嘌呤能P2z受体介导白血病细胞凋亡的研究
作者：彭黎明 CJ Bradely JS Wiley
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院医学检验专业(彭黎明)；澳大利亚墨尔本大学Austin医院血液科(CJ Bradely, JS Wiley)
关键词：受体，嘌呤能P2z；白血病；脱噬作用
中华医学杂志980709 【摘要】 目的 探讨嘌呤能P2z受体在介导慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡中的作用。方法 将表达P2z受体[P2z(+)]与不含P2z受体[P2z(-)]两组CLL细胞分别同1.0 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)体外培养8小时，以电镜、DNA凝胶电泳和定量DNA 3′-末端的TdT法检测细胞凋亡；并对ATP、BzATP、2MeSATP、ATP-γS与其他核苷的诱导及OxATP、KN-62的抑制效应做定量研究。结果 (1)P2z(+)细胞能在ATP诱导下呈现典型的细胞凋亡形态和DNA梯状条带；(2)不同的P2z受体激活剂可通过P2z受体诱导细胞凋亡并产生不同量的DNA降解片段，诱导能力的强弱顺序是BzATP>ATP>2MeSATP，而ATP-γS或其他核苷几乎无诱导能力；(3)P2z受体的抑制剂OxATP和钙调节蛋白激酶抑制剂KN-62可完全阻止诱导剂诱导的细胞凋亡的诱导。结论 P2z受体在介导由ATP诱导CLL细胞凋亡的过程中起着十分重要的作用。
, http://www.100md.com
Apoptosis of leukemic lymphocytes mediated by purinergic P2z receptors Peng Liming* , CJ Bradley, J S Wiley. *Department of Laboratory Medicine, School of Medicine, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041. * Department of Haematology, Austin Hospital, University of Melbourne, Heidelberg, Victoria 3084, Australia
【Abstract】 Objective To investigate the role of purinergic P2z receptors for apoptosis of human leukemic lymphocytes induced by extracellular adenosine triphosphate (ATP). Methods A total of 11 B-CLL patients were studied with regard to exposure of leukemic lymphocytes with (n=8) or without (n=3) P2z receptors to ATP, benzoylbenzoic-ATP (BzATP), 2-methylthio-ATP (2MeSATP), adenosine-5′-[γ-thio] triphosphate (ATP-γS), and other nucleosides for 8 h in vitro. Apoptosis was detected by electron microscopy (EM), agarose gel electrophoresis, and quantitative assay-TdT assay. Results Apoptosis was detected only in leukemic lymphocytes with P2z receptors. Using a quantitative assay, we found that ATP-induced DNA strand breaks occur specifically with BzATP, ATP and 2MeSATP, but not for analogue ATP-γS nor other nucleosides. Meanwhile, ATP-induced DNA fragmentation was fully blocked by pretreatment with oxidized ATP (OxATP), a compound recently shown to block P2z receptors. Also, the Ca2+/calmodulin complex played a role in the regulation of the apoptosis induced by ATP on CLL cells, because an antagonist of this complex, 1-[N,O-bis (5-isoquinolinesulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenylpiperazine (KN-62) was found to inhibit the ATP-induced apoptosis. Conclusion These data indicate that P2z receptors on lymphocytes play an important role in apoptosis induced by ATP in vitro.
