
参考文献
1 Loeb LA. Microsatellite instability: marker of a mutator phenotype in cancer. Cancer Res, 1993, 54：5059-5061.
2 Aaltonen LA, Peltomki P, Leach FS, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science , 1993, 260：812-813.
3 Ionov Y，Peinodo MA, Malkhosyan S, et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature, 1993,365：207-208.
, 百拇医药
4 Han HJ, Yanagisawa A, Kato Y, et al. Genetic instability in pancreatic cancer and poorly differentiated type of gastric cancer. Cancer Res. 1993,53：5087-5089.
5 徐家裕，吴裕作. 临床胰腺病学，上海，上海科技出版社，1996，144-145.
6 Richards R, Sutherland GR. Simple repeat DNA is not relicated simply. Nature Genet, 1994,6：114-115.
本课题为国家“攀登计划”资助项目
(收稿：1997-08-13 修回：1998-03-13), 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所[李伟、王殿昌、李卫东、战忠利(现在天津医科大学附属肿瘤医院，300070)、王秀琴、郝希山、吴]
关键词：
中华医学杂志980716 DNA中微卫星序列的不稳定(MI) 是发生在多种肿瘤细胞基因组中的分子事件之一[1]。我们选择消化道肿瘤尤其是胰腺癌相关基因附近的多态性位点，以PCR方法扩增肿瘤及非瘤组织细胞基因组中9个位点的微卫星DNA序列，并将电泳结果会同临床和随访资料综合分析，探讨肿瘤组织微卫星DNA不稳定与临床病理指标和疾病预后的关系。
一、对象与方法
1.对象：45例标本来自天津肿瘤医院1986～1995年胰腺癌患者存档石蜡标本。男∶女为2.21∶1，年龄37～72岁。胰腺导管腺癌42例，粘液腺癌为3例，胰头癌22例，胰体癌9例，胰尾癌2例，全胰癌12例。组织学高分化16例，中分化5例，低分化24例。45例患者中，4例有恶性肿瘤家族史，18例嗜烟酒。
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2.45例患者中获得完整随访者40例，有5例未随访到。
3.石蜡组织切片经镜下显微切割分离，提取肿瘤细胞及用于对照的非瘤组织细胞DNA，制备PCR模板[2]。
4.PCR反应：10 μl PCR 反应体系中加入3中制备的PCR模板2 μl，上、下游引物(research genetics inc. & sagon)各5 pmol/L，10×PCR缓冲液1 μl， 2.5 mmol/LMgCl2 1 μl，50～200 μmol/L 4×dNTPs，0.5U Taq DNA 聚合酶(PE)。经94℃50秒，50～62℃ 60秒，72℃ 60秒反应35个循环，72℃延伸5分钟，4℃保温。结果观察：PCR反应产物与6 μl加样缓冲液混合，变性后上样，经电泳、银染、观察结果。若肿瘤与非瘤组织相比出现等位基因条带的增多和大小的改变等记为MI。出现MI的病例经再次PCR扩增证实。
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5.统计学分析：采用SAS Version 6.02 统计学软件包及POMS Version 2.00 软件包，在VAX及IBM 586/100 计算机上完成，所有统计学数据分析均按α=0.05(双侧)水平进行假设检验，MI 与临床病理学指标的比较分别采用F及F′检验、列联表χ2检验、生存分析等。
二、结果
1.胰腺癌组织中的MI：29例标本经检测存在MI(64.4%)，6例标本在3个及以上位点存在MI，在2个位点出现MI的有12例，另11例仅在一个位点检测到MI。除此之外，我们观察到MI的发生存在位点特异性(图1)，在D18S46(28.6%)、D18S474(22.5%)明显频发，而在D9S176(14.3%)、D3S1234(12.5%)、D3S1481(14.6%)、D7S486(14.3%)和D3S1289(13.2%)位点MI的发生率相差不大，D3S587(10.2%)和D5S365(9.7%)两位点较少发生MI(图2)。
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2.生存分析：我们按MI(-)，仅一个位点存在MI[MI(+)*]、2个以上位点存在MI[MI(+)**]，将患者生存期分组，并调用SAS软件中的LIFETEST过程，以极限乘法计算生存分布函数，3组患者的50%生存期分别为：MI(-)：8.0
图1 部分标本在D3S129、D3S587、D9S176
位点的MI情况
图2 组织学低分化肿瘤多位点频发MI(6例)
个月；MI(+)*：3.7个月；MI(+)**：2.6个月(χ2=16.95，P<0.05)。
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三、讨论
频发的遗传改变是肿瘤细胞的特征，新近人们发现微卫星序列在多种肿瘤细胞中存在广泛的遗传不稳定性， MI的产生多被认为与基因组复制过程中的错配修复障碍有关，如在遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC)中的MI达86%[3]，Han等[4]指出胰腺癌中MI的发生率为67%， 但其仅观察9例患者，缺乏代表性。本组病例MI发生率(64.4%)属较高水平，但9个位点MI频率不尽相同，D18S46和D18S474的MI率超出其它位点一倍多，这种呈位点特异性的非随机化分布方式，为今后临床上对于某一肿瘤选择“敏感”位点进行筛查提供方便。
虽然胰腺癌的发病有明显的性别差异(男：女为2～4∶1)[5]，但本组患者MI的发生没有性别差异(χ2=2.88，P≥0.05 )。与其它肿瘤不同，本结果亦没有提示MI的发生与患者的年龄有关(F=0.181，P≥0.05)。吸烟和饮酒是已被肯定的胰腺癌诱发因素，有烟酒史较不嗜烟酒者，胰腺癌的发生率高2～2.5倍，年龄提前10～15年[5]，本研究中，我们将癌组织MI的情况与患者的烟酒史作了对比发现，二者呈相关关系(χ2=6.29，P<0.05)。
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该组病例MI的发生与胰腺原发癌灶的解剖部位无关(χ2=3.14，P≥0.05)，但其原发癌灶体积，存在组间的差异，MI(+)**组平均瘤灶径线最大(11.00±4.70 cm；F=12.75，P<0.05)，结合病理特征分析，发现MI(+)的胰腺癌(特别是有两个以上多态性位点出现MI者)组织学上多表现为低分化(χ2=6.73，P<0.05)，易于累及区域淋巴结(χ2=7.80，P<0.05)，并且多为远隔转移的病例(χ2=12.02，P<0.05)。另外，本组病例中3例粘液腺癌均为MI(+)。我们推论，表现出MI的胰腺癌分化程度较低，具有较强的侵袭转移能力。
还应提到，本组病例中有4例存在恶性肿瘤家族史的患者，均表现为MI(+)，目前，已经发现至少有6种遗传性疾病的发生与核苷酸重复序列的扩增有关[6]，这些疾病的微卫星序列的变化与肿瘤细胞中的MI是否具有相同的遗传学基础，有待于进一步探讨。
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本研究结果提示，存在MI的胰腺癌患者，特别是在染色体多个相关位点出现MI的患者，其术后生存期明显短于MI(-)者。因而，在本组病例中，MI是患者预后险恶的标志。
参考文献
1 Loeb LA. Microsatellite instability: marker of a mutator phenotype in cancer. Cancer Res, 1993, 54：5059-5061.
2 Aaltonen LA, Peltomki P, Leach FS, et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science , 1993, 260：812-813.
3 Ionov Y，Peinodo MA, Malkhosyan S, et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature, 1993,365：207-208.
, 百拇医药
4 Han HJ, Yanagisawa A, Kato Y, et al. Genetic instability in pancreatic cancer and poorly differentiated type of gastric cancer. Cancer Res. 1993,53：5087-5089.
5 徐家裕，吴裕作. 临床胰腺病学，上海，上海科技出版社，1996，144-145.
6 Richards R, Sutherland GR. Simple repeat DNA is not relicated simply. Nature Genet, 1994,6：114-115.
本课题为国家“攀登计划”资助项目
(收稿：1997-08-13 修回：1998-03-13), 百拇医药