, 百拇医药
【Key words】 Receptors, purinergic P2z Leukemia Apoptosis
(Natl Med J China, 1998, 78：508-511)
现已证实，P2z受体作为一类嘌呤能受体，在免疫与造血系统起源的细胞，尤其是在部分慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞膜上呈高表达，但其功能仍不清楚[1，2]。我们以P2z受体的激活剂三磷酸腺苷(ATP)、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)等与抑制剂氧化型ATP(OxATP)作用于表达P2z受体[P2z(+)]与不含P2z受体[P2z(-)]的CLL细胞，并采用电镜、DNA凝胶电泳、脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的α32PdCTP定量标记DNA 3′-羟基末端(TdT法)技术检测细胞凋亡，对P2z受体在介导细胞凋亡中的作用进行观察。
对象与方法
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一、对象
11例CLL患者系澳大利亚墨尔本大学医学院Austin医院患者，经外周血、骨髓确诊，男7例，女4例，平均年龄67.5岁(52～76岁)，患者在外周血采集前处于未接受化疗的相对稳定期。
二、方法
1.材料：ATP、γ-硫代ATP(ATP-γS)、2-甲基硫ATP(2MeSATP)、OxATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)及三磷酸尿苷(UTP)购自美国Sigma公司；1-[N，O-二(5-异喹啉磺酰基)N-甲基-L-酪氨酰]-4-苯哌嗪(KN-62)为Res Biochemical产品；葡萄糖-泛影葡胺(Ficoll-Paque)、TdT、三磷酸双脱氧胞苷(ddCTP)。
2.P2z受体的鉴定：CLL患者外周血用肝素抗凝，Ficoll-Paque新鲜分离的淋巴细胞，用荧光计(美国Johnson Foundation Co公司产品)(激发波长为340 nm，发射波长为500 nm)在暗室内检测通过ATP作用CLL细胞膜P2z受体的阳离子通道，分析荧光染料呋喃-2-乙酰甲酯(fura-2)随二价阳离子(Ba2+)进入细胞量的有无以判断P2z受体的表达状态。P2z(+)(8例)与P2z(-)(3例)细胞均为我们经系统实验研究并证实的B-CLL患者血标本[2，3]。
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3.细胞培养：将新鲜分离的P2z(+)或P2z(-)细胞悬浮于含40 mg/ml庆大霉素，2 mmol/L谷氨酰氨，10%灭活小牛血清的PRMI 1 640液中，细胞浓度1×107/ml，并加入新鲜配制1.0 mmol/L的ATP或其他核苷，置37℃，5% CO2饱和湿度培养，取0、2、4及8小时细胞进行动态观察。
4.透射电镜标本制备：培养细胞离心，使用PBS洗2次后，用2.5%戊二醛于4℃冰箱固定30分钟，常规电镜脱水、包埋、超薄切片、双铅染色。
5.DNA抽提和凝胶电泳[4]：DNA抽提按标准的酚、氯仿、异戊醇法进行抽提。凝胶电泳时，取约1μg DNA样品，在TBE电极缓冲液中，1%琼脂糖凝胶上，5.0 v/cm电泳3小时，EB染色，在紫外线发射仪上观察并照相。
6.TdT法定量检测DNA 3′-羟基末端：标记量采用我们已建立的TdT法[4，5]。
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7.统计学处理：采用微机分析，结果以
±s表示，两组间比较用t检验，相关性用线性回归分析。
结 果
1.形态学检查：P2z(+)细胞经1.0 mmol/L ATP作用8小时后，在电镜下呈现典型凋亡细胞特征[6]，包括细胞与核体积缩小，染色质浓缩致密，有新月体状核形成，细胞膜上的微绒毛消失等(图1)。然而，P2z(-)细胞经同样处理后，却无凋亡细胞出现(图2)。同时，P2z受体特异的抑制剂OxATP(≥0.6 mmol/L)可有效阻止凋亡细胞的产生；而且，根据电镜下凋亡细胞的形态学标准[6，7]，采用双盲法，计数ATP作用不同时间的细胞300～500个。经1.0 mmol/L ATP作用P2z(+)细胞0、2、4及8小时的凋亡细胞分别是0.20%、0.62%、2.3%及7.5%；线性回归分析结果表明，凋亡细胞与ATP孵育时间呈良好线性关系(r=0.99)。
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图1 经ATP处理的P2z(+)细胞 箭头所指为凋亡细胞 ×2 000
图2 经ATP处理的P2z(-)细胞 ×2 000
2.DNA凝胶电泳：P2z(+)细胞与1.0 mmol/L ATP、BzATP、2MeSATP分别作用8小时，均出现特有的DNA梯形条带，但是ATP-γS、ADP、AMP、CTP、GTP、TTP以同样的方式作用后，均无DNA梯形带。同时，将0.6 mmol/L OxATP 37℃1小时或1.0 μmol/L KN-62 37℃ 5分钟预处理的P2z(+)细胞再与1.0 mmol/L ATP作用8小时，仍无DNA梯形带出现。而且，P2z(-)细胞用同样的方式作用后，也没有DNA梯形带出现(图3)，同电镜结果一致。
3.DNA降解末端定量：以TdT法测定P2z(+)细胞经过0、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L，ATP作用不同时间的DNA末端标记量。结果表明，DNA末端标记量与ATP浓度大小和作用时间长短呈密切正相关(r=0.98)。将P2z(-)与P2z(+)细胞以同样方式处理，显示P2z(+)细胞DNA末端标记量明显高于P2z(-)细胞(P<0.05)；尤其当ATP浓度≥1.0 mmol/L时差别更为明显(P<0.01)(图4)。虽然，P2z(-)细胞DNA末端标记量亦随ATP浓度增加而呈增高趋势，但与未加ATP的对照细胞比较，差异无显著意义(P>0.1)。
, 百拇医药
M.分子量标记；1～9分别为P2z(+)细胞经1.0 mmol/L的下
列物质处理：ATP，BzATP，2MeSATP, ATP-γS, ADP, AMP，CTP，GTP，TTP；10.ATP处理的P2z(-)细胞；11.先经0.6 mmol/L OxATP处理后
加ATP的P2z(+)细胞；12.先经1.0 μmol/L KN-62处理后加ATP的
P2z(+)细胞；13.未经ATP处理的阴性对照
图3 DNA琼脂糖电泳谱
图4 不同浓度ATP作用于P2z(+)与P2z(-)细胞DNA-3′
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羟基末端标记量的变化
4.其他核苷对P2z(+)细胞的影响：用P2z受体的激活剂-BzATP、ATP、2MeSATP、ATP-γS和各种核苷及ATP的同分异构体1.0 mmol/L作用于P2z(+)细胞8小时，TdT法测定结果显示，诱导DNA降解的强弱顺序BzATP>ATP>2MeSATP>ATP-γS，cpm*μgDNA-1*h-1分别是102 744、49 330、40 263、4 548。而经ADP、AMP、CTP、GTP、TTP处理的细胞与未经任何处理的对照(495 cpm*μg DNA-1*h-1)差异无显著意义(P>0.1)。这与我们对P2z受体激活剂能力顺序的研究相一致[3]。
5.OxATP的抑制效应：将P2z(+)细胞用P2z受体不可逆抑制剂OxATP[8](0、0.15、0.3、0.6及1.2 mmol/L)作用60分钟，洗2次，再与1.0 mmol/L ATP培养8小时。TdT法测定结果表明，OxATP对ATP诱导DNA降解的抑制率分别为11%、38%、65%和97%，cpm*μg DNA-1*h-1分别是43 417、38 934、27 317、15 584、1 629；然而，单经1.2 mmol/L OxATP处理细胞的DNA末端标记量与对照差异无显著意义(P>0.2)，同电镜、DNA凝胶电泳的观察一致。
, 百拇医药
6.KN-62的抑制效应：P2z(+)细胞分别与0.01、0.05、0.1、0.5、1.0及2.0 μmol/L KN-62 37℃作用15分钟，再与1.0 mmol/L ATP孵育8小时。TdT法定量结果显示，KN-62对ATP经P2z受体诱导DNA降解的抑制率在0.1 μmol/L时为35%，2.0 μmol/L时达97%；而单纯KN-62(2.0 μmol/L)对同样细胞不具有毒性作用。
讨 论
电镜观察与梯状DNA是目前鉴定细胞凋亡最特异的指标[6，7]。我们通过表达P2z受体的CLL细胞能介导由ATP诱导的细胞凋亡并出现其特征性变化；P2z受体的抑制剂可特异阻断经其介导的细胞凋亡发生；参与P2z受体介导细胞凋亡的激活剂与激活P2z受体的激活剂完全一致[3]，证实了P2z受体在介导细胞凋亡过程中具有特殊作用。
我们的研究表明，P2z受体是一种可与配体结合形成的阳离子通道，其激活剂与抑制剂同P2y和P2x显著不同，在造血与免疫系统属起源细胞，尤其是在部分CLL细胞上呈唯一表达，而不表达于正常人淋巴细胞，这对其功能的研究无疑具有独特优点[2，3]。有研究显示[9]，ATP可通过大鼠巨噬细胞、胸腺细胞的P2z受体引起细胞死亡，与本文实验结果一致，这不仅对P2z受体而且对表达P2z受体的CLL治疗的研究将起到积极的推动作用。
, 百拇医药
ATP经P2z受体诱导细胞凋亡的机理仍不清楚。本文通过钙调节蛋白激酶抑制剂KN-62对P2z受体介导细胞凋亡的抑制效应，提示钙调节蛋白可能参与该细胞凋亡的发生。同时，本结果还表明，当温度<10℃，细胞凋亡的诱导反应将完全终止；另外，1.0 mmol/L Zn2+(ZnSO4)可完全抑制经P2z受体介导的细胞凋亡，表明ATP通过P2z受体诱导的细胞凋亡可能与核酸酶等酶的参与有关，其机理仍待进一步阐明。
参考文献
1 Dubyak GR, El-Moatassim C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am J Physiol, 1993, 265:C577-C606.
, http://www.100md.com 2 Wiley JS, Dubyak GR. Extracellular adenosine triphosphate increases cation permeability of chronic lymphocytic leukemic lymphocytes. Blood, 1989, 73:1316-1323.
3 Wiley JS, Chen JR, Snook MB, et al. The P2z-purinoceptor of human lymphocytes: actions of nucleotide agonists and irreversible inhibition by oxidised ATP. Br J Pharmacol, 1994, 112:946-950.
4 Liming P, James L. A novel method for quantitative analysis of apoptosis. Lab Invest, 1997, 77:547-555.
, 百拇医药
5 彭黎明，Mike B, Pam S, 等.用α-32PdCTP标记断裂DNA检测DNA降解程度.中华核医学杂志，1997，17：62-63.
6 彭黎明.细胞凋亡检测的研究进展.中华医学检验杂志，1996，19：336-338.
7 Kerry JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis. Cancer, 1994, 73:2013-2026.
8 Murgia M, Hanau S, Pizzo P, et al. Oxidised ATP. An irreversible inhibitor of the macrophage purinergic P2Z receptor. J Biol Chem, 1993, 268:8199-8203.
9 Tokumitsu H, Chijiwa T, Hagiwara M, et al. KN-62, 1-[N,O-bis(5-isoquinolinesulfonyl)-N methy-L-tyrosyl]-4-phenylpiperazine, a specific inhibitor of Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ. J Biol Chem, 1990, 265:4315-4320.
(收稿：1997-09-24 修回：1998-04-08), 百拇医药
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院医学检验专业(彭黎明)；澳大利亚墨尔本大学Austin医院血液科(CJ Bradely, JS Wiley)
关键词：受体，嘌呤能P2z；白血病；脱噬作用
中华医学杂志980709 【摘要】 目的 探讨嘌呤能P2z受体在介导慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡中的作用。方法 将表达P2z受体[P2z(+)]与不含P2z受体[P2z(-)]两组CLL细胞分别同1.0 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)体外培养8小时，以电镜、DNA凝胶电泳和定量DNA 3′-末端的TdT法检测细胞凋亡；并对ATP、BzATP、2MeSATP、ATP-γS与其他核苷的诱导及OxATP、KN-62的抑制效应做定量研究。结果 (1)P2z(+)细胞能在ATP诱导下呈现典型的细胞凋亡形态和DNA梯状条带；(2)不同的P2z受体激活剂可通过P2z受体诱导细胞凋亡并产生不同量的DNA降解片段，诱导能力的强弱顺序是BzATP>ATP>2MeSATP，而ATP-γS或其他核苷几乎无诱导能力；(3)P2z受体的抑制剂OxATP和钙调节蛋白激酶抑制剂KN-62可完全阻止诱导剂诱导的细胞凋亡的诱导。结论 P2z受体在介导由ATP诱导CLL细胞凋亡的过程中起着十分重要的作用。
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Apoptosis of leukemic lymphocytes mediated by purinergic P2z receptors Peng Liming* , CJ Bradley, J S Wiley. *Department of Laboratory Medicine, School of Medicine, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041. * Department of Haematology, Austin Hospital, University of Melbourne, Heidelberg, Victoria 3084, Australia
【Abstract】 Objective To investigate the role of purinergic P2z receptors for apoptosis of human leukemic lymphocytes induced by extracellular adenosine triphosphate (ATP). Methods A total of 11 B-CLL patients were studied with regard to exposure of leukemic lymphocytes with (n=8) or without (n=3) P2z receptors to ATP, benzoylbenzoic-ATP (BzATP), 2-methylthio-ATP (2MeSATP), adenosine-5′-[γ-thio] triphosphate (ATP-γS), and other nucleosides for 8 h in vitro. Apoptosis was detected by electron microscopy (EM), agarose gel electrophoresis, and quantitative assay-TdT assay. Results Apoptosis was detected only in leukemic lymphocytes with P2z receptors. Using a quantitative assay, we found that ATP-induced DNA strand breaks occur specifically with BzATP, ATP and 2MeSATP, but not for analogue ATP-γS nor other nucleosides. Meanwhile, ATP-induced DNA fragmentation was fully blocked by pretreatment with oxidized ATP (OxATP), a compound recently shown to block P2z receptors. Also, the Ca2+/calmodulin complex played a role in the regulation of the apoptosis induced by ATP on CLL cells, because an antagonist of this complex, 1-[N,O-bis (5-isoquinolinesulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenylpiperazine (KN-62) was found to inhibit the ATP-induced apoptosis. Conclusion These data indicate that P2z receptors on lymphocytes play an important role in apoptosis induced by ATP in vitro.
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【Key words】 Receptors, purinergic P2z Leukemia Apoptosis
(Natl Med J China, 1998, 78：508-511)
现已证实，P2z受体作为一类嘌呤能受体，在免疫与造血系统起源的细胞，尤其是在部分慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞膜上呈高表达，但其功能仍不清楚[1，2]。我们以P2z受体的激活剂三磷酸腺苷(ATP)、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)等与抑制剂氧化型ATP(OxATP)作用于表达P2z受体[P2z(+)]与不含P2z受体[P2z(-)]的CLL细胞，并采用电镜、DNA凝胶电泳、脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的α32PdCTP定量标记DNA 3′-羟基末端(TdT法)技术检测细胞凋亡，对P2z受体在介导细胞凋亡中的作用进行观察。
对象与方法
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一、对象
11例CLL患者系澳大利亚墨尔本大学医学院Austin医院患者，经外周血、骨髓确诊，男7例，女4例，平均年龄67.5岁(52～76岁)，患者在外周血采集前处于未接受化疗的相对稳定期。
二、方法
1.材料：ATP、γ-硫代ATP(ATP-γS)、2-甲基硫ATP(2MeSATP)、OxATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)及三磷酸尿苷(UTP)购自美国Sigma公司；1-[N，O-二(5-异喹啉磺酰基)N-甲基-L-酪氨酰]-4-苯哌嗪(KN-62)为Res Biochemical产品；葡萄糖-泛影葡胺(Ficoll-Paque)、TdT、三磷酸双脱氧胞苷(ddCTP)。
2.P2z受体的鉴定：CLL患者外周血用肝素抗凝，Ficoll-Paque新鲜分离的淋巴细胞，用荧光计(美国Johnson Foundation Co公司产品)(激发波长为340 nm，发射波长为500 nm)在暗室内检测通过ATP作用CLL细胞膜P2z受体的阳离子通道，分析荧光染料呋喃-2-乙酰甲酯(fura-2)随二价阳离子(Ba2+)进入细胞量的有无以判断P2z受体的表达状态。P2z(+)(8例)与P2z(-)(3例)细胞均为我们经系统实验研究并证实的B-CLL患者血标本[2，3]。
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3.细胞培养：将新鲜分离的P2z(+)或P2z(-)细胞悬浮于含40 mg/ml庆大霉素，2 mmol/L谷氨酰氨，10%灭活小牛血清的PRMI 1 640液中，细胞浓度1×107/ml，并加入新鲜配制1.0 mmol/L的ATP或其他核苷，置37℃，5% CO2饱和湿度培养，取0、2、4及8小时细胞进行动态观察。
4.透射电镜标本制备：培养细胞离心，使用PBS洗2次后，用2.5%戊二醛于4℃冰箱固定30分钟，常规电镜脱水、包埋、超薄切片、双铅染色。
5.DNA抽提和凝胶电泳[4]：DNA抽提按标准的酚、氯仿、异戊醇法进行抽提。凝胶电泳时，取约1μg DNA样品，在TBE电极缓冲液中，1%琼脂糖凝胶上，5.0 v/cm电泳3小时，EB染色，在紫外线发射仪上观察并照相。
6.TdT法定量检测DNA 3′-羟基末端：标记量采用我们已建立的TdT法[4，5]。
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7.统计学处理：采用微机分析，结果以
±s表示，两组间比较用t检验，相关性用线性回归分析。结 果
1.形态学检查：P2z(+)细胞经1.0 mmol/L ATP作用8小时后，在电镜下呈现典型凋亡细胞特征[6]，包括细胞与核体积缩小，染色质浓缩致密，有新月体状核形成，细胞膜上的微绒毛消失等(图1)。然而，P2z(-)细胞经同样处理后，却无凋亡细胞出现(图2)。同时，P2z受体特异的抑制剂OxATP(≥0.6 mmol/L)可有效阻止凋亡细胞的产生；而且，根据电镜下凋亡细胞的形态学标准[6，7]，采用双盲法，计数ATP作用不同时间的细胞300～500个。经1.0 mmol/L ATP作用P2z(+)细胞0、2、4及8小时的凋亡细胞分别是0.20%、0.62%、2.3%及7.5%；线性回归分析结果表明，凋亡细胞与ATP孵育时间呈良好线性关系(r=0.99)。
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图1 经ATP处理的P2z(+)细胞 箭头所指为凋亡细胞 ×2 000
图2 经ATP处理的P2z(-)细胞 ×2 000
2.DNA凝胶电泳：P2z(+)细胞与1.0 mmol/L ATP、BzATP、2MeSATP分别作用8小时，均出现特有的DNA梯形条带，但是ATP-γS、ADP、AMP、CTP、GTP、TTP以同样的方式作用后，均无DNA梯形带。同时，将0.6 mmol/L OxATP 37℃1小时或1.0 μmol/L KN-62 37℃ 5分钟预处理的P2z(+)细胞再与1.0 mmol/L ATP作用8小时，仍无DNA梯形带出现。而且，P2z(-)细胞用同样的方式作用后，也没有DNA梯形带出现(图3)，同电镜结果一致。
3.DNA降解末端定量：以TdT法测定P2z(+)细胞经过0、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L，ATP作用不同时间的DNA末端标记量。结果表明，DNA末端标记量与ATP浓度大小和作用时间长短呈密切正相关(r=0.98)。将P2z(-)与P2z(+)细胞以同样方式处理，显示P2z(+)细胞DNA末端标记量明显高于P2z(-)细胞(P<0.05)；尤其当ATP浓度≥1.0 mmol/L时差别更为明显(P<0.01)(图4)。虽然，P2z(-)细胞DNA末端标记量亦随ATP浓度增加而呈增高趋势，但与未加ATP的对照细胞比较，差异无显著意义(P>0.1)。
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M.分子量标记；1～9分别为P2z(+)细胞经1.0 mmol/L的下
列物质处理：ATP，BzATP，2MeSATP, ATP-γS, ADP, AMP，CTP，GTP，TTP；10.ATP处理的P2z(-)细胞；11.先经0.6 mmol/L OxATP处理后
加ATP的P2z(+)细胞；12.先经1.0 μmol/L KN-62处理后加ATP的
P2z(+)细胞；13.未经ATP处理的阴性对照
图3 DNA琼脂糖电泳谱
图4 不同浓度ATP作用于P2z(+)与P2z(-)细胞DNA-3′
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羟基末端标记量的变化
4.其他核苷对P2z(+)细胞的影响：用P2z受体的激活剂-BzATP、ATP、2MeSATP、ATP-γS和各种核苷及ATP的同分异构体1.0 mmol/L作用于P2z(+)细胞8小时，TdT法测定结果显示，诱导DNA降解的强弱顺序BzATP>ATP>2MeSATP>ATP-γS，cpm*μgDNA-1*h-1分别是102 744、49 330、40 263、4 548。而经ADP、AMP、CTP、GTP、TTP处理的细胞与未经任何处理的对照(495 cpm*μg DNA-1*h-1)差异无显著意义(P>0.1)。这与我们对P2z受体激活剂能力顺序的研究相一致[3]。
5.OxATP的抑制效应：将P2z(+)细胞用P2z受体不可逆抑制剂OxATP[8](0、0.15、0.3、0.6及1.2 mmol/L)作用60分钟，洗2次，再与1.0 mmol/L ATP培养8小时。TdT法测定结果表明，OxATP对ATP诱导DNA降解的抑制率分别为11%、38%、65%和97%，cpm*μg DNA-1*h-1分别是43 417、38 934、27 317、15 584、1 629；然而，单经1.2 mmol/L OxATP处理细胞的DNA末端标记量与对照差异无显著意义(P>0.2)，同电镜、DNA凝胶电泳的观察一致。
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6.KN-62的抑制效应：P2z(+)细胞分别与0.01、0.05、0.1、0.5、1.0及2.0 μmol/L KN-62 37℃作用15分钟，再与1.0 mmol/L ATP孵育8小时。TdT法定量结果显示，KN-62对ATP经P2z受体诱导DNA降解的抑制率在0.1 μmol/L时为35%，2.0 μmol/L时达97%；而单纯KN-62(2.0 μmol/L)对同样细胞不具有毒性作用。
讨 论
电镜观察与梯状DNA是目前鉴定细胞凋亡最特异的指标[6，7]。我们通过表达P2z受体的CLL细胞能介导由ATP诱导的细胞凋亡并出现其特征性变化；P2z受体的抑制剂可特异阻断经其介导的细胞凋亡发生；参与P2z受体介导细胞凋亡的激活剂与激活P2z受体的激活剂完全一致[3]，证实了P2z受体在介导细胞凋亡过程中具有特殊作用。
我们的研究表明，P2z受体是一种可与配体结合形成的阳离子通道，其激活剂与抑制剂同P2y和P2x显著不同，在造血与免疫系统属起源细胞，尤其是在部分CLL细胞上呈唯一表达，而不表达于正常人淋巴细胞，这对其功能的研究无疑具有独特优点[2，3]。有研究显示[9]，ATP可通过大鼠巨噬细胞、胸腺细胞的P2z受体引起细胞死亡，与本文实验结果一致，这不仅对P2z受体而且对表达P2z受体的CLL治疗的研究将起到积极的推动作用。
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ATP经P2z受体诱导细胞凋亡的机理仍不清楚。本文通过钙调节蛋白激酶抑制剂KN-62对P2z受体介导细胞凋亡的抑制效应，提示钙调节蛋白可能参与该细胞凋亡的发生。同时，本结果还表明，当温度<10℃，细胞凋亡的诱导反应将完全终止；另外，1.0 mmol/L Zn2+(ZnSO4)可完全抑制经P2z受体介导的细胞凋亡，表明ATP通过P2z受体诱导的细胞凋亡可能与核酸酶等酶的参与有关，其机理仍待进一步阐明。
参考文献
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(收稿：1997-09-24 修回：1998-04-08), 百拇医